结核分枝杆菌热休克蛋白65与汉坦病毒G2糖蛋白融合基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65（HSP65）和汉坦病毒G2糖蛋白重组融合基因为基础的真核表达载体。为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定基础。方法 采用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv株基因中．扩增出HSP65的编码基因，从T-H8205G2质粒扩增出G2糖蛋白的编码基因．经相应限制性核酸内切酶消化后．插入真核表达载体pcDNA3．1／His，并将此重组质粒通过脂质体介导转染NIH3T3细胞．用SDS-PAGE、免疫组织化学及免疫荧光方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果 获得正向插入的pcDNA3.1/ His-HSP65-G2重组表达质粒，表达产物的相对分子量为105kD．与理论预期大小一致．并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体和HSP65单抗起特异反应。表明构建的pcDNA3．1／His-HSP65-G2能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性。结论 编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功。     

结核分枝杆菌pcHSP65真核表达载体的构建及序列测定

目的 :构建以结核分枝杆菌热休克蛋白 6 5kU基因为基础的核酸疫苗。方法 :采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中 ,扩增出HSP6 5的编码基因 ,经限制性核酸内切酶消化后 ,插入真核表达载体pcDNA3.1( )的相应酶切位点 ,并将此重组质粒进行序列测定。结果 :重组质粒的插入基因经序列测定证实为结核分枝杆菌HSP6 5。结论 :以HSP6 5编码基因为基础的真核表达载体构建成功 ,为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI基因真核表达载体的构建及表达

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(ureI)的真核表达重组载体,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的研制奠定基础。方法以H.pyloriSS1株基因组为模板,PCR扩增ureI目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;通过酶切、PCR及测序鉴定,筛选阳性重组载体;脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,Western blot检测其在HeLa细胞中的表达。结果以H.pyloriSS1株基因组DNA为模板扩增出特异的ureI基因片段,大小约585 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论成功构建了真核重组载体pcDNA3.1(+)/ureI,并能在HeLa细胞中表达。     

汉坦病毒H8205株G1-人源IL-2融合基因的克隆与表达

目的 构建融合基因pcDNA3．1／His-B-IL-2-G1，为进一步研究汉坦病毒新型裸DNA疫苗奠定基础。方法 采用PCR从含有人源IL-2的质粒中扩增出IL-2片段，将人源IL-2插入真核表达载体pcDNA3．1／His—B中，构建的质粒命名为pcDNA3．1／His-昏IL-2。同样采用PCR扩增汉坦病毒H8205株G1基因片段，将回收的G1片段经双酶切插入到pcDNA3．1／His-B-IL-2，构建成新的质粒pcDNA3．1／His-B-IL-2-G1。采用脂质体介导包裹，转入NIH3T3细胞中进行瞬时表达；采用原位杂交观察细胞内的基因表达，SDS-PAGE法作重组质粒pcDNA3．1／His-B-IL-2-G1瞬时表达产物的鉴定。结果 融合基因可转录并表达-分子量为78kD左右的蛋白，对照组则未见电泳条带出现。结论 成功构建pcDNA3．1／His-B-IL-2-G1融合基因，融合基因能在真核细胞中瞬时表达。     

嗜肺军团菌热休克蛋白60基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建嗜肺军团菌热休克蛋白60(HSP60)基因的真核表达载体pcDNA3.1/HSP60,并对其进行鉴定。方法应用聚合酶链式反应(PCR)技术从嗜肺军团菌扩增得到HSP60基因,并将其克隆至载体pUC18进行序列测定。将重组质粒pUC18/LpHSP60中的目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组子pcDNA3.1/HSP60,通过限制性内切酶酶切及PCR进行鉴定。结果克隆的LpHSP60基因序列与GenBank公布的一致性为98%,限制性内切酶酶切及PCR分析表明HSP60基因已成功插入pcDNA3.1中。结论成功构建了LpHSP60基因的真核表达载体,为进一步研究军团菌病HSP60基因DNA疫苗奠定了基础。     

小鼠cyclin A2正义和反义真核表达载体的构建及鉴定

目的构建小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。方法采用小鼠胚胎组织取材,提取总RNA。设计引物,采用RT-PCR方法扩增小鼠cyclin A2 mRNA得到cyclin A2的DNA,将此DNA插入pGEM-T载体,转化入JM109感受态细菌。将鉴定得到的重组质粒进行扩增,EcoRⅠ酶切后,回收cyclin A2目的片段亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体。酶切筛选鉴定重组的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2。结果将小鼠基因的开放阅读框(ORF)重组到真核表达载体pcDNA3.1内,用EcoRⅠ酶切重组质粒后可得到一接近1660 bp的DNA条带,核酸测序证实和GenBank所公布序列相符。HindⅢ酶切鉴定重组质粒后,证明分别为正向和反向插入载体的质粒。DNA测序证明构建的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2的序列是正确的。结论成功构建了小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。     

人Heparanase基因真核和原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的：构建人Heparanase基因的真核、原核表达载体，大肠杆菌表达其融合蛋白．方法：采用反转录．聚合酶链反应从人肝癌细胞株HepG2cDNA中，分别扩增出Heparanase编码基因，用限制性内切酶BamHI消化后，插入真核表达载体pcDNA3．1中，经酶切鉴定与测序证实后，连接成包括完整的人Heparanase基因ORF区的真核表达载体，以亚克隆法构建于原核表达载体pRSET的相应酶切位点，转化大肠杆菌BL21菌株，异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生融合蛋白．结果：构建的人Heparanase基因表达载体经序列测定证实，与GenBank登录结果完全一致；双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入载体pcDNA3．1及pRSET；SDS-PAGE证实融合蛋白表达成功．结论：成功构建了人Heparanase基因真核、原核表达载体，成功正确表达了6His／Heparanase融合蛋白     

沙眼衣原体ompA真核表达重组体的构建及鉴定

目的 扩增D型沙眼衣原体ompA基因，构建真核表达重组质粒，为核酸疫苗的研制做准备。方法 用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段，重组入pUCm—T克隆载体。将pUCm—T／ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应，亚克隆入pcDNA3．1( )真核表达载体，再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选，酶切、PCR扩增及测序鉴定。结果 从D型ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段，筛选出pUCm—T／ompA；经亚克隆，筛选鉴定出pcDNA3．1( )／ompA重组质粒。结论 成功地构建了pUCm—T／ompA重组质粒和pcLDNA3．1( )／ompA重组质粒，为Ct核酸疫苗的研制提供实验基础。     

结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6基因测序质粒及真核表达重组质粒的构建

目的 构建结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT—6基因测序质粒及真核表达重组质粒，为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用PCR法对基因ESAT—6进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pUCm—T上，经测序反应确定无误，再将PCR反应产物经酶切后，克隆于真核表达载体pcDNA3．1( )上。结果 构建了结核杆菌基因ESAT—6的重组测序质粒，并对其进行了测序。真核表达重组质粒pcDNA3．1( )—ESAT—6亦构建成功。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT—6真核表达重组质粒的成功构建为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及相应抗原、抗体的制备打下基础。     

不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6基因真核质粒的构建及表达

目的:构建不可分型流感嗜血杆菌(nontypeableHaemophilus influenzae,NTHi)外膜蛋白P6(outermembrane protein P6,P6)真核表达的重组质粒,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的开发奠定基础。方法:以NTHi基因组为模板,扩增编码P6蛋白的基因片段,酶切、纯化P6基因与真核载体pcDNA3.1/HisA后进行连接,之后转化并筛选含有目的基因的重组质粒pcDNA3.1/HisA-P6;将重组子转染至HeLa细胞,荧光蛋白法检测其表达产物。结果:经质粒PCR、酶切、测序证实插入的基因片段为NTHi-P6蛋白编码基因;荧光显微镜下显示,该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论:成功地构建了真核重组质粒pcD-NA3.1/HisA-P6,并在HeLa细胞中表达。     

汉坦病毒H8205株M-IL-2融合基因的构建

目的研究汉坦病毒新型裸DNA疫苗,构建融合基因pcDNA3.1/HisBIL2M(G1 G2)。方法采用PCR扩增汉坦病毒H8205株G1和G2基因片段,将回收的G1和G2片段经双酶切插入到pcDNA3.1/HisBIL2,构建成新的质粒pcDNA3.1/HisBIL2M。结果融合基因转录一分子量为100kD左右的蛋白,对照组则未见电泳条带出现,回收的片段与预期的相符。结论成功构建pcDNA3.1/HisBIL2M融合基因。     

中国汉坦病毒H82O5株G2糖蛋白基因的克隆及在真核细胞中的瞬时表达

从感染病毒乳鼠脑组织提取总RNA，采用RT－PCR和分子克隆技术将扩增到的G2糖蛋白基因插入含CMV启动子的pcDNA3.1/His质粒载体中，通过脂质体介导转染COS－7细胞，用SDS－PAGE、Western-blot及IFIA方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果证明获得正向插入的G2－pcDNA3.1/His重组表达质粒，表达产物的相对分子量为56ku，与理论预期大小一致，并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体起特异反应。表明构建的G2－pcDNA3.1/His重组质粒所表达的蛋白为中国汉坦病毒株特有，能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性，重组质粒可应用于汉坦病毒的DNA疫苗研究。     

汉坦病毒包膜糖蛋白基因核酸免疫的初步研究

目的将克隆有汉坦病毒包膜糖蛋白基因M片段及G1、G2基因的重组质粒免疫动物，了解上述目的基因在核酸疫苗中的应用价值。方法大量制备已构建好的pcDNA3．1-M、pcDNA3．1-G1、pcDNA3．1-G2重组质粒DNA及对照空质粒pcDNA3．1。然后用这四组质粒DNA通过肌肉注射的方法免疫6～8周龄的BALB／c小鼠（每组5只），每4周免疫一次，共免疫3次，每次免疫前及最后一次免疫后2周断尾取血，用免疫荧光的方法检测基因免疫的体液免疫应答效果。结果重组质粒pcDNA3．1-G1免疫小鼠有4只血清抗汉坦病毒抗体为阳性，重组质粒pcDNA3．1-G2以及重组质粒pcDNA3．1-M免疫小鼠各有1只血清抗汉坦病毒抗体为阳性。结论汉坦病毒糖蛋白基因核酸免疫动物后可刺激机体产生特异性的体液免疫应答。     

Stable Expression of Hantavirus H8205 Strain G1/IL-2 Gene and Immune Protection of the Fusion Gene

To explore the feasibility of stable expression of Hantavirus H8205 strain G1 segment and human IL-2 fusion gene in Vero cells, and to examine the immune protection effects on mice vaccinated with this recombinant eukaryotic expression vector containing Hantavirus G1 gene and IL-2 gene. With the help of lipofectamine, the Vero cells were transfected with pcDNA3.1/HisB-IL-2-G1 and the positive cells were selected by G418. IFAT and SDS-PAGE elec- trophoresis were used to determine the stable transfection and expression of recombinant protein. Each mouse was inoculated with plasmids intramuscularly (i.m.) three times, 2 boosts were given at 2-week intervals, serum anti-hantavirus antibodies were detected by ELISA and neutralizing antibod- ies (NAb) were detected by Plaque Reduction Neutralization Test. The fusion protein expressed in Vero cells was 78 kD, corresponding to the estimated molecular size. The neutralizing antibody titers of mice with pcDNA3.1/HisB-IL-2-G1 were 1:20-1:80. IL-2/G1 fusion gene could be transferred in Vero cells and stably express the fusion protein. Specific humeral immune responses in mice can be induced with the recombinant eukaryotic expression vector containing the fusion gene, which lays the foundation for further development of therapeutic HTNV vaccine.     

结核杆菌cfp10真核载体的构建、表达与基因免疫

目的: 构建以结核分枝杆菌H37Rv cfp10基因为基础的基因疫苗. 方法: 采用BamH I和Xba I双酶切质粒pGEM-Teasy-CFP10中,10 g*L-1琼脂糖凝胶电泳回收约300 bp大小片段,以亚克隆法构建于真核表达载体pcDNA3.1的相应酶切位点. 阳性克隆提取质粒,体外电穿孔转化CHO细胞,RT-PCR法检测cfp10特异的mRNA的表达. 质粒肌注免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中相应抗体的滴度. 结果: 用BamH I和XbaⅠ酶切鉴定证实目的基因正确插入载体pcDNA3.1,命名为pcCFP10; pcCFP10转化的CHO细胞RNA提取物中,RT-PCR扩增出300 bp大小的条带. 肌注免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中相应抗体平均滴度为1∶ 4,000. 结论: 以CFP10的编码基因为基础的真核表达质粒的构建成功.     

结核杆菌pIHSP65真核表达载体的构建和表达

目的构建结核杆菌热休克蛋白65KD(HSP65)基因真核表达载体pIHSP65,并在Hela细胞中表达。方法从结核杆菌H37Rv株的基因组中扩增HSP65基因,克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点A中,构建pIHSP65真核表达载体,采用阳离子多聚体将其转染到Hela细胞中,用免疫组化染色法检测HSP65基因的表达。结果所克隆的HSP65基因片段经测序完全正确。重组质粒转染Hela细胞后,用免疫组化染色法检测有HSP65蛋白的表达。结论成功构建了结核杆菌pIHSP65真核表达载体,并在Hela细胞中有效表达,为构建双抗原双顺反子真核表达质粒,以及在整体动物水平的实验研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的：建立结核分枝杆菌PPE68蛋白基因重组质粒的真核表达载体,为以后对PPE重组蛋白的免疫原性分析奠定基础。方法：提取结核分枝杆菌总DNA,PCR法扩增出PPE68编码基因,通过线性T克隆载体pGEM—T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）后,转染至I-IeLa细胞中表达,Westernblot鉴定表达产物。结果：PCR产物、pGEM-T—PPE68及pcDNA3．1（＋）一PPE68分别经双酶切后均获得同一大小基因片段,表达产物经Westernblot鉴定相对分子质量约为40000。结论：成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体,并获得了表达产物。