阪崎肠杆菌环介导恒温扩增方法检测

探索快速简便易行的阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)检测方法,可以减少和控制由其引起的食品污染和中毒事件^〔1〕。环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal ampli-fication,LAMP)是2000年由Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法,其利用4条特异性引物来识别靶基因的6个特定区域,具有很高的特异性和灵敏度,反应在恒温下进行,快速简便,省却了PCR所需的温度循环,并且扩增产物量大,肉眼、电泳、浊度仪均可进行检测^〔2〕。     

环介导恒温扩增检测小肠结肠炎耶尔森菌

目的建立1种基于环介导恒温扩增(LAMP)的快速、敏感、特异检测小肠结肠炎耶尔森氏菌方法,为诊断该菌感染及食品中污染检测提供实验室诊断依据。方法根据GenBank中foxA序列,设计多套引物,筛选最佳引物、优化反应条件,建立小肠结肠炎耶尔森氏菌DNA的LAMP检测方法,加入荧光染料钙黄绿素以肉眼判断结果。结果根据扩增曲线,从4组引物中筛选出最优引物组进行LAMP检测,63℃恒温15min开始出现扩增,最低检测限为1.46×10~(-7)g/L,高于普通PCR最低检测限1个数量级;以金黄色葡萄球菌、沙门菌、假结核耶尔森氏菌等10株病原菌为模板进行LAMP检测,均未检出非特异性扩增反应。测序结果分析显示,LAMP扩增区不同菌株序列一致性约为95%,具有很好的保守性。结论建立的方法能够满足基层实验室、应急检测等使用需求,有良好的应用价值,可在有条件的基层进行推广。     

DNA环介导恒温扩增试验检测结核分枝杆菌的研究

目的探讨建立更快速、准确的痰结核分枝杆菌检测方法。方法采用涂片抗酸染色法、罗氏培养法和DNA环介导恒温扩增(LAMP)试验对结核分枝杆菌进行检测,并对其检出率进行比较。结果 LAMP试验检出率最高,罗氏培养法次之且检测时间长,抗酸染色法的检出率最低。结论 LAMP试验检测痰结核分枝杆菌具有快速、敏感、简便、特异等优点,在肺结核患者的早期诊断中将发挥重要作用。     

建立核酸序列依赖性扩增方法检测寨卡病毒

目的 建立检测寨卡病毒的核酸序列依赖性扩增(NASBA)方法,满足口岸需要.方法 根据寨卡病毒NS3基因设计并验证特异性扩增引物,建立NASBA方法.用登革病毒、基孔肯雅病毒、乙脑病毒、黄热病毒作为对照验证方法的特异性;用不同浓度寨卡病毒RNA进行NASBA扩增,确定方法的灵敏度.结果 以寨卡病毒RNA为模板扩增获得N...     

寨卡病毒实时荧光RT-RPA快速检测方法的建立

目的 建立1种适用于现场的快速、高效实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)检测寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)的方法。方法 利用ZIKV膜蛋白基因保守序列设计特异性引物及探针,构建膜蛋白基因重组质粒并作为参考品,建立ZIKV的实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)检测方法,并与实时荧光定量RT-PCR法进行灵敏度比较。利用建立的方法对三带喙库蚊进行模拟添加ZIKV检测。结果 成功构建ZIKV膜蛋白重组阳性质粒,与ZIKV核苷酸同源性为100%。建立的RT-RPA法扩增产物起飞时间与质粒拷贝数标准曲线为y=-1.031 9x+15.146,R²为0.994 7,最低检出限为2.91 copies/μL,高于荧光定量PCR法(29.1 copies/μL),检测时间为30 min。结论 建立的ZIKV RT-RPA检测方法,简便、灵敏、特异性强,反应快速,适用于ZIKV现场应急、基层实验室或出入境口岸的快速检测。     

环介导核酸恒温扩增结合试纸条技术快速筛查沙门菌的方法

[目的]探讨环介导核酸恒温扩增(LAMP)结合试纸条技术(LFD)快速筛查沙门菌的可行性.[方法]从GenBank上下载沙门菌invA基因序列,用DNAMAN软件同源性比对后,在其保守区设计LAMP扩增引物,建立LAMP-LFD恒温扩增快速检测技术,优化反应条件,用荧光聚合酶链反应(PCR)法平行检测加以验证.[结果]...     

寨卡病毒感染者13例病毒核酸检测结果分析

目的 分析广东省江门市13例寨卡病毒感染者生物样品病毒核酸结果。方法 采用描述性方法对2016年2-4月江门市报告的寨卡病毒感染者进行流行病学分析。采用荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）方法检测研究对象的血液、尿液和唾液寨卡病毒核酸。结果 2016年2-4月江门市共确诊10例寨卡病毒病病例和发现3例寨卡病毒隐性感染者,均自委内瑞拉输入。13例感染者中,男性6例,女性7例;最小年龄5岁,最大年龄46岁,中位数是19岁, ≤ 14岁儿童占46.15%（6/13）。寨卡病毒核酸阳性检出持续时间,血液最短0 d,最长4 d,中位数0 d;尿液最短2 d,最长32 d,中位数5.5 d;唾液最短0 d,最长10 d,中位数3.5 d;尿液样品比血液样品病毒核酸阳性持续时间长（P<0.01）;唾液样品比血液样品病毒核酸阳性持续时间长（P<0.05）。结论 寨卡病毒感染者血液、尿液和唾液3种生物样品病毒核酸阳性持续时间不一致。     

环介导等温扩增法快速检测手足口病病原体

目的：建立逆转录（RT）-环介导等温扩增方法（LAMP）,以快速检测手足口病最重要的两种病原体：肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）。方法：收集手足口病患儿咽拭子标本93份,针对EV71和CA16病毒的VP1基因特异性序列8个区域各设计6条LAMP引物,分别于63℃（EV71）、65℃（CA16A）扩增1 h,日光下观察结果,与实时荧光定量PCR比较检测特异性和敏感性。结果：EV71、CA16的LAMP最低检测限均为500拷贝/管,与对照病毒无交叉反应。93份标本中,RT-PCR方法检测显示EV71阳性44例,CA16阳性36例;RT-LAMP方法检测显示EV71阳性46例,CA16阳性36例,两种方法间比较差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论：应用RT-LAMP检测手足口病病原体EV71、CA16快速、灵敏、经济、特异性高,适合在基层医疗机构推广应用。     

环介导等温扩增快速检测人类嗜T淋巴细胞病毒I型方法建立

[目的]建立环介导等温扩增(LAMP)快速检测人类嗜T淋巴细胞病毒I型方法. [方法]将HTLV-I的PX基因转染pUC57构建HTLV-I检测参考菌株,针对PX基因设计LAMP和PCR引物,用正交实验设计优化反应体系,并考察方法的特异性和灵敏度. [结果]25μl LAMP最佳反应体系为:外引物02 μmol/L、内引物1.8 μmol/L、dNTP 2 000 μmol/L、Mg2+4 mmol/L、甜菜碱0.4 mol/L、BstDNA聚合酶8 U;最佳反应条件为64℃恒温反应60min.[结论]LAMP方法具有灵敏、特异、操作简便、成本低廉的特点,可为HTLV-I的快速检测提供新手段.     

荧光免疫层析技术检测寨卡病毒IgG抗体

目的建立和开发一种高特异性、高灵敏度的寨卡病毒IgG抗体的检测方法。方法本研究对寨卡病毒E蛋白核酸序列优化,减低其交叉反应,经过大肠杆菌诱导表达,亲和层析纯化获得特异性蛋白。将获得的寨卡病毒E蛋白抗原喷于检测区捕获样品中的目标抗体,将羊抗小鼠IgG喷于控制区进行质量控制;将鼠抗体人IgG单克隆抗体标记荧光纳米颗粒(激发谱峰365 nm;发射光谱峰610 nm)作为标记抗体;建立荧光免疫层析试剂,配合荧光免疫检测仪YG10,检测人血清中的寨卡病毒IgG抗体,并对该检测方法进行性能验证。结果寨卡病毒E蛋白经大肠杆菌表达,菌液经过收集并超声后,上清和沉淀分别进行SDS-PAGE鉴定,多存在于沉淀中;纯化后的蛋白经SDS-PAGE鉴定,均呈现较单一的蛋白条带,纯度达到90%以上。建立的荧光层析试剂检测50份正常人血清,荧光免疫检测仪YG1分别扫描读取T、C信号值,读取T/C值,计算平均值(AVERAGE)和标准差(STDEVP),3倍标准差加上平均值作为阳性判断值,即:T/C≥3SD+AVG为阳性;与对比试剂ZIKV IgG酶联免疫试剂盒(Dia.Pro.)同时检测3份寨卡阳性标本均为阳性反应;10份正常人血清均为阴性反应;批内重复性CV≤20%,批间重复性CV≤15%;与相似的蚊媒病毒基孔肯雅病毒、登革病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒均无交叉反应。结论该荧光层析试剂具有较好的灵敏性和特异性,可作为人血清、血浆、全血样本中寨卡病毒IgG抗体的快速筛查。     

环介导恒温扩增技术在检测儿童下呼吸道病原菌的临床应用分析

目的利用环介导恒温扩增技术探究儿童下呼吸道病原菌检测结果的临床分布特点,为实际临床工作提供参考。 方法收集2018年8月至2019年7月在天津市某儿童医院初诊为呼吸道病原菌感染的2517例患者,采集支气管肺泡灌洗液标本或深部痰标本,采用环介导恒温扩增芯片法检测下呼吸道的13种病原菌,并对检测结果进行分析。 结果应用环介导恒温扩增芯片法检测2517例下呼吸道感染住院患儿,共检出1771例病原菌阳性(痰液1174例(46.64%),肺泡灌洗液597例(23.72%))。芯片法检出的主要病原菌为肺炎支原体934例(37.11%)、肺炎链球菌557例(22.13%)、耐甲氧西林葡萄球菌397例(15.78%)、流感嗜血杆菌295例(11.72%)和金黄色葡萄球菌214例(8.50%)。不同季节感染呼吸道病原菌的阳性率不同,小儿肺炎支原体感染全年均有发生,以秋冬季多见,肺炎链球菌冬季多见,耐甲氧西林葡萄球菌春季多发,流感嗜血杆菌以春夏多发。单一病原菌感染1179例(46.84%),混合感染1338例(53.16%)。 结论对儿童检测下呼吸道病原菌感染,芯片法具有操作简单、快速、准确,明显缩短标准周转时间(TAT),且灵敏度更高、病原体覆盖面广等优势,能更好地服务于感染性疾病的快速诊断、抗生素的早期筛选以及合理使用。     

环介导等温扩增技术应用于口岸病原体快速检测的现状及展望

环介导等温扩增技术由于不需要专业仪器,操作简便,价格便宜,被广泛应用于口岸多种病原体的快速检测.此文总结了环介导等温扩增技术在检测结核分枝杆菌、寨卡病毒、登革热病毒、疟原虫及肝炎病毒等方面的最新研究成果,并对其在口岸快速检测方面的应用前景进行综合分析.     

DNA环介导恒温扩增法快速检测结核杆菌的研究

DNA环介导恒温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)利用核酸扩增技术,极大地提高了灵敏度,已开始应用于疾病诊断、流行病学监测、食品安全检测等领域。本研究将LAMP技术应用于快速检测结核分枝杆菌,方法简单、快     

甲型流感病毒逆转录环介导等温扩增快速检测方法的建立

目的采用逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术建立了一种针对甲型流感病毒的特异、灵敏、快速、可视、简便的检测方法。方法根据甲型流感病毒M基因的保守序列,利用PrimerExplorer V4软件,设计了一套针对M基因的8个区域的5条特异性引物,优化了反应体系与扩增条件,并验证其特异性与灵敏性。结果该方法能检测出H1、H3、H5、H6、H7、H9亚型流感病毒,而对乙型流感病毒、人副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人冠状病毒、人偏肺病毒、人腺病毒、人博卡病毒均无扩增反应,其最低检测限度为50拷贝/μl。另外,扩增反应只需要40min就能判读结果,并可通过反应液是否有沉淀或向反应液中加入荧光染料来对结果进行可视化诊断。结论本研究建立的RT-LAMP检测方法具有高特异性、灵敏度、快速简便、可视化判读结果等优势,适合在基层进行甲型流感病毒的快速检测,并可以应用于大流感疫情的准确筛查。     

环介导等温扩增技术在食品检测中的应用

环介导等温扩增技术（LAMP）是一种新兴的快速扩增技术,以其快速、灵敏、特异、简便等优点在食品检测中得到了广泛应用。作者在介绍LAMP技术的原理和特点的基础上,就其在国内外食品致病菌安全检测方面的一些应用进行了综述,以期为我国食品检测和同类研究提供参考。     

环介导等温扩增法检测空肠弯曲菌

目的 空肠弯曲菌是重要的食源性疾病病例标本的病原菌检测项目,用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的方法,对食源性致病菌空肠弯曲菌进行快速检测。方法 以空肠弯曲菌 mapA 基因序列为检测靶基因,建立了空肠弯曲菌的LAMP 快速检测方法。空肠弯曲菌的LAMP反应由DNA扩增试剂盒提供的反应体系加入引物和模板进行。做了空肠弯曲菌DNA模板灵敏度的检测、菌液灵敏度的检测和特异性检测。结果 我们方法对空肠弯曲菌DNA 的检测灵敏度为84.5fg/反应管;对空肠弯曲菌菌液检测灵敏度为0.8 CFU/反应管;特异性100%。结论 对食源性疾病腹泻样本的空肠弯曲菌检测项目,可以采用mapA-LAMP方法进行等温扩增初筛,初筛阳性的样品再有针对性地进行后续的传统培养。     

SARS冠状病毒环介导等温扩增可视化检测方法的建立

目的应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立SARS冠状病毒可视化快速检测方法。方法针对SARS冠状病毒RNA聚合酶编码基因保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入钙黄绿素作为LAMP扩增反应指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据钙黄绿素的颜色变化进行结果判定,评价所建立LAMP方法的特异性和灵敏性。结果本方法最低检出限约为10拷贝/反应管,高于普通PCR;检测特异性高,仅SARS冠状病毒反应管钙黄绿素颜色由褐色变为黄绿色,而甲型H1N1病毒、高致病性H5亚型禽流感病毒、普通流感病毒均不发生变色反应;体系的扩增效率高于普通PCR,35 min内出结果。结论所建立的基于颜色判定的SARS病毒检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于SARS冠状病毒现场快速检测。     

新型环介导等温扩增技术开发与应用研究进展

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种成熟的、应用广泛的检测技术。目前LAMP技术已经经历了十余年的研究和发展,开发了多种新型环介导等温扩增技术。其技术改进主要体现在提高检测特异性、加快反应速度、简化样本处理、实现多重扩增以及应用于现场检测平台等方面。本文从免疫环介导等温扩增、微流体环介导等温扩增、电化学发光环介导等温扩增、分子信标指示环介导等温扩增、多重实时环介导等温扩增、结合FTA卡的环介导等温扩增等新型技术,以及环介导等温扩增技术在简单化、快速化与产物检测特异化等方面的改进进行了综述,为环介导等温扩增技术的进一步发展和实际应用提供依据。     

基于逆转录-环介导等温扩增技术快速检测发热伴血小板减少综合征病毒方法的建立

目的建立1种快速、特异、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)的检测方法。方法针对SFTSV M基因保守区域的核酸序列,设计逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)特异性引物,优化反应体系和条件。用毛细管电泳法和横向流动试纸条(LFD)法检测扩增产物,建立RT-LAMP检测方法。进行敏感性、特异性检验,并与Real-time RT-PCR法进行比较。结果以LFD法和毛细管电泳法检测RT-LAMP扩增产物具有相同的敏感性和特异性;RT-LAMP-LFD检测SFTSV的敏感性为10copies RNA分子/反应,且与其他病毒无交叉反应。RT-LAMP-LFD和Real-time RT-PCR检测临床标本阳性率差异无统计学意义(P0.05),2种方法一致性好(Kappa=0.918)。结论建立的RT-LAMP方法快速、简单、操作简单,具有较高的敏感性和特异性,适合应用于基层单位和现场SFTSV的快速检测。