携带免疫刺激DNA序列的载体及人工合成免疫刺激DNA对HBV核心区基因免疫的影响

为慢性ＨＢＶ感染的防治寻求新的高效基因免疫策略。分别构建携带免疫刺激ＤＮＡ序列及不携带免疫刺激ＤＮＡ的ＨＢＶ核心区基因真核表达载体 ,并人工合成免疫刺激ＤＮＡ寡核苷酸 ,分组免疫Ｂａｌｂ/ｃ小鼠 :( 1)Ｖ ＨＢｃ ＣｐＧＯＤＮ组 ;( 2 )Ｖ ＨＢｃ 非ＣｐＧＯＤＮ对照组 ;( 3)Ｖ ＨＢｃ/ＣｐＧ。观察各组小鼠体液免疫应答及细胞免疫应答。结果表明 ,3组免疫鼠血清ＨＢＶ抗体均阳性 ,体外ＣＴＬ活力检测 3组小鼠脾细胞对转染ｐＲＳＣ ＨＢＶ的ＳＰ2 / 0细胞的细胞毒活性明显高于其他组 (Ｐ <0 .0 5) ,荷瘤试验显示第 3组免疫小鼠注…     

乙型肝炎病毒核心区基因免疫小鼠细胞免疫应答研究

目的观察小鼠对ＨＢＶ核心区基因疫苗的免疫应答。方法将经过基因修饰的乙型肝炎病毒核心区基因定向克隆于真核表达载体（ｐｃＤＮＡ３），构建成ＨＢＶ核心区基因疫苗（ｐｃＤＮＡ－ＨＢＶ），给Ｂａｌｂ／ｃ小鼠多点肌肉注射，２周后追加免疫一次，用竞争抑制酶联法及ＭＴＴ法检测小鼠血清抗－ＨＢｃ及脾细胞对ＨＢｃＡｇ的特异性增殖反应。结果免疫接种２周后小鼠血清抗－ＨＢｃ均阳性，持续１２周以上，脾细胞对ＨＢｃＡｇ的刺激指数明显高于对照组（Ｐ＜０．０５）。结论ｐｃＤＮＡ－ＨＢＶ在Ｂａｌｂ／ｃ小鼠体内既可诱导体液免疫应答，又可诱导特异性的细胞免疫应答     

乙型肝炎病毒核心区DNA疫苗接种后H-2d小鼠的特异性免疫应答

目的观察乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）核心区ＤＮＡ疫苗接种后ＢＡＬＢ／ｃ（－２ｄ）小鼠的特异性免疫应答。方法构建ＨＢＶ核心区ＤＮＡ疫苗（ＰＪＷ４３０３／ＨＢｃ）;用基因枪法和肌肉注射祛将该ＤＮＡ疫苗接种ＢＡＬＢ／ｃ小鼠;ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清抗－ＨＢＣ（ＩｇＧ）及ＩｇＧ亚类（ＩｇＧ１,ＩｇＧ２ａ）;５１铬释放法检测小鼠脾细胞ＨＢｃＡｇ特异性ＣＴＬ活性。结果该ＤＮＡ疫苗在体外转染细胞中可良好表达ＨＢｃＡｇ。血清抗－ＨＢｃ终点滴度在ＤＮＡ疫苗基因枪组和肌肉注射接种组小鼠分别为１：３２８０５０和１：１０９３５０．两组小鼠的抗－ＨＢｃＩｇＧ亚类均以ＩｇＧ２ａ略占优势。两组小鼠的ＨＢＣＡｔｈｅ异性ＣＴＬ杀伤活性分别达到５１．１％和５５．２％。结论ＨＢＶ核心区ＤＮＡ疫苗在小鼠实验中具有良好的细胞免疫和体液免疫原性。     

丙型肝炎病毒核心基因免疫诱生细胞免疫应答研究

目的 研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫在诱生特异性细胞免疫应答中的作用。方法 将包含ＨＣＶ Ｃ基因片段的重组真核表达质粒ｐｃＣＮＡ ＨＣＶ Ｃ,在主宰其可以在小鼠骨髓瘤ＳＰ２／０（Ｈ－２^d）中表达之后,注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠股四头肌。ＥＬＩＳＡ法检测血清中抗体水平;^3Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定免疫小鼠脾细胞特异性增殖能力;^51Ｃｒ释放法检测免疫小鼠细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬｓ）体外杀伤功能。结     

小鼠HCV皮下移植瘤的建立及使用DNA疫苗的治疗作用

建立小鼠丙型肝炎病毒 (ＨＣＶ)皮下移植瘤 ,并以其为ＨＣＶ感染动物模型 ,观察ＨＣＶ核心 (Ｃ)基因ＤＮＡ疫苗 ( ｐｃＤＮＡ ＨＣＶ Ｃ)在体内对ＨＣＶ感染的治疗作用。将 ｐｃＤＮＡ ＨＣＶ Ｃ用脂质体 (Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ)法转染ＢＡＬＢ/ｃ小鼠骨髓瘤ＳＰ2 /0 (Ｈ 2 ｄ)细胞 ,经Ｇ4 18筛选获稳定表达ＨＣＶＣ抗原之后 ,以 5× 10 5个细胞 /10 0 μｌ注射ＢＡＬＢ/ｃ小鼠右肋皮下 ,3ｄ后 30只试验小鼠分成 3组 ,即 :生理盐水对照组、ｐｃＤＮＡ3对照组和 ｐｃＤＮＡ ＨＣＶ Ｃ治疗组。观察并记录成瘤时间、肿瘤大小及小鼠存活时…     

丙型肝炎病毒核心基因免疫研究

目的研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫用于预防和治疗ＨＣＶ感染的可行性和有效性．方法将ＨＣＶＣ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游，在证实其可以在小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０（Ｈ２ｄ）中表达之后，将重组质粒注射ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）小鼠股四头肌，ＥＬＩＳＡ检测血清中抗体产生水平；３ＨＴｄＲ掺入法测定免疫小鼠淋巴细胞ＨＣＶＣ抗原特异性增殖能力，４ｈ５１Ｃｒ释放法检测免疫小鼠细胞毒Ｔ细胞（ＣＴＬｓ）体外杀伤功能．结果免疫小鼠２０只，初次免疫２ｗｋ后，血清中均出现了ＨＣＶＣ抗体，且增加免疫剂量可提高抗体滴度；淋巴细胞增殖指数为６１０，明显高于对照组（Ｐ＜００１），ＣＴＬｓ体外特异性杀伤率为６３１％，也高于对照组（Ｐ＜００１）．结论ＨＣＶＣ基因免疫不仅可以诱导机体产生特异性的体液免疫，而且产生特异性的细胞免疫，它可能是防治ＨＣＶ的有效方法．     

丙型肝炎病毒基因疫苗的构建物的实验研究

目的 探讨丙型肝炎病毒基因疫苗诱发小鼠免疫反应,为进一步开展ＨＣＶ基因疫苗研制奠定基础。方法 将编码ＨＣＶ－Ⅱ型结构蛋白基因片段插入真核细胞表达载体ｐＣＤ－ＳＲ１中,形成基因疫苗构建物ｐＣＤ－ＨＣＶ１。从股四头肌免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,用ＥＬＩＳＡ和＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测免疫鼠抗体反应和外周血单个核细胞对ＨＣＶ抗原的增殖反应。     

乙型肝炎病毒C区G87变异对HBeAg分泌的影响

研究ＨＢＶ/Ｃ区Ｇ87变异 (Ｃ区第 87位丝氨酸ＡＧＣ 甘氨酸ＧＧＣ)对ＨＢｅＡｇ分泌的影响。构建ＨＢＶ前Ｃ/Ｃ基因ＥＢ病毒表达载体 ,利用酶切位点消除法构建ＨＢＶ/Ｃ区Ｇ87突变体 ,并转染ＨｅｐＧ2细胞 ;采用ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法探讨变异株和野生株宿主细胞上清ＨＢｅＡｇ分泌情况。最后构建了重组野生株和变异株真核细胞表达载体 ,并在ＨｅｐＧ2细胞表达ＨＢｅＡｇ。ＥＬＩＳＡ结果显示 ,变异株宿主细胞上清ＨＢｅＡｇＡ值在接种 2 4、4 8、72、96和 12 0ｈ明显低于野生株 (Ｐ <0 .0 0 1) ;ＳＤＳ ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒ…     

HBV基因疫苗联合抗原蛋白免疫小鼠的研究

目的构建乙肝病毒（ＨＢＶ）基因疫苗,观察其与ＨＢＶ表面抗原蛋白（ＨＢｓＡｇ）联合免疫小鼠诱导的免疫应答．方法构建重组真核表达质粒ｐＣＲ３１Ｓ作为ＨＢＶ基因疫苗,联合应用纯ＨＢｓＡｇ蛋白免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,以单用基因疫苗ｐＣＲ３１Ｓ或纯蛋白ＨＢｓＡｇ免疫小鼠作为对照组．采用ＥＬＩＳＡ法检测免疫小鼠血清抗ＨＢｓ,另取免疫小鼠脾细胞,用３ＨＴｄＲ掺入法测定各组免疫小鼠的淋巴细胞增殖活性．结果２,４ｗｋ时联合免疫组抗ＨＢｓ效价低于纯蛋白免疫组,高于基因疫苗免疫组;６ｗｋ后基因疫苗免疫组抗ＨＢｓ效价升至最高,联合免疫组次之．３ＨＴｄＲ掺入法测定显示,各组免疫小鼠的淋巴细胞增殖反应差异不显著．结论乙肝病毒基因疫苗与表面抗原蛋白联合免疫无优势．     

乙型肝炎病毒核心启动子部分缺失真核表达载体的构建及对病毒抗原表达的影响

乙型肝炎病毒核心启动子 (ＣＰ)部分缺失变异已证实在几种ＨＢＶ感染的临床现象中存在[1 3 ] 。我们在一组 14例血清抗 ＨＢｅ阳性的无症状携带者中 ,发现有 9例在ｎｔ174 8(或ｎｔ174 7)至ｎｔ176 7间 2 0 (或 2 1)个核苷酸的缺失 ,此 9例中有 5例合并有ｎｔ1896Ｇ→Ａ点变异[4] 。本研究在此基础上 ,拟构建这种ＣＰ 2 0 / 2 1ｂｐ缺失及合并存在Ａ1896点变异的ＨＢＶ全基因重组真核表达载体 ,并转染ＨｅｐＧ2细胞 ,以研究此类变异株对病毒抗原表达的影响。一、材料与方法1 材料 :ＥＢＯ ｐｐｌｐ质粒由美国Ｓｃｒｉｐｐｓ研究所Ｆｒａｎ…     

高表达乙型肝炎病毒转基因小鼠的制备

制备高表达乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)转基因小鼠 ,为乙型肝炎研究提供较理想动物模型。构建、筛选高表达ＨＢＶ质粒载体 ,用显微注射法导入昆明鼠受精卵雄性原核 ,用ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹、放射免疫和免疫组织化学等方法分析ＨＢＶ基因在小鼠体内的整合和表达情况。结果表明 ,显微注射 1456枚卵 ,产仔 118只 ,整合阳性 2 5只 ,11只血清ＨＢＶＤＮＡ和ＨＢｓＡｇ阳性 ,其中 2只血清中ＨＢｓＡｇ含量高于 10 0 0ｎｇ/ｍｌ,且子代鼠中达到 90 0ｎｇ/ｍｌ。肝组织免疫组织化学分析发现有ＨＢｓＡｇ和ＨＢｃＡｇ表达 ,未见明显病理学改变。…     

含日本血吸虫脂肪酸结合蛋白（SjFABPc）基因DNA重组质粒 …

目的 观察裸ＤＮＡ重组质粒ｐＣＤ－ＳｊＦＡＢＰｃ在体外转染ＨｅｐＧ２细胞以及质粒ＤＮＡ免疫鼠肌组织中的表达，为进一步应用该质粒进行ＤＮＡ免疫实验奠定基础。方法 用脂质体介导ＤＮＡ转染法将ｐＣＤ－ＳｊＦＡＢＰｃ转染贴壁细胞ＨｅｐＧ２，Ｇ４１８加压筛选获得阳性克隆细胞并传代培养，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定目的基因在ＨｅｐＧ２细胞中的表达，将ｐＣＤ－ＳｊＦＡＢＰｃ质粒肌注免疫ＢＡＬＢ     

乙型、丙型肝炎DNA疫苗单次联合接种后小鼠的免疫应答

目的：观察由编码ＨＢｓＡｇ与ＨＣＶ－ＣＥ２抗原的两种重组真核细胞表达质粒制备的ＤＮＡ疫苗联合接种ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后,其施生行异性免疫应答的规律和相互影响。方法：应用上述２种ＤＮＡ疫苗单次联合免疫小鼠,动态观察血中特生抗体水平;并完成稳定转染,表达相应抗原的ＳＰ２／０骨髓瘤细胞的建株,采用ＣＴＬ杀伤活性体内诱生实验的方法建立观察ＤＮＡ疫苗免疫保护与治疗泊动物模型。结果：两种ＤＮＡ疫苗单次联合免疫小鼠     

口服丙型肝炎复合多表位DNA减毒鼠伤寒沙门活菌苗的实验研究

目的　利用减毒鼠伤寒沙门菌作为载体,探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ） 口服ＤＮＡ 疫苗的可行性。方法　把ＨＣＶ 复合多表位抗原基因ＰＣＸ 克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３（ＣＭＶ 启动子） ,构建ＨＣＶ 真核表达载体ｐｃＤＮＡ３／ＰＣＸ,转化减毒鼠伤寒沙门菌ＳＬ３２６１ ,获得ＨＣＶ 重组口服ＤＮＡ 活菌苗ＳＬ３２６１ （ｐｃＤＮＡ３／ＰＣＸ） ,免疫小鼠及家兔后,检测特异性免疫应答及安全性。结果　ＳＬ３２６１（ｐｃＤＮＡ３／ＰＣＸ） 在小鼠及家兔中均可诱发低水平的特异性体液免疫及细胞免疫应答,免疫动物未见明显的毒性反应。结论　ＨＣＶ 口服减毒鼠伤寒沙门菌ＤＮＡ 疫苗可诱发特异性的免疫应答,为ＨＣＶ 疫苗的研究提供新的理论及实验依据     

基因疫苗诱导小鼠抗HBV皮下移植瘤免疫研究

目的　观察 ＨＢＶ ＤＮＡ 疫苗（ｐＣＲ３－１Ｓ） 诱导Ｂａｌｂ／ ｃ 小鼠（ Ｈ２ｄ） 的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达ＨＢｓＡｇ 的小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５ 细胞（Ｐ８１５ＨＢＶＳ） （ Ｈ２ｄ） 成瘤性的影响．方法　肌肉注射ＤＮＡ 疫苗,背部皮下接种Ｐ８１５ＨＢＶＳ 细胞,观察成瘤情况,４ ｈ ５１Ｃｒ 释放法检测小鼠脾细胞ＣＴＬ 活性．结果　接种 ＤＮＡ 疫苗后小鼠成瘤率为１２－５ ％ , 对照组为１００ ％ ． 小鼠平均存活期大于３８－２ ｄ ,对照组为２８－４ ｄ ,４０ ｄ 后小鼠存活率为８７－５ ％ ,对照组为０ ％ ． ＣＴＬ 细胞杀伤活性明显增加,ｐＣＲ３－１Ｓ 组５１ ％ ,对照组为２１ ％ （ Ｐ＜ ０－００１） ．结论　ＤＮＡ 疫苗可以诱导细胞免疫应答,对体内ＨＢＶ 感染具有预防及治疗作用．     

HBsAg在不同真核表达载体中的表达

目的建立ＨＢｓＡｇ及其变异体的高效真核表达系统。方法从已构建的ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋－ＨＢｓ系列突变重组体获取ＨＢＶ－Ｓ基因片段,将其亚克隆到真核表达载体ｐＭＥＰ４,ｐＣＥＰ４,ｐＬＸＳＮ,ＰＸＴ１及ｐｃＤＮＡ３,从而构建了含ＨＢＶ－Ｓ基因及其突变型的一系列表达载体,并将其转染（或感染）人肝癌细胞系ＨｅｐＧｅ２。结果获得稳定分泌ＨＢｓＡｇＲ其突变体的抗性细胞系。结论各组真核表达载体皆能表达ＨＢｓＡｇ及其突变体,但在转染率、表达量及稳定性上存在差异。选择其中的高效、准确表达系统,将为ＨＢｓＡｇ变异株生物学性状的深入研究及进一步基因治疗、基因免疫的研究提供有用的工具。     

乙型肝炎病毒S基因单独和联合白细胞介素-12诱导小鼠产生特异性免疫应答

核酸疫苗是用带有目的抗原基因的重组表达载体免疫动物,使目的抗原在体内持续表达,诱导机体产生特异性体液和细胞免疫应答[1]。我们用含乙型肝炎病毒表面抗原(ＨＢｓＡｇ)主蛋白编码基因的核酸疫苗单独或与白细胞介素12(ＩＬ12)联合免疫Ｂａｌｂ/ｃ小鼠,检测小鼠的抗ＨＢｓ和ＨＢｓＡｇ特异性细胞毒活性。材料和方法一、核酸疫苗的制备和提纯将ＨＢＶ(ａｙｗ亚型)的Ｓ基因插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ3.1( )中,命名为ｐＳ,为本室构建并鉴定。将小鼠ＩＬ12基因插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ3.1( )中(Ｐ40和Ｐ35的编码序列以甘氨酸接头相连),命名…     

DNA疫苗诱导小鼠细胞免疫及抗肿瘤免疫研究

目的 观察ＨＢＶＤＮＡ疫苗诱导ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠（Ｈ－２＾ｄ）的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达ＨＢｓＡｇ的小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５细胞（这５－ＨＢＶ－Ｓ）（Ｈ－２＾ｄ）成瘤性的影响。方法 肌肉注射ＤＮＡ疫苗,背部皮下接种Ｐ８１５－ＨＢＶ－Ｓ细胞,观察成瘤情况,４ｈ＾５１Ｃｒ释放法不细胞细胞毒Ｔ淋细胞（ＣＴＬ）活性。结果 ＤＮＡ疫苗可以降低成瘤率,抑制成长小鼠存活期和提高小鼠存活率。ＣＴＬ细胞杀伤活性     

应用含CpG基序的寡核苷酸增强乙型肝炎病毒基因疫苗诱导的细胞免疫应答

目的 探讨人工合成的含ＣｐＧ基序的寡核苷酸（ＯＤＮ）作为佐剂对乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因疫苗诱导小鼠产生细胞免疫应答的影响。方法 构建编码ＨＢＶ基因疫苗,人工合成含ＣｐＧ基序（ｍｏｔｉｆ）的硫代磷酸寡核苷酸作为佐剂,以Ｂａｌｂ／ｃ．１－Ｓ小鼠作为实验动物进行免疫接种;采用＾３Ｈ－ＴｄＲ法、＾５１Ｃｒ４ｈ释放法等分别检测免疫小鼠的淋巴细胞增殖和杀伤功能。结果 与空载体对照组相比较,ＨＢＶ基因疫苗诱发     

乙型肝炎病毒X基因在真核细胞中的表达及反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应 (ＰＣＲ)扩增ＨＢＶＸ基因 ,克隆至真核表达载体ｐＶＲ10 12中 ,构建ＨＢＶＸ基因重组表达载体ｐＶＲ10 12 Ｘ。以该质粒转染ＨｅｐＧ2细胞 ,酶联免疫吸附法 (ＥＬＩＳＡ)检测细胞Ｘ蛋白的瞬时表达 ,与报告质粒ｐＳＶ ｌａｃＺ共转染ＨｅｐＧ2细胞 ,用试剂盒法检测β 半乳糖苷酶表达活性。结果质粒 ｐＶＲ10 12 Ｘ在ＨｅｐＧ2细胞瞬时表达Ｘ蛋白 ,共转染实验中ｐＶＲ10 12 Ｘ组β 半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的 3.2倍 ,表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达 ,并能够反式激活ＳＶ4 0早期启动子。乙型肝炎病毒X基因在…