54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列分析

目的分析54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列,为临床分离株的鉴定提供参考。方法用16S rRNA序列分析法对54株分枝杆菌国际参考株进行分析,构建系统发育树,计算相似性百分比。结果除11株（共9种4组）分枝杆菌,即产鼻疽分枝杆菌与塞内加尔分枝杆菌;溃疡分枝杆菌与海分枝杆菌;堪萨斯与胃分枝杆菌;3株结核分枝杆菌与田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌16S rRNA基因序列完全相同无法相互鉴别,其它41株（共41种）分枝杆菌菌种间16S rRNA均不相同可以得到很好的鉴别。结论 16S rRNA基因序列分析是一种很好的鉴定分枝杆菌的方法,国际参考株16S rRNA基因序列的研究弥补了基因数据库的不足。     

54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列分析

目的分析54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列,为临床分离株的鉴定提供参考。方法用16S rRNA序列分析法对54株分枝杆菌国际参考株进行分析,构建系统发育树,计算相似性百分比。结果除11株(共9种4组)分枝杆菌,即产鼻疽分枝杆菌与塞内加尔分枝杆菌;溃疡分枝杆菌与海分枝杆菌;堪萨斯与胃分枝杆菌;3株结核分枝杆菌与田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌16S rRNA基因序列完全相同无法相互鉴别,其它41株(共41种)分枝杆菌菌种间16S rRNA均不相同可以得到很好的鉴别。结论 16S rRNA基因序列分析是一种很好的鉴定分枝杆菌的方法,国际参考株16S rRNA基因序列的研究弥补了基因数据库的不足。     

PCR-SSCP快速鉴别结核、非结核分枝杆菌临床分离株的研究

目的：应用分子生物学方法快速鉴别结核、非结核分枝杆菌临床分离株。方法：通过设计两对引物分别扩增16S rDNA两条片段，根据SSCP电泳图谱与结核分枝杆菌标准株的相似性鉴别结核、非结核分枝杆菌。结果：98株临床分离株中，经细胞学鉴定93株为结核分枝杆菌复合群，5株非结核分枝杆菌。用引物I、Ⅱ对结核分枝杆菌复合群进行PCR－SSCP析，有81株与标准株有相似图谱。用引物Ⅲ、Ⅳ对非结核分枝杆菌进行PCR－SSCP分析，均显示出与结核分枝杆菌标准株不同的电泳图谱。结论：PCR－SSCP可快速鉴别结核、非结核分枝杆菌。     

PCR-反向线点杂交技术鉴定慢生长分枝杆菌的方法学研究

目的建立和评价以16S-23S rDNA间隔序列（ITS）为靶基因的PCR-反向线点杂交技术（RLB）快速鉴定慢生长分枝杆菌（SGM）的方法。方法PCR—RLB检测70株分枝杆菌参考菌株、4株诺卡菌参考菌株、5株红球菌参考菌株、1株棒状杆菌参考菌株，来源于中国生物制品和药品鉴定所和悉尼大学感染性疾病和微生物中心；358株分枝杆菌临床分离株来源于深圳、广州和澳大利亚。结果所有分枝杆菌参考菌株均可扩增出200～250bp DNA片段，分枝杆菌引物可扩增4种诺卡菌和5种红球菌，但不与分枝杆菌属探针和种探针杂交。21个探针可鉴定分枝杆菌、结核分枝杆菌复合群、溃疡／海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌a／b和堪萨斯分枝杆菌c亚种及其他16种SGM。结论该方法能快速、简便和准确地鉴定SGM。     

多位点PCR技术用于四川267株分枝杆菌临床分离株的鉴定

目的 初步了解四川省肺结核患者分枝杆菌菌种类型。 方法 收集267株分枝杆菌临床菌株,经PNB/TCH鉴别培养基进行培养鉴定后,采用聚合酶链反应(PCR)对16S rRNA、Rv0577、IS1561、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8和Rv3120 基因位点进行扩增,鉴定至种,再经PRA-rpoB、hsp65基因测序进行验证。 结果 267株分枝杆菌临床分离株多位点PCR结果显示结核分枝杆菌262株,非洲分枝杆菌Ⅰ型3株,非结核分枝杆菌2株。PNB/TCH鉴别培养基培养鉴定结果为结核分枝杆菌复合群266株,非结核分枝杆菌1株。2株非结核分枝杆菌分别为鸟分枝杆菌(M. avium)和脓毒分枝杆菌(M. septicum)。多位点PCR结果与rpoB-PRA、hsp65基因测序结果一致。 结论 多位点PCR技术鉴定分枝杆菌菌种结果准确可靠,且具有简便和快速等优点,有较大的分子流行病学应用价值,且对于临床诊断和治疗都具有重要意义。     

不同分子生物学方法快速鉴别非结核分枝杆菌的应用评价

目的 评价3种分子生物学方法快速鉴定非结核分枝杆菌的优缺点.方法 收集41株临床分离的非结核分枝杆菌,以16S rRNA基因测序方法为标准,同时以hsp65基因测序方法及PCR-RFLP方法鉴定菌株,与16S rRNA基因测序结果进行比较.结果 41株非结核分枝杆菌16SrRNA基因测序结果:9株龟分枝杆菌复合群,7株偶发分枝杆菌,7株胞内分枝杆菌,3株鸟分枝杆菌,3株堪萨斯分枝杆菌复合群,3株耻垢分枝杆菌,3株土分枝杆菌,2株草分枝杆菌,2株无色分枝杆菌,1株瘰疬分枝杆菌,1株M.arupense.与16S rRNA基因测序相比较,hs65 PCR-RFLP能鉴定9株龟分枝杆菌复合群至亚种脓肿分枝杆菌,3株堪萨斯分枝杆菌复合群鉴定至亚种堪萨斯分枝杆菌;1株偶发分枝杆菌及1株无色分枝杆菌与其不符;其余菌株鉴定结果一致,符合率为95.1%(39/41).hsp65基因测序结果显示,1株爱尔兰分枝杆菌与16S rRNA测序结果不符,其余菌株鉴定结果与其一致,符合率为97.6%(40/41),并且能进一步将9株龟分枝杆菌复合群鉴定至亚种脓肿分枝杆菌,3株堪萨斯分枝杆菌复合群鉴定至亚种堪萨斯分枝杆菌.结论 3种方法均能快速鉴定非结核分枝杆菌.与16S rRNA基因测序相比,hsp65基因测序及hsp65 PCR-RFLP更容易鉴定临床最常见非结核分枝杆菌(如堪萨斯分枝杆菌和脓肿分枝杆菌),可在临床推广使用.     

2011-2018年四川省自贡市分枝杆菌临床分离株鉴定分析

目的了解自贡市肺部感染分枝杆菌的菌种菌型特征,为临床分枝杆菌病的诊断和治疗及制定有效防控策略提供科学依据。方法收集2011－2018年临床疑似结核病患者分离到的抗酸染色阳性培养物,经对硝基苯甲酸（PNB）和噻吩-2-羧酸肼（TCH）鉴别培养和多位点PCR鉴定为结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌（NTM）,再经rpoB和hsp65序列分析对NTM进行种的鉴定。结果2 751株分枝杆菌临床分离株经PNB/TCH鉴别培养基和多位点PCR鉴定,结核分枝杆菌2 647株,占96.22%,非洲分枝杆菌Ⅰ型32株,占1.16%,NTM 72株,占2.62%。 72株NTM鉴定出11个种。结论自贡市分枝杆菌肺部感染主要为结核分枝杆菌所致,感染致病的NTM种类较多,以脓肿分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和鸟分枝杆菌为主。 外来分枝杆菌和奥巴涅分枝杆菌在国内为首次报道。     

常见分枝杆菌种内不同株之间16S rRNA基因和16S-23SrRNA ITS序列分析结果的比较

目的 针对常见分枝杆菌不同株对其基因序列进行分析,比较分析结果.方法 利用16S rRNA Gene和16S-23S rRNAITS(转录间隔区序列)分析法分别对97株共7种DSMZ/ATCC引进的常见分枝杆菌进行种内不同株之间基因差异性分析,对比两种分型结果的异同.结果 16S rRNA基因可将13株草分枝杆菌分为3...     

两株鼻疽诺卡菌临床分离株的鉴定

目的应用基因测序方法对2株疑似非结核分枝杆菌的菌株进行初步菌种鉴定,指导临床用药治疗.方法将2株临床分离菌株1520、4108分别接种于罗氏培养基,观察其菌落生长状况;取生长对数期菌落,抽提菌株DNA;PCR扩增16S rDNA基因序列,对其PCR产物进行测序和NCBI网站Blast同源性比对,以进行菌株的初步鉴定.结果编号为1520、4108两株菌株,在罗氏培养基上生长迅速,均可见淡黄色粗颗粒样小菌落,疑似非结核分枝杆菌;以PCR扩增两株菌的16S rDNA基因序列,结果与鼻疽诺卡菌(Nocardia farcinica)同源性极高,比例均达到99%.结论从肺科急诊患者体内分离到的菌株1520、4108为鼻疽诺卡菌,而不是非结核分枝杆菌,为临床在治疗方案上提供了有力的证据.同时, DNA测序分析能够快速、简便、准确地鉴定到菌种,为实验室疑难菌型鉴定提供了技术保障.     

16SrRNA、16S-23SrRNA基因测序分析检测主要血流感染病原菌比较

目的比较细菌16SrRNA、16S-23SrRNA基因测序分析在血流感染病原菌检测中的作用。方法提取临床上血流感染常见的金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、洛菲不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、潘尼变形杆菌、屎肠球菌、粘质沙雷菌、宋内志贺菌、产气肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、腐生葡萄球菌基因组DNA,运用16SrRNA、16S-23SrRNA基因进行PCR扩增。扩增产物经测序后在美国国家生物技术中心（NCBI）上进行比对分析,确定菌种。结果在所分析的19种临床血流感染常见细菌中,16SrRNA基因测序分析可将除粘质沙雷菌外的细菌鉴定到种的水平,但无法完全区分近缘种属;16S-23SrRNA成功鉴定17种细菌,除大肠埃希菌、宋内志贺菌外所有细菌均成功鉴定到单一种的水平。结论16S-23SrRNA基因可作为血流感染细菌检测较好的分子靶标。     

Genetic diversity of Flavobacterium columnare examined by restriction fragment length polymorphism and sequencing of the 16S ribosomal RNA gene and the 16S-23S rDNA spacer

Genetic variability among strains of Flavobacterium columnare, isolated in the United States, was characterized by restriction fragment length polymorphism (RFLP) and phylogenetic analysis based on the sequence of the 16S rRNA gene. Twenty-seven isolates of F. columnare were differentiated into three genotypes. The isolates within the genotypes were further grouped based on RFLP of the 16S-23S rDNA spacer. The first genotype had five strains that were further divided into group A (4 strains) and B (1 strain) while the second genotype had 10 strains that were also further divided into group A (4 strains) and B (6 stains). The third genotype had 12 isolates with no differences in the RFLP patterns of the 16S-23S rDNA spacers. The 16S rRNA gene sequences representing the three identified genotypes were compared to the different published sequences by phylogenetic analysis and the results showed the American genotypes 1, 2 and 3 corresponding to genomovar 1, 2, and 3, respectively, reported by Triyanto and Wakabayashi [Triyanto, Wakabayashi H. Genotyping of strains of Flavobacterium columnare from diseased fishes. Fish Pathol 1999; 34: 65-71]. The study demonstrates a method for RFLP and sequencing of the 16S rRNA gene and the 16-23S rDNA spacer as a useful tool in epidemiological studies of F. columnare.     

Sequestering from host and characterization of sequence of a ribosomal RNA operon (rrn) from "Candidatus Liberibacter asiaticus"

A 5005bp rrn DNA sequence of "Candidatus Liberibacter asiaticus" was obtained by PCR using primers conserved to Rhizobiaceae of alpha-proteobacteria. The rrn locus consisted of a 16S rRNA gene (rrs), an intergenic transcribed spacer (ITS) containing two genes of tRNA(Ile) and tRNA(Ala), a 23S rRNA gene (rrl), an ITS without tRNA gene and a 5S rRNA gene (rrf). Like rrs, rrl and rrf were also related (89-90%) to those of the members of Rhizobiaceae. Interestingly, the genes of tRNA(Ile) and tRNA(Ala) were more related to those of non-Rhizobiaceae alpha-proteobacteria. The non-tRNA gene regions of the 16S-23S ITS and 23S-5S rRNA ITS did not share significant similarity to any known non-Liberibacter DNA sequences, and could be used for specific and efficient detection of "Ca. L. asiaticus".     

沙漠地区自然环境中消毒包储存时限及细菌来源研究

[目的]探讨沙漠地区自然环境中消毒包有效储存时限以及消毒包内生长细菌的来源。[方法]双层棉布手术敷料包、器械包、敷料器械混合包各54个,预真空压力蒸汽灭菌后分别存放在医疗战备仓库自然环境的密闭储存箱(密闭组)和开放储存箱(开放组)内,每个箱内放置3种类型消毒包各3个,于灭菌后第14天、第24天、第34天、第44天、第54天、第64天、第74天、第84天、第94天取样,每次每组随机取9个包进行细菌培养,同时对仓库空气、储存箱取样培养;根据消毒包内细菌种类筛选空气中同种细菌不同菌株,提取基因组DNA,以其为模板,对16SrRNA和23SrRNA的转录间隔区(ITS)序列进行PCR扩增,扩增产物回收测序,将测得的基因序列用Blast进行比对。[结果]灭菌后84d两组消毒包组细菌培养阴性,94d两组消毒包细菌培养阳性;消毒包生长细菌与空气中同种异株菌16SrRNA～23SrRNA ITS序列相似性为98%～100%。[结论]沙漠地区自然环境相对洁净、干燥的空气,有利于延长消毒包的有效储存时限;消毒包生长的细菌来源于空气。     

沙漠地区自然环境中消毒包储存时限及细菌来源研究

[目的]探讨沙漠地区自然环境中消毒包有效储存时限以及消毒包内生长细菌的来源。[方法]双层棉布手术敷料包、器械包、敷料器械混合包各54个,预真空压力蒸汽灭菌后分别存放在医疗战备仓库自然环境的密闭储存箱（密闭组）和开放储存箱（开放组）内,每个箱内放置3种类型消毒包各3个,于灭菌后第14天、第24天、第34天、第44天、第54天、第64天、第74天、第84天、第94天取样,每次每组随机取9个包进行细菌培养,同时对仓库空气、储存箱取样培养;根据消毒包内细菌种类筛选空气中同种细菌不同菌株,提取基因组DNA,以其为模板,对16SrRNA和23SrRNA的转录间隔区（ITS）序列进行PCR扩增,扩增产物回收测序,将测得的基因序列用Blast进行比对。[结果]灭菌后84d两组消毒包组细菌培养阴性,94d两组消毒包细菌培养阳性;消毒包生长细菌与空气中同种异株菌16SrRNA～23SrRNA ITS序列相似性为98%～100%。[结论]沙漠地区自然环境相对洁净、干燥的空气,有利于延长消毒包的有效储存时限;消毒包生长的细菌来源于空气。     

First case of nontuberculous mycobacterial lung disease caused by Mycobacterium marseillense in a patient with systemic lupus erythematosus

Mycobacterium marseillense was designated as a new species within Mycobacterium avium complex. We report the first case of M. marseillense lung disease in a patient with systemic lupus erythematosus. All serial isolates were identified as M. marseillense by multilocus sequence analysis, based on hsp65, 16S-23S rRNA internal transcribed spacer, and 16S rRNA fragments.     

Identification of mycobacteria by nonradioisotopic single-strand conformation polymorphism analysis

Clinical isolates of mycobacteria were identified to species levels using nonradioisotopic single-strand conformation polymorphism (non-RI SSCP) analysis of 16s rRNA gene fragments amplified by polymerase chain reaction with primers common to all of mycobacterial species. The method is based on a hypervariable region within the 16s rRNA in mycobacteria, which is characterized by species-specific nucleotide sequences. A total of 92 mycobacterial strains (Mycobacterium tuberculosis, M. avium, M. gordonae, M. intracellulare, M. kansasii, M. chelonae, M. nonchromogenicum, M. xenopi, and unidentified strain) were studied. They were classified into nine types of pattern showing single-strand DNA bands having different mobilities. Each strain was shown in the species-specific mobility by non-RI SSCP analysis. The results of non-RI SSCP analysis were identical to those of standard biochemical methods and 16S rRNA sequencing.     

Comparison between two PCR-based bacterial identification methods through artificial neural network data analysis

The 16S ribosomal ribonucleic acid (rRNA) and 16S-23S rRNA spacer region genes are commonly used as taxonomic and phylogenetic tools. In this study, two pairs of fluorescent-labeled primers for 16S rRNA genes and one pair of primers for 16S-23S rRNA spacer region genes were selected to amplify target sequences of 317 isolates from positive blood cultures. The polymerase chain reaction (PCR) products of both were then subjected to restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis by capillary electrophoresis after incomplete digestion by Hae III. For products of 16S rRNA genes, single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis was also performed directly. When the data were processed by artificial neural network (ANN), the accuracy of prediction based on 16S-23S rRNA spacer region gene RFLP data was much higher than that of prediction based on 16S rRNA gene SSCP analysis data (98.0% vs. 79.6%). This study proved that the utilization of ANN as a pattern recognition method was a valuable strategy to simplify bacterial identification when relatively complex data were encountered.     

耐亚胺培南鲍曼不动杆菌同源性及耐药机制研究

目的调查本院耐亚胺培南鲍曼不动杆菌(IRAB)的分子流行特点,初步研究其对碳青霉烯类抗菌药物耐药的分子机制。方法收集2009年11月至2010年1月不同临床科室分离的IRAB非重复株共54株,用Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪进行药敏试验;用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析IRAB的同源性;PCR及DNA测序检测碳青霉烯酶和16S rRNA甲基化酶相关耐药基因型。结果 54株细菌PFGE可分为A、B两个型,其中A型42株,占77.8%,在各科室均有分布,为主要的流行型别;B型10株,占18.5%,仅在神经内、外科的ICU分布。全部54株菌均携带OXA-66基因,53株菌携带OXA-23基因及其上游插入序列ISAba1,41株菌携带16S rRNA甲基化酶armA基因。结论医院临床各科室存在A型IRAB的克隆播散,而B型IRAB仅在神经内、外科ICU流行。OXA-23基因及其上游插入序列ISAba1是最主要的耐碳青霉烯类抗菌药物机制,armA型16S rRNA甲基化酶基因在IRAB中广泛分布。