HBsAg在不同真核表达载体中的表达

目的建立ＨＢｓＡｇ及其变异体的高效真核表达系统。方法从已构建的ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋－ＨＢｓ系列突变重组体获取ＨＢＶ－Ｓ基因片段,将其亚克隆到真核表达载体ｐＭＥＰ４,ｐＣＥＰ４,ｐＬＸＳＮ,ＰＸＴ１及ｐｃＤＮＡ３,从而构建了含ＨＢＶ－Ｓ基因及其突变型的一系列表达载体,并将其转染（或感染）人肝癌细胞系ＨｅｐＧｅ２。结果获得稳定分泌ＨＢｓＡｇＲ其突变体的抗性细胞系。结论各组真核表达载体皆能表达ＨＢｓＡｇ及其突变体,但在转染率、表达量及稳定性上存在差异。选择其中的高效、准确表达系统,将为ＨＢｓＡｇ变异株生物学性状的深入研究及进一步基因治疗、基因免疫的研究提供有用的工具。     

乙型肝炎病毒C基因变屉对人白细胞抗原表达的影响

目的 阐明我国常见的ＨＢＶ／Ｃ变异对宿主细胞人类白细胞抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＬＡ）表达的影响。方法 构建携带野生型和变异型ＨＢＶ／Ｃ基因的真核细胞表达载体，转染ＨｅｐＧ２细胞，鉴定目的基因在宿主细胞中的表达，检测ＨＬＡ－１，ＨＬＡ－ＤＲ在宿主细胞膜上的表达。结果 ＰＣＲ和Ｗｃｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析能分别检测到目的ＤＮＡ片段和ＨＢｃＡｇ的表达，约１００％的ＨｅｐＧ     

血清HBeAg阴性与HBeAg/IC及A1896变异的关系

目的探讨血清ＨＢｅＡｇ阴性（双抗体夹心法）与ＨＢｅＡｇ／ＩＣ形成及ＨＢＶ变异株Ａ１８９６的关系，评价ＨＢｅＡｇ／ＩＣ检测的临床意义．方法单克隆抗ＨＢｅ固相ＥＬＩＳＡ检测血清中ＨＢｅＡｇ／ＩＣ；套式多聚酶链反应检测ＨＢＶＤＮＡ；３＇碱基特异多聚酶链反应判断Ａ１８９６变异；ＥＬＩＳＡ检测ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢｅ，研究对象为１１７例慢性ＨＢＶ感染者，２０例健康对照统计处理采用卡方检验．结果ＨＢｅＡｇ／ＩＣ阳性血清中ＨＢＶＤＮＡ检出率明显高于ＨＢｅＡｇ／ＩＣ阴性血清，Ｐ＜０００１（９１３％ｖｓ３６２％）；２９份ＨＢｅＡｇ阴性、ＨＢＶＤＮＡ阳性血清中仅５例（１７２％）检出Ａ１８９６，而且其中２例与野毒株（Ｇ１８９６）混合感染并伴ＨＢｅＡｇ／ＩＣ阳性．２９份中１７份（５８７％）为ＨＢｅＡｇ／ＩＣ阳性的Ｇ１８９６感染；血清抗ＨＢｅ阳性组Ａ１８９６检出率高于抗ＨＢｅ阴性组，Ｐ＜００５（２５％ｖｓ３２％）．结论ＨＢｅＡｇ／ＩＣ为ＨＢＶ活跃复制指标；临床ＨＢｅＡｇ阴性、ＨＢＶＤＮＡ阳性患者仍多数为Ｇ１８９６感染，ＨＢｅＡｇ／ＩＣ形致双抗体夹心法不能检出ＨＢｅＡｇ；抗ＨＢｅ应答可能为促使前Ｃ变异的重要因素     

特异性乙型肝炎病毒X基因反义核酸体外抗病毒作用

为了观察互补于乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｘ基因的三段硫代反义核酸（ＡＳＯＮ）体外抗病毒作用，采用ＥＬＩＳＡ和ＰＡＰ－ＥＬＩＳＡ法检测ＡＳＯＮ作用前后２，２，１５细胞上清中乙型肝炎病毒表面抗原、ｅ抗原及Ｘ抗原（ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｘＡｇ）含量变化及细胞原位杂交检测细胞内ＨＢＶＤＮＡ含量变化。结果表明，三段ＡＳＯＮ均可抑制ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ和ＨＢｘＡｇ的表达，其抑制率分别为８０．６５％、６２．７６％和７８．０７％；细胞内ＨＢＶＤＮＡ也明显减少。据此认为，ＨＢｘＡｇ表达量下降可能系ＡＳＯＮ序列特异性封闭作用所致，而ＨＢ－ｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ表达量以及ＨＢＶＤＮＡ含量降低，可能是通过ＨＢｘＡｇ对ＨＢＶＤＮＡ启动子的反式激活功能降低而实现的。     

乙型肝炎病毒核心启动子部分缺失真核表达载体的构建及对病毒抗原表达的影响

乙型肝炎病毒核心启动子 (ＣＰ)部分缺失变异已证实在几种ＨＢＶ感染的临床现象中存在[1 3 ] 。我们在一组 14例血清抗 ＨＢｅ阳性的无症状携带者中 ,发现有 9例在ｎｔ174 8(或ｎｔ174 7)至ｎｔ176 7间 2 0 (或 2 1)个核苷酸的缺失 ,此 9例中有 5例合并有ｎｔ1896Ｇ→Ａ点变异[4] 。本研究在此基础上 ,拟构建这种ＣＰ 2 0 / 2 1ｂｐ缺失及合并存在Ａ1896点变异的ＨＢＶ全基因重组真核表达载体 ,并转染ＨｅｐＧ2细胞 ,以研究此类变异株对病毒抗原表达的影响。一、材料与方法1 材料 :ＥＢＯ ｐｐｌｐ质粒由美国Ｓｃｒｉｐｐｓ研究所Ｆｒａｎ…     

乙型肝炎病毒X基因的表达产物对HLA-DR表达的效应

为了解ＨＢＶＸ基因表达产物对ＨＬＡ ＤＲ表达的效应 ,构建带Ｘ基因的重组表达载体 ,研究其在体外肝癌细胞中的表达及其对ＨＬＡ ＤＲ表达的影响。用野生型ＨＢＶＸ基因与真核载体质粒构建重组表达载体质粒 ｐＷＨＸⅡ转染ＨｅｐＧ2细胞。用ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈ ｅｒｎ印迹、ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹等分析鉴定目的基因ＤＮＡ片段与其在转染细胞中的表达产物ＨＢＶＸ蛋白。将带重组质粒 ｐＷＨＸⅡ的ＨｅｐＧ2细胞和带有ＨＢＶ全基因组的 2 .2 .15细胞 ,在相同条件下用间接免疫荧光分析和免疫酶细胞化学技术检测 ,均清晰地显示在肝细…     

HBsAg及B_(7-2)抗原重组腺病毒载体感染免疫研究

目的　为激发机体对ＨＢｓＡｇ的ＣＴＬ反应，寻求对慢性乙型肝炎更有效的治疗方法。方法　构建了共表达ＨＢＳＡｇ及Ｂ７－２抗原的Ｅ１区插入重组腺病毒载体，用脂质体法转染２９３细胞，经空斑筛选表达目的抗原的重组腺病毒，用ＥＬＩＳＡ法及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法分别检测ＨＢｓＡｇ及Ｂ７－２抗原表达。在２９３细胞中扩增，再纯化、浓缩后，体内感染Ｃ５７小鼠，检测体液免疫反应和细胞免疫反应。结果　重组腺病毒在体外培养的２９３细胞及ＨｅｐＧ２细胞中高效表达ＨＢＳＡｇ及Ｂ７－２抗原。感染小鼠体液免疫较弱，但可通过注射乙型肝炎疫苗而加强；重组腺病毒载体能诱导强而有效的细胞免疫反应；未观察到明显毒副作用。结论　ＨＢｓＡｇ及Ｂ７－２抗原重组腺病毒载体体外感染２９３、ＨｅｐＧ２细胞后高效表达目的抗原，感染免疫局诱导有效的细胞免疫反应。初步结果显示腺病毒载体是一种高效、安全的载体系统。     

乙型肝炎病毒S基因重组逆转录病毒载体的构建及其在真核细胞中表达

目的 探索逆转录病毒载体在基因治疗中的应用。方法 用ＤＮＡ重组技术构建ＨＢＶ－Ｓ基因重组逆转录病毒载体,电穿孔转染ＰＡ３１７后,筛选高表达克隆,用假病毒颗粒感染ＨｅｐＧ２、Ｐ８１５和ＥＬ４细胞,分别用ＲＴ－ＰＣＲ及ＥＬＩＳＡ法检测目的基因表达。结果 ＨＢｓＡｇ在上述细胞中获得不同程度的表达,细胞上清液（４８ｈ）中ＨＢｓＡｇ含量（吸光度值）分别为０．９２、０．０９和０．４７。结论 逆转录病毒用载体,     

含日本血吸虫脂肪酸结合蛋白（SjFABPc）基因DNA重组质粒 …

目的 观察裸ＤＮＡ重组质粒ｐＣＤ－ＳｊＦＡＢＰｃ在体外转染ＨｅｐＧ２细胞以及质粒ＤＮＡ免疫鼠肌组织中的表达，为进一步应用该质粒进行ＤＮＡ免疫实验奠定基础。方法 用脂质体介导ＤＮＡ转染法将ｐＣＤ－ＳｊＦＡＢＰｃ转染贴壁细胞ＨｅｐＧ２，Ｇ４１８加压筛选获得阳性克隆细胞并传代培养，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定目的基因在ＨｅｐＧ２细胞中的表达，将ｐＣＤ－ＳｊＦＡＢＰｃ质粒肌注免疫ＢＡＬＢ     

反义乙肝病毒S基因真核载体构建及体外抗乙肝病毒作用

目的：探讨反义ＲＮＡ抗乙肝病毒（ＨＢＶ）作用。方法：构建了正，反义ＨＢＶＳ基因重组ＥＢ病毒载体ｐＭＥＰ４ｓ，ｐＭＥＰ４Ｓａｓ，ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀法将重组载体ＤＮＡ转染２．２．１５细胞，潮霉素筛选１个月得到抗性细胞克隆，ＥＬＩＳＡ，斑点杂交法分别检测抗性细胞上清ＨＢｓＡｇ，ＨＢｅＡｇＨＢＶＤＮＡ水平，结果：转染后１，２月，反义载体ＨＢｓＡｇ，ＨＢｅＡｇ的抑制率分别达７５％，５１．６％，７０％，４６     

不同基因区反义寡核苷酸抑制乙型肝炎病毒基因表达的比较

目的探讨反义寡核苷酸（ＡＳＯＮ）特异性抗病毒作用。方法在ＨｅｐＧ２２．２．１５细胞中观察了４段１６聚针对乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因不同功能区的ＡＳＯＮ对病毒复制的抑制作用。结果ＡＳＯＮ能显著抑制ＨＢＶ基因的抗原表达（Ｐ＜０．００１），在Ｓ基因区设计的ＡＳＯＮ对ＨＢｓＡｇ的抑制作用明显优于Ｃ基因区的ＡＳＯＮ（Ｐ＜０．０５）。反之，在Ｃ基因区设计的ＡＳＯＮ对ＨＢｅＡｇ的抑制作用又明显优于Ｓ和Ｐｒｅ－Ｓ２基因区的ＡＳＯＮ（Ｐ＜０．０１）。４段ＡＳＯＮ的联合用药并不能增强其对ＨＢＶ的抑制作用。结论ＡＳＯＮ可能成为一种有开发潜力的抗病毒药物。     

核酶对人HCC细胞内HBeAg的抑制作用

目的观察针对ＨＢＶＣ区双位点核酶对ＨＢｅＡｇ在细胞内表达的抑制作用．方法利用亚克隆技术,从质粒ｐＧＥＭＲｚ１２３切下ＥｃｏＲⅠＢａｍＨⅠ片段,双粘端克隆于真核表达质粒ｐＢＢＳ２１２中,将该质粒与ｐ１．２Ⅱ（含ＨＢＶ全序列）,共转染人ＨＣＣ细胞（人肝癌细胞株）,观察该核酶在细胞内对ＨＢｅＡｇ合成的抑制作用．结果在人ＨＣＣ细胞中ｐ１．２Ⅱ可表达出ＨＢｅＡｇ;该核酶对ＨＢｅＡｇ的合成抑制率达６５％．结论该双位点核酶可能通过针对ＨＢＶＣ区基因的剪切作用,阻断Ｃ区基因的表达,抑制了ＨＢｅＡｇ的合成     

快速简便筛检乙型肝炎病毒C基因启动子变异的方法及应用

目的明确中国乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｃ基因启动子（ＢＣＰ）区段变异特点及其可能的临床意义。方法应用错配聚合酶链反应限制性片段长度多态性（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）方法，结合核苷酸序列分析，检测１４３例ＨＢｓＡｇ阳性的ＨＢＶ慢性感染者中Ｘ基因／ＢＣＰ区的核苷酸（ｎｔ）１７６２碱基由Ａ→Ｔ和１７６４碱基由Ｇ→Ａ变异。结果在１１４份ＨＢＶＤＮＡ阳性血清中，３７例感染ＢＣＰ变异株，其中３１例为慢性肝炎病例，６例为慢性ＨＢＶ无症状感染者（ＡｓＩ）；其中４１例ＨＢｅＡｇ阳性ＡｓＩ中仅２例检出，１８例ＨＢｅＡｇ阴性ＡｓＩ中也有４例检出。ＨＢｅＡｇ阳性的６５例中，１３例有ＢＣＰ区变异，而ＨＢｅＡｇ阴性的４９例中，２４例有ＢＣＰ区变异（Ｐ＜０．０１）。结论错配ＰＣＲ－ＲＦＬＰ检测这一对点突变，具有快速、简便、适用的优点；ＨＢＶ毒株ＢＣＰ变异可能与肝病变活动有一定关系。     

三螺旋形成寡核苷酸抑制乙型肝炎病毒复制及抗原合成的实验研究

目的 探讨三螺旋形成寡核苷酸抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）作用。方法 针对ＨＢＶ核心启动子ＳＰ１位点,合成２１ｍｅｒ硫代磷酸三螺旋形成寡核苷酸及２１ｍｅｒ无关对照寡核苷酸。采用ＬＥＩＳＡ,斑点杂交法分别检测了经寡核苷酸处理的ＨｅｐＧ２．２．１５细胞及空白对照组细胞培养上清ＨＢｓＡｇ,ＨＢｅＡｇ及ＨＢＶ ＤＮＡ水平。结果 ＴＦＯ２１组２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ及ＨＢＶ ＤＮＡ分泌量明显低于空白对照组。ＴＦ     

HBsAg HBeAg作用PBLs对TCR Vβ基因表达的影响

目的探讨乙肝病毒（ＨＢＶ）与肝癌的相关性．方法取用乙肝疫苗注射３次前后外周血淋巴细胞（ＰＢＬ）；ＨＢＶＤＮＡ转染的ＨｅｐＧ２２２１５株培养上清（ＨＢｓＡｇ，ＨＢｅＡｇ阳性）感染健康人ＰＢＬ后进行ＴＣＲＶβ基因１－２０亚家族表达水平的分析．结果乙肝疫苗注射后及ＨｅｐＧ２２２１５株培养上清感染健康人ＰＢＬ后ＴＣＲＶβ６，１４；Ｖβ６，１５特异性扩增而表达水平显著增高．结论Ｖβ６可能为识别ＨＢＶ抗原或引发免疫应答的基因片段，但Ｖβ１４，１５各自在限制和杀伤功能方面起着重要的作用，这从分子水平上又证明了ＨＢＶ与肝癌的关系     

乙型肝炎病毒X基因在真核细胞中的表达及反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应 (ＰＣＲ)扩增ＨＢＶＸ基因 ,克隆至真核表达载体ｐＶＲ10 12中 ,构建ＨＢＶＸ基因重组表达载体ｐＶＲ10 12 Ｘ。以该质粒转染ＨｅｐＧ2细胞 ,酶联免疫吸附法 (ＥＬＩＳＡ)检测细胞Ｘ蛋白的瞬时表达 ,与报告质粒ｐＳＶ ｌａｃＺ共转染ＨｅｐＧ2细胞 ,用试剂盒法检测β 半乳糖苷酶表达活性。结果质粒 ｐＶＲ10 12 Ｘ在ＨｅｐＧ2细胞瞬时表达Ｘ蛋白 ,共转染实验中ｐＶＲ10 12 Ｘ组β 半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的 3.2倍 ,表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达 ,并能够反式激活ＳＶ4 0早期启动子。乙型肝炎病毒X基因在…     

T_(1762)A_(1762)变异对乙型肝炎病毒C启动子活性影响

国的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｃ基因调节序列存在较多变异,为探讨在诸多变异中,Ｔ１７６２Ａ１７６４变异对Ｃ区启动子（ＣＰ）活性究竟起何作用。方法用克隆及ＰＣＲ产物直接测序,检测Ｔ１７６２Ａ１７６４变异;并将含调节序列的ＰＣＲ产物插入到氯霉素乙酰转移酶（ＣＡＴ）表达质粒中,转染ＨｅｐＧ2细胞并瞬时表达。结果通过比较野生株及变异株在ＣＰ区序列及ＣＡＴ表达水平显示,Ｔ１７６２Ａ１７６４变异在使ＣＡＴ表达下调中起主要作用。结论Ｔ１７６２Ａ１７６４变异在使ＣＰ活性下调中起主要作用。     

丙型肝炎病毒及乙型肝炎病毒联合基因免疫实验研究

为ＨＣＶ/ＨＢＶ重叠或混合感染的防治寻求新的高效联合基因免疫策略 ,分别将与ＨＣＶ核心区基因互补的ｃＤＮＡ和ＨＢＶ核心区基因克隆于具有两套独立表达单元的真核表达载体 ｐＲＳＣ的巨细胞病毒启动子和ＲＳＶ启动子下游 ,称为ｐＲＳＣ ＨＢＶ/ＨＣＶ ,转染ＳＰ2 / 0细胞 ,通过免疫荧光和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法观测蛋白的表达 ,免疫ＢＡＬＢ/ｃ小鼠 ;用酶联免疫法、ＭＴＴ法及荷瘤试验观察小鼠体液免疫应答及细胞免疫应答。结果表明 ,ｐＲＳＣ ＨＢＶ/ＨＣＶ转染ＳＰ2 / 0细胞可见ＨＢｃＡｇ及ＨＣＶ核蛋白染色阳性荧光细胞 ,相对分子质…     

乙型肝炎表面抗原“免疫逃避”突变体在哺乳动物细胞中的表达

利用乙型肝炎病毒ＤＮＡ开放框架上的ＢａｍＨＩ和ＨｐａＩ位点，酶切消化质粒载体ＰＥｃｏｂ６（含双拷贝ＨＢＶＤＮＡ），得到约９００ｂｐ的ＨＢＶ－Ｓ基因片断。将其插入到噬菌粒载体ＰＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｓｋ＋的ＳｍａＩ位点上。然后通过体外寡核苷酸介导的人工定点突变获得一系列（共１２种）Ｓ基因“免疫逃避”突变型。再通过ＥＢ病毒真核表达载体ｐＭＥＰ４上的ＢａｍＨＩ和Ｋｐｎｌ位点将噬菌粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｓｋ＋上的Ｓ基因突变型片断定向克隆到ＰＭＥＰ４上，从而构建了含乙肝Ｓ基因突变型的重组质粒ｐＭＥＰ４ＨＢＳＭ。用其转染人肝癌传代细胞系ＨｅｐＧ２，经潮霉素选择，三周后获得抗性细胞克隆。经用抗ＨＢｓ单克隆抗体（含针对ＨＢｓＡｇ“ａ”抗原决定簇）检测除含变异体１４５（即１４５位上甘氨酸为精氨酸替代）外其余抗变异体ＨＢｓＡｇ均为阳性。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实变异体１４５，在分子量约为２３ＫＤ处有一特异ＨＢｓＡｇ蛋白带。     

庚型肝炎病毒在慢性肝炎肝硬化中致病性及病理特征

探讨ＨＢＶ在慢性肝炎肼硬化当中感染率、临床脑病理特征,应用ＥＬＩＳＡ法检测血清抗－ＨＧＶ,用ＨＧＶＮＳ５抗原制备ＭＣＡｂ,检测５４例慢笥肝炎硬化患者肝组织中ＨＧＶ抗原,同时应用ＳＰ法分别对肝组织进行ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、ＨＣＶ ＮＳ３Ａｇ肝脏免疫组化检测。结果提示５４例肝病患者肝组织检出２７．７８％ＨＧＶ抗原阳性。其中２４例慢性肝炎轻度中５例;１６例慢性肝炎中度中５２称;１５例肝硬中５例。ＨＧＶ