错配修复基因hMSH6、hMSH2与肿瘤发生的关系

DNA在体内外多种因素作用下容易造成损伤,引起基因突变,为了维持基因组的稳定性,生物体在进化过程中逐渐形成了一整套有效的DNA损伤修复机制,其中就包括错配修复系统（DNA mismatch repair system,MMRs）。该系统通过对DNA复制过程中的碱基错配进行修复,来达到降低DNA自发性突变、增强DNA复制保真性,最终达到维持基因组稳定性的目的。如果MMR基因发生突变,将失去其错配修复功能,随之产生功能缺陷的错配修复蛋白。MMR突变也会导致微卫星不稳定（microsatellite instable,MSI）或DNA复制错误,进一步增加了细胞基因组的不稳定性,使细胞增殖及异常分化增加,最终导致多种肿瘤的发生[1]。     

小鼠整合素β7基因克隆、序列分析及突变修复

目的:克隆小鼠整合素β7基因cDNA,同时对其序列进行分析,对造成氨基酸突变的碱基进行定点突变修复.方法:采用RT-PCR的方法,从小鼠小肠PP结获得β7基因cDNA,克隆到pMD19-T载体,选择阳性克隆进行酶切鉴定和序列测定,对造成氨基酸突变的碱基进行定点突变修复.结果:扩增得到的β7基因cDNA为2418bp,编码806个氨基酸,与GenBank中公布的序列比较,有10个碱基发生突变,其中造成氨基酸发生改变的有5个碱基,涉及3个氨基酸,对发生突变的5个碱基进行定点突变修复.结论:获得小鼠整合素β7基因的克隆,为进一步研究其生物学功能奠定了良好基础.     

胃癌组织中SOX4基因的突变分析

目的研究胃癌中SOX4基因的碱基及其编码的氨基酸突变情况，探讨其在胃癌发生中的作用。方法提取胃癌肿瘤及癌旁组织的DNA，PCR扩增胃癌SOX4基因的HMG—box框，并对其进行PCR—SSCP分析，对有差异的样本进行DNA测序。将测序结果用ClustalX软件与正常的HMG—box框序列比对，用DNAStar软件将HMG—box框碱基序列转化成氨基酸序列，再用ClustalX软件与正常的氨基酸序列比对。结果经序列测定发现在27例胃癌样本中有12例出现点突变，而在癌旁组织中没有发现突变，晚期胃癌的突变率明显高于早期胃癌。结论SOX4基因突变可能与胃癌的发展和转移有相关性。本研究为探索SOX4基因突变与人类肿瘤发生之间的关系提供了分子资料。     

PCR-DGGE法检测DNA碱基突变及多态性的方法学评价

目的 了解聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)法检测DNA碱基突变和分辨单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)的能力.方法 分别用DNA序列分析法及PCR-DGGE法检测白血病患者治疗前及缓解期的白细胞线粒体DNA D-loop区,以缓解期为对照,了解两种方法检测治疗前白细胞线粒体DNA D-loop区突变的能力并作比较.同时将野生型和突变型DNA以不同比例混合模拟DNA多态性存在,以了解PCR-DGGE检测SNP的灵敏度.结果 以DNA序列分析作为对照,PCR-DGGE法检测碱基突变的特异度达到100%,灵敏度为97.1%;PCR-DGGE可检出单碱基突变;PCR-DGGE可检测出约0.5%的多态性存在.结论 PCR-DGGE是一个检测DNA碱基突变和多态性存在的较好的方法.     

hMSH2基因在散发卵巢癌中突变研究

目的：研究卵巢癌患者ＤＮＡ错配修复基因ｈＭＳＨ２（ＨｕｍａｎｍｕｔＳｈｏｍｏｌｏｇ）基因突变，同时检测其基因组微卫星Ｄ２Ｓ１２３序列变化。方法：应用ＰＣＲ、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＤＮＡ序列分析方法检测了１５例卵巢癌患者正常细胞和肿瘤细胞中的ｈＭＳＨ２基因突变。结果：３例患者存在ｈＭＳＨ２基因生殖细胞或体细胞突变，序列分析表明有碱基置换的同义突变，有碱基丢失产生的无义突变。有３例患者基因组表现Ｄ２Ｓ１２３变化，其中１例检测到ｈＭＳＨ２突变。结论：ｈＭＳＨ２基因突变和卵巢癌发生有关。机理可能为其突变引起基因组不稳定，而引起一系列基因变化，导致细胞恶性转化     

小鼠整合素α4基因克隆、序列分析及突变修复

目的 克隆小鼠整合素α4基因cDNA,进行分析整合素α4基因序列,对造成氨基酸突变的碱基进行定点突变修复.方法 从小鼠小肠peyer's结获得α4基因cDNA,采用RT-PCR方法,克隆到pMD18-T载体,选择阳性克隆进行酶切鉴定和序列测定,对造成氨基酸突变的碱基进行定点突变修复.结果 扩增得到的α4基因cDNA为3 099 bp,编码1 032个氨基酸,与GenBank中公布的序列比较,有12个碱基发生突变,其中6个碱基造成6个氨基酸发生改变,对发生突变的6个碱基进行定点突变修复.结论 获得小鼠整合素α4基因的克隆.     

错配修复基因hMSH2、hMLH1与乳腺癌

在DNA正常代谢中 ,碱基错配、插入或缺失均可导致基因重组DNA复制错误。遗传信息的准确传递对于细胞、机体乃至整个种系的生存和延续是至关重要的。在生物漫长的进化过程中 ,细胞内逐渐形成了一整套有效的机制以保证遗传信息稳定而真实的代代相传。错配修复 (mismatchrepair,MMR)是细胞复制后的一种修复机制 ,可对DNA错配的碱基进行修复 ,起着维持DNA复制保真度、控制基因变异的作用。恶性肿瘤的发生、发展涉及到内因 (遗传因素 )和外因 (环境因素 )多种病因。最新研究表明 ,错配修复基因 (DNAmismatchrepair)也与肿瘤的发生有关 ,…     

多聚酶链反应-单链构象多态性分析基因点突变

单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)是一种简便、敏感有效的鉴定扩增DNA序列变化的技术.相同长度的单链DNA因其序列不同(甚至单个碱基不同),形成的构象相异,电泳时泳动速度不一.PCR产物经变性后进行单链DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳时,靶DNA中若有单个碱基替换等改变时,会出现泳动变位(mobility shift).PCR-SSCP的最主要优点是简单,在不同的系统中突变检出率达70%～95%以上,其主要不足可能是漏检一些突变.作者根据本实验室对多抑癌基因(tumor suppressor gene,TSG)p53突变的检测,介绍PCR-SSCP的实验过程.     

伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株16SrRNA基因的检测与分析

目的 探讨伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株的菌种相关性或亲缘性.方法 分离提取伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株及其亲代细菌型的染色体DNA,采用16SrRNA基因引物进行PCR扩增,对扩增的16SrDNA产物进行琼脂糖凝胶电泳和碱基序列测定.结果 经PCR扩增后伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株及其亲代细菌型均获得了大小约230 bp的特异性片段,其产物经琼脂糖凝胶电泳可见在230 bp处出现与其亲代细菌型一致的DNA条带,碱基序列测定显示具有同其亲代细菌型一致的核苷酸序列.结论 伤寒沙门菌的细胞壁缺陷突变株虽然丧失了常规细菌学可检测的绝大多数表型特征,但检测16SrRNA基因能快速、灵敏地对其进行菌种相关性或亲缘性的分析与鉴定,并且也有利于对各种不能自发返祖的细菌稳定L型进行菌种相关性或亲缘性的分析与鉴定.     

多囊卵巢综合征患者线粒体DNA全序列突变的筛查

目的 筛查多囊卵巢综合征患者线粒体DNA突变情况.方法 对57例多囊卵巢综合征患者和38名正常对照线粒体DNA进行全序列测定,并对变异位点的差异进行了统计学处理.结果 在患者组和对照组线粒体DNA之间共筛查到233个单碱基变异和一个重复序列变异.对于前者的233个单碱基变异,两组间差异无统计学意义(P＞0.05);后者的重复序列变异位于线粒体DNA第8281位,是由9个碱基CCCCCTCTA组成的重复序列单位片段,在患者组该位点含有这一片段的比例为93.8%,而在对照组则为71.4%,分布差异有统计学意义(P＜0.05).结论 线粒体DNA第8281位重复序列CCCCCTCTA可能与多囊卵巢综合征相关.     

遗传、高保真DNA聚合酶、基因检测

遗传与变异是生物进化和生命活动最基本和永恒的主题。其中 ,遗传物质在个体和物种中如何维持其稳定性 ,更是当代生物医学研究中的热点。高保真DNA聚合酶通过其著名的校正或称之谓错配碱基修复机制 ,参与了遗传物质稳定性的维持[1 ,2 ] 。高保真DNA聚合酶除含有聚合酶活性外 ,该酶分子同时具有 3′→ 5′外切酶活性 ,正是通过此外切功能对有待延伸的引物或DNA复制过程中新生DNA链三末端或近三末端不配对碱基的校正 ,使DNA合成终产物的保真度得到了维持[3 ] 。人类基因测序计划的完成 ,使人类步入了后基因组时代。在后基因组时代的医学…     

犬线粒体DNA高变区Ⅰ(HVRⅠ)的遗传多态性研究

目的为犬线粒体DNA应用于系统进化和法医学物证鉴定提供基础。方法对106只无亲缘关系的犬线粒体DNA高变区Ⅰ（1041—1318）进行测序。结果测序得到了23个单倍型，它们的差异由24个突变点产生，其中包括碱基转换、颠换及插入。大多数突变点是碱基替代，转换为79．2％，颠换为16．7％，碱基插入为4．1％。结论犬线粒体DNA高变区Ⅰ序列，遗传差异度（相当于杂合度）为0．89，两个无关个体的偶合概率为0．1213，具有高度序列多态性。     

核化线粒体的进化加速作用与转基因人模型分析

生物分子钟的应用在当代生物研究领域具有十分重要的意义。然而，分子钟仅能用于粗略估计不同种群生物间的进化时程，间接表明进化可能不是或不仅仅是由于中性突变通过遗传渐变所造成；相反，染色体DNA与外源性DNA之间，以及染色体DNA相互之间的大量基因重组，则可能是推动进化进程的更大动力之一。鉴于人体内的线粒体DNA是一种外源性环状DNA，人类可认为是一种天然发生的整合了外源性线粒体DNA的转基因物种。本文引入转基因人分析法并应用这一方法探讨与人类进化过程相关的基因重组。通过对人、小鼠、大鼠进行核化线粒体组学分析，发现人类染色体基因组含有大量与线粒体DNA同源的核酸片段；人体基因组内核化线粒体基因在重组数与总碱基长度上均较小鼠和大鼠高出数倍。人体内大量存在的线粒体DNA介导的基因重组可能在促进人类进化中发挥了一定的作用。     

广西壮族人群线粒体DNA单个碱基突变的分析

目的：探讨广西壮族人群的线粒体DNA（mtDNA）单个碱基的突变，了解突变的频率，为进一步研究壮族人群的遗传基础和相关的线粒体遗传病提供基础资料，方法：从83例广西壮族人血液标本中提取DNA，通过PCR扩增，分离和回收，用377全自动序列分析仪进行序列测定，分析了mtDNA第一高变区单个碱基的突变。结果：来自南宁第四个地区的76个样本共有66个单倍型，71个多态位点，共发生了298次转换，39次，颠换和1个缺失，88％的碱基替换为转换，12％为颠换，南宁、百色、柳州和河池地区的转换，颠换和缺失的频率分别为6．31％，6．40％，6．79％和5．90％，对上述频率进行多样本率比较的卡方检验，均无显著性差异（P＞0．05）。结论：壮族人九mtDNA的单个碱基突变比较丰富，各位点发生突变的频率不同。     

VHL肿瘤抑制基因及其突变的检测

目的：研究von Hippel-Lindau(VH L)肿瘤抑制基因的突变。方法：提取外周血白细胞核酸,应用聚合酶 链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）方法和自动化测序仪检测DNA 序列, 判别VHL基因外显子的突变。结果：对13例VHL患者或有家族史者检测 ,发现4例有突变,突 变类型有碱基插入、置换和无意义变异。结论：本组受测者的基因突 变主要是碱基简单变异。     

胃癌线粒体DNA D-loop区碱基突变的检测分析

目的 研究胃癌患者的癌组织线粒体DNA （mtDNA）D-loop区碱基突变情况,以探讨mtDNA D-loop区碱基突变与胃癌发生发展的相关性.方法 采用聚合酶链反应和DNA测序相结合的方法,对75例胃癌患者癌组织线粒体D-loop 区进行扩增并测序分析.结果 在75例胃癌组织中共有130个位点发生了变化,其中属于基因多态性有101个,基因突变有29个.75例胃癌组织中39例mtDNA D-loop区存在突变,突变率为52%.结论 mtDNA D-loop 区碱基突变可能在胃癌发生发展中发挥重要作用.     

Channel catfish重组激活基因克隆与鉴定

目的尝试用简并引物扩增序列未知的channel catfish基因组DNA中ragl基因的片段并测序,为ragl基因的早期进化模式和遗传学变异情况的研究提供直接的证据.方法基于ragl基因的高度保守设计简并引物,PCR扩增channel catfish基因组DNA中ragl基因的片段,TA克隆并双向测序.将所得序列资料拼接,用多种生物信息学方法分析其ORF、内含子、与其它物种ragI基因及Ragl蛋白的相似性,并做多序列比较和系统进化树分析.结果扩增出3条chan-nel catfish ragl基因的DNA片段.从拼接后的序列中找到一2 235bp的ORF和一293bp的内含子,所得序列与其它物种ragl基因的相似程度高(多大于70%),去除内含子后的channel catfish ragl基因序列与zebrafish、rainbow trout、bull shark的ragl基因cDNA全序列碱基一致的位点占43.9%,自第1 352位碱基至2 925位碱基为53.1%,而自第1位碱基至1 351位碱基为33.2%,有非常显著的差异(P＜0.01).结论用简并引物成功扩增出channel catfish ragl基因的DNA片段.序列在GenBank中的登记号是:AY423858(去除内含子序列),AY423859.ragl基因进化缓慢,高度保守,不同物种ragI基因的变异相对集中在氨基末端的区域.系统进化树分析显示了13种硬骨鱼在进化上关系的亲疏.     

突变敏感性分子开关对乳腺癌DBC2基因7776C〉T突变的快速检测

目的应用硫化磷酸修饰的碱基特异性引物和高保真DNA聚合酶所构成的突变敏感性分子开关技术结合琼脂糖凝胶电泳,快速检测乳腺癌及乳腺纤维腺瘤中DBC2基因7776C〉T突变频率。方法设计2对分别与DBC2基因7776位点突变碱基（C）和野生碱基（T）配对的硫化磷酸修饰的引物,硫化磷酸修饰等位基因位点特异性引物与组织DNA样本完全配对时,能被高保真聚合酶延伸,而硫化磷酸修饰等位基因位点特异性引物与组织DNA样本不完全配对时,不能被高保真聚合酶延伸。用此突变敏感性分子开关技术对85例乳腺癌组织DNA样本及10例乳腺纤维腺瘤组织DNA样本进行PCR检测,并利用凝胶成像系统对PCR产物进行分析。结果利用分子开关技术在85例乳腺癌组织DNA样本中检测出DBC2基因7776C〉T突变率为2．4％（2／85）,10例乳腺纤维腺瘤未发现该突变。结论该突变敏感性分子开关技术结合琼脂糖凝胶电泳可快速检测乳腺癌DBC2基因7776C〉T突变。突变敏感性分子开关技术可在单碱基水平对相关基因突变进行特异性检测,提示其在乳腺癌等基因突变检测中具有广阔的应用前景。     

用一对错配引物进行的PCR／酶解法检测β-地中海贫血-28（A→G）突变

1989年Haliassos等首先报道用误配碱基引物PCR检测点突变。其基本原理是，一个引物3’末端紧邻突变点，3’末端或近3’末端引入一个错配碱基，介导突变产物在此产生某内切酶酶切序列，而正常模板的PCR产物无该酶切序列，另一引物不含错配碱基。问题是当内切酶用量太少或失活时，     

化学诱变剂诱发基因非定标性突变的分子机理研究

应用将突变靶基因与哺乳细胞基因组DNA相分离的实验体系，证明化学诱变剂N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱发的基因突变可发生在损伤碱基以外的正常序列中(非定标性突变)，并有突变谱特征和突变好发的序列特异性。它的发生在于化学诱变剂诱发的基因表达改变。应用mRNA差异显示和反义核酸技术分离到2个基因表达序列标识，阻断其相关基因表达，可分别促进和抑制化学诱变剂诱发的非定标性突变。应用蛋白质组学技术发现有60多个蛋白质斑点在MNNG处理后发生了显著变化，根据肽质指纹图对其中大部分蛋白作了鉴定，发现了很多新的参与应答的蛋白质。用体外DNA复制技术证明，其发生基础是化学诱变刺引发细胞DNA复制保真度的下降，而细胞错配修复功能未发现异常，但DNA聚合酶酶谱发生改变。用反义核酸技术，证明POLξ、POLκ和POLη可能参与非定标性突变形成。其发生可因细胞应激信号通路激活剂所促进，在化学诱变剂作用后有蛋白磷酸化谱和蛋白酪氨酸残基磷酸化谱的改变以及应激激活蛋白激酶的激活，提示细胞信号转导通路的激活参与了非定标性突变的发生。研究还证明调节POLβ表达的cAMP-PKA-cREB通路在MNNG处理后激活；MNNG还可诱发细胞表面受体的聚簇，但其发生并不依赖于MNNG对基因组DNA的损伤作用。提出了哺乳细胞非定标性突变形成分子机制的工作假说。