鹅去氧胆酸对HepG2细胞胆汁酸靶基因的影响及其联合姜黄素的细胞毒性

目的：探讨鹅去氧胆酸对肝癌细胞HepG2胆汁酸靶基因的影响以及联用姜黄素对HepG2细胞的毒性。方法：利用实时荧光定量PCR法检测鹅去氧胆酸对HepG2细胞胆汁酸靶基因的mRNA表达影响,MTT法检测鹅去氧胆酸和姜黄素对HepG2和SMMC-7721肝癌细胞存活率的影响,克隆形成实验检测鹅去氧胆酸和姜黄素对HepG2细胞增殖的影响。结果：随着鹅去氧胆酸浓度的提高,BSEP和SHP基因的mRNA表达水平升高,CYP7A1、CYP8B1、NTCP和β-catenin基因的mRNA表达水平降低（P值均≤0.05）,FXR基因的mRNA表达水平无变化（P>0.05）。HepG2、SMMC-7721细胞存活率随着鹅去氧胆酸和姜黄素浓度的提高和作用时间的延长呈依赖性下降（P<0.05）,鹅去氧胆酸和姜黄素联用的效果更好（P<0.05）。HepG2细胞的克隆形成率受鹅去氧胆酸和姜黄素的影响均降低（P<0.05）,鹅去氧胆酸和姜黄素联用效果更明显（P<0.05）。结论：鹅去氧胆酸对肝癌细胞HepG2的细胞毒性可能与胆汁酸代谢有关,鹅去氧胆酸联合姜黄素能更好地抑制肝癌细胞的...     

隐丹参酮对人胆管癌HCCC-9810细胞中Survivin基因表达的影响

目的 探讨隐丹参酮(CTS)对人胆管癌HCCC-9810细胞作用的敏感性并研究隐丹参酮对人胆管癌细胞周期及细胞凋亡率的影响,初步探讨隐丹参酮对人胆管癌细胞凋亡抑制基因Survivin表达的影响.方法 体外培养胆管癌细胞HCCC-9810,采用不同浓度隐丹参酮予以干预,通过细胞形态观察及MTT实验,初步研究隐丹参酮对人胆管癌细胞HCCC-9810的敏感性;应用流式细胞仪检测隐丹参酮诱导人胆管癌细胞周期的变化;Hochest染色法检测诱导细胞凋亡;RT-PCR检测人胆管癌HCCC-9810细胞Survivin基因mRNA表达变化.结果 隐丹参酮可明显抑制胆管癌HCCC-9810细胞株的增殖且该抑制效应随药物剂量的增加和作用时间的延长而增强;随着最适药物浓度作用时间的延长,胆管癌细胞明显被阻滞在G0/G1期,使S期细胞比例降低,细胞凋亡数目逐渐增加,Survivin基因mRNA表达逐渐降低.结论 隐丹参酮对人胆管癌HCCC-9810细胞增殖抑制作用呈剂量和时间依赖效应;隐丹参酮能诱导人胆管癌HCCC-9810细胞凋亡,其机制可能是通过影响肿瘤细胞的细胞周期、抑制Survivin基因表达有关.     

HGF经HGF/Akt通路抑制肝癌细胞HCCC-9810的增殖

目的:观察肝细胞生长因子(HGF)对人胆管细胞型肝癌细胞HCCC-9810增殖的影响,并探讨其分子机制?方法:HGF处理HCCC-9810细胞后,用MTT及EdU法检测癌细胞的增殖;siRNA干扰技术抑制HCCC-9810细胞内源性Akt的表达,Western blot检测癌细胞Cyclin D1蛋白表达和Akt磷酸化的变化?结果:50和100 ng/ml HGF显著抑制肝癌细胞HCCC-9810的增殖?Western blot结果显示,HGF处理后的肝癌细胞Akt磷酸化和Cyclin D1表达量明显下调?siRNA干扰Akt的表达,阻断了HGF诱导的Cyclin D1表达量的下调及细胞增殖抑制?结论:HGF通过下调Akt磷酸化和Cyclin D1表达量抑制肝癌细胞HCCC-9810的增殖?     

法尼醇X受体天然激动剂的研究进展

法尼醇X受体(Farnesoid X receptor,FXR),又称胆汁酸受体,因与代谢调节密切相关,FXR激动剂目前成为代谢性疾病治疗的药物研发热点.FXR天然激动剂来源广泛且大部分具有无或低毒副作用的特点,主要分为动物源性激动剂、植物源性激动剂和微生物源性激动剂三大类.动物源性激动剂包括鹅脱氧胆酸、胆酸、脱氧胆酸...     

TRAI联合吉西他滨体外诱导人肝内胆管细胞癌细胞凋亡作用的研究

目的:探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对人肝内胆管细胞癌细胞HCCC-9810的作用及联合化疗药物吉西他滨(GEM)共同作用人肝内胆管细胞癌细胞对TRAIL抗肿瘤活性的影响。方法:单独应用不同浓度TRAIL(10、30、100、300、1 000 ng/ml),不同浓度GEM(10、20、40、80μg/ml)及100 ng/ml TRAIL+GEM(10、20、40、80μg/ml)联合作用于人肝内胆管细胞癌细胞HCCC-9810,应用四氮唑蓝快速比色(MTT)进行检测,计算肿瘤细胞生长抑制率。结果:GEM与TRAIL联合应用对HCCC-9810细胞抑制率明显高于单独应用TRAIL和GEM(P<0.05)。结论:TRAIL通过诱导肝内胆管细胞癌细胞凋亡而起到抑癌作用,GEM能加强TRAIL的抗癌活性。     

Hepsin蛋白对肝癌细胞生长的影响

目的:探讨Hepsin蛋白对肝癌细胞生长和细胞凋亡的影响。方法:运用RT-PCR技术检测肝癌组织样品肝癌细胞系中Hepsin基因的表达水平,并从原发性肝癌患者的癌组织中扩增Hepsin基因编码区序列,该序列被克隆并构建pCMV-tag-HS表达质粒。将pCMV-tag-HS表达质粒转染人肝癌细胞系HepG2细胞、Bel-7402细胞,观察Hepsin蛋白对肝癌细胞的增殖能力和细胞凋亡效应的影响。结果:Hepsin基因在临床肝癌组织和人正常肝细胞L-02细胞中高表达,在人肝癌细胞系Bel-7402细胞、HepG2细胞和临床肝癌癌旁组织不表达或低表达,Hepsin蛋白可以增强肝癌细胞系的增殖能力,同时抑制肝癌细胞凋亡。结论:Hepsin蛋白促进肝癌细胞生长并抑制肝癌细胞凋亡。     

安罗替尼对人肝内胆管细胞癌细胞系HCCC-9810作用研究

目的：检测安罗替尼（Anlotinib）对人肝内胆管细胞癌(ICC)细胞系HCCC-9810的杀伤作用。方法：使用系列浓度的Anlotinib以及作为对照的索拉非尼（Sorafenib）和舒尼替尼（Sunitinib）处理HCCC-9810细胞后，进行MTT实验，利用MTT数据计算药物作用的抑制率与半数作用浓度（IC50）。在此基础上检测药物对HCCC-9810细胞转移与侵袭的影响。结果： Anlotinib、Sorafenib和Sunitinib等作用于HCCC-9810细胞的IC50值分别为（0.97±0.14）、（8.27±1.17）和（8.18±0.82）μmol·L-1。相同浓度下（1μmol·L-1），Anlotinib能显著抑制HCCC-9810细胞的转移与侵袭，Sorafenib和Sunitinib抑制作用不明显。结论：Anlotinib能够杀伤肝内胆管上皮肿瘤细胞，是肝脏胆管细胞癌诊疗新的希望。     

ShockProtein40在肝内胆管癌中的表达及意义

目的 观察热休克蛋白40（shock protein 40,HSP40）肝内胆管细胞癌组织、肝细胞癌组织及正常肝组织中的表达,探讨其在肝内胆管细胞癌发生中的作用,为肝内胆管细胞癌的早期诊断和治疗提供一定的指导意义。方法 应用免疫组化检测HSP40 在30例肝内胆管细胞癌组织、20例肝细胞癌组织和15例肝细胞癌旁组织中的表达情况;应用酶联免疫吸附实验（EL1SA）检测相应30例肝内胆管细胞癌患者、20例肝细胞癌患者和15例正常健康志愿者体内血清中HSP40的含量,ELISA试剂盒购自Cusabio公司。结果 HSP40在肝内胆管细胞癌患者中表达量为502.07±64.53,显著高于正常健康志愿者中表达量为105.31±27.00（P<0.02）;在肝细胞癌患者中表达量为412.00±53.41,并且HSP40在肝内胆管细胞癌患者中比肝细胞癌患者中明显较高。结论 HSP40在肝内胆管细胞癌中的高表达可能与与其癌变的发生和发展有着重要的关联,可作为肝内胆管细胞癌的辅助诊断指标之一及判断预后的重要指标。     

CD70在肝细胞癌转移侵袭中作用的研究

【立论依据及设计思路】 CD70属于肿瘤坏死因子超家族成员,为II型跨膜蛋白,与淋巴细胞上CD27结合后发挥作用。其在包括肾癌在内的多种肿瘤中表达异常,与免疫逃离有关。但CD70在肝细胞癌中的表达及其作用目前尚不清楚,本课题组在前期实验中意外地获得了具有很强迁移侵袭能力的肝癌细胞,而在这种细胞中CD70表达显著下降,随后我们又分析了40例巴塞罗那(BCLC)不同分级肝癌患者肿瘤组织和癌旁组织中CD70的表达,发现肿瘤出现转移后,CD70的表达明显下调,说明肝癌发生转移时CD70的表达确实出现改变。因此本实验旨在研究CD70表达变化与肝癌细胞转移侵袭间的关系,为肝癌病程提供新的潜在的转移标志物. 【实验内容】 (1)选择HepG2、Huh7、Hep3B和BEL-7402不同肝癌细胞系,利用流式细胞分选技术,分选CD70阳性和CD70阴性的细胞进行培养。(2)运用相差显微镜、扫描电镜及透射电镜观察CD70表达情况不同的细胞形态;应用MTT的方法检测不同细胞的细胞活力;利用transwell实验检测不同的细胞迁移和侵袭能力;最后根据实验结果,查询与迁移有关的蛋白质并利用蛋白质印迹的方法进行检测。(3)分别采用裸鼠尾静脉注射观察肺部转移瘤和脾脏注射观察肝转移瘤的方法,评价CD70表达变化与肿瘤转移及注射后裸鼠生存率的关系;通过皮下注射检测不同细胞的成瘤性并保留照片和组织,进行免疫组化以及蛋白检测。(4)选择新鲜人肝癌组织,用流式细胞技术对这些组织进行CD70表达的检测并分选,再将分选好的新鲜人肝癌细胞异体移植到裸鼠体内以检测其细胞特性是否与体外培养的细胞一致。 【材料】 HepG2、Huh7、Hep3B、及BEL-7402细胞系,流式分选仪,CD70的流式抗体BD Pharmingen 555834,BD Pharmingen 555835,裸鼠,新鲜人肝癌组织 【可行性】 前期工作已证实CD70在肝癌细胞转移后表达下调,提示CD70可能参与肝癌的转移;能熟练操作课题中所需的方法;所属实验室为“肝脏保护与再生调节北京市重点实验室”,与北京佑安医院具有合作关系,能获得新鲜人肝癌组织。 【创新性】 首次发现CD70在肝癌转移过程中表达下调,同时本课题首次提出CD70表达下调可能促进肝癌转移。     

白细胞介素-6反义核苷酸抑制胆管癌细胞增殖和诱导其凋亡的实验研究

目的:研究白细胞介素-6(IL-6)反义核苷酸(ASODN)对人肝内胆管癌HCCC-9810细胞增殖和凋亡的影响.方法:通过脂质体Lipofectamine"2000介导IL-6 ASODN转染人肝内胆管癌HCCC-9810细胞.细胞克隆率形成实验和MTT实验检测IL-6 ASODN对胆管癌细胞增殖的影响,流式细胞仪检...     

PKM2基因对胆管细胞癌迁移､侵袭及增殖的影响

目的:检测M2-型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)在胆管癌(cholangiocarcinoma,CCA)组织中的表达情况,探讨PKM2下调对胆管癌细胞迁移?侵袭及增殖的影响?方法:实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色分别检测胆管癌及对应癌旁组织标本中PKM2的mRNA和蛋白表达水平?利用慢病毒表达载体系统在胆管癌细胞株HuCCT-1?HCCC-9810中下调PKM2,分别用划痕实验?Transwell细胞侵袭实验和CCK-8比色法检测细胞迁移?侵袭及增殖能力?结果:胆管癌组织中PKM2的mRNA和蛋白表达水平明显高于对应癌旁组织?经qRT-PCR和Western blot方法证实稳定转染PKM2 shRNA的胆管癌细胞中PKM2的mRNA和蛋白水平较对照组均明显下降(P < 0.05),与空载对照组(PKM2-NC)和正常对照组(PKM2)相比,实验组细胞(PKM2-shRNA)的迁移?侵袭及增殖能力明显减弱,差异有统计学意义(P < 0.05)?结论:胆管癌组织中PKM2表达明显高于癌旁组织,PKM2 shRNA能有效地降低胆管癌细胞中PKM2基因的表达,PKM2基因沉默可以抑制HuCCT-1?HCCC-9810细胞的迁移?侵袭及增殖?     

法呢醇X受体及瘦素在胆管癌中的表达及意义

目的探讨法呢醇X受体（FXR）与瘦素（Lep）在胆管癌组织中的表达变化及意义,并分析二者之间的关系。方法采用免疫组织化学染色法检测胆管癌组、癌旁胆管组和手术边缘正常胆管组中FXR和Lep的表达,比较各组中两者表达的差异性。结果 FXR和Lep在胆管癌组、癌旁胆管组和手术边缘正常胆管组中均有表达。FXR在癌旁无瘤切缘和正常胆管组织中的表达显著高于癌组织（P〈0.05）,Lep在癌旁无瘤切缘和正常胆管组织中的表达显著低于癌组织（P〈0.05）,而二者在癌旁无瘤切缘与正常胆管组织中表达均无显著差异（P〉0.05）。FXR和Lep具有相关性,相关系数为r=0.627 7（P〈0.05）。结论 FXR与Lep可能通过调节脂质代谢平衡及免疫应答等机制,共同参与胆管癌的发生和发展。     

Farnesoid X receptor expression is reduced in human hepatocellular carcinoma

Farnesoid X receptor (FXR, NR1H4) is a member of nuclear hormone receptor superfamily. Previously studies showed that FXR^?/? mice spontaneously developed liver tumors when they aged, however, the relevance of which to human hepatocellular carcinoma (HCC) is unclear. The aim of this study is to observe whether FXR expression is also downregulated in HCC and discuss the mechanism of the reduced FXR expression in HCC. Expression of FXR and small heterodimer partner (SHP) was measured by real-time PCR and immunohistochemical technique. Effect of pro-inflammatory cytokines on expression of FXR and its promoter activity were determined in primary hepatocytes or HepG2 and Huh7 cell lines. Our results showed that expression of FXR and its target gene SHP in human HCC was strongly downregulated compared to the normal liver tissues. In addition, pro-inflammatory cytokines were able to decrease FXR expression by inhibiting the FXR promoter activity. In conclusion this work demonstrates FXR expression is strongly downregulated in human HCC, which may be caused by decreased FXR promoter activity, suggesting a potential role of FXR in human HCC development.     

二甲双胍通过miR-194-5p/RBM6通路抑制肝细胞癌细胞的恶性细胞表型的机制研究

目的 观察二甲双胍对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)细胞HepG2增殖、凋亡的影响,并探究其潜在机制与miR-194-5p/RNA结合基序蛋白6(RNA binding motif protein 6,RBM6)通路之间的关系。方法 随机将100例接受手术的HCC患者分为对照组、试验组,每组50例。对照组患者给予安慰剂口服,试验组给予二甲双胍口服。脂质体法将antagomiRNA、antagomiR-194-5p、pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-RBM6、二甲双胍+si-NC、二甲双胍+si-RBM6、antagomiR-194-5p+si-NC、antagomiR-194-5p+si-RBM6转染至HepG2细胞。荧光定量聚合酶链式反应实验检测血清、组织、细胞中miR-194-5p、RBM6的表达;噻唑蓝法、5-溴-2-脱氧尿嘧啶染色检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因实验检测细胞荧光活性;蛋白免疫印迹实验检测细胞RBM6蛋白。结果 试验组患者的2年无瘤生存期显著延长,患者治疗后血清miR-194-5p表达明显降低(P...     

miR-424通过调控ATG14的表达抑制肝癌细胞的自噬和增殖

目的 研究miR-424通过调控ATG14表达影响自噬和肝癌细胞增殖。方法 收集肝癌患者因手术切除的肝癌组织及其癌旁组织,采用 qRT-PCR 法检测肝癌组织中 miR-424-5p,ATG14 的表达。培养人肝癌细胞系 HepG2、SMMC-7721、Huh-7、MHCC97H、HCCLM3和人正常肝细胞LO2,qRT-PCR法检测上述各细胞系的miR-424-5p表达,选取表达量较高的Huh-7和表达量较低的HCCLM3肝癌细胞为研究对象,Huh-7细胞实验分组（n=3）：干扰miR-424-5p表达阴性对照组（in-NC组）,干扰miR-424-5p表达组（in-miR-424-5p组）;HCCLM3细胞实验分组（n=3）：过表达miR-424-5p组（mi-miR-424-5p组）,另设过表达miR-424-5p阴性对照组（mi-NC组）;过表达miR-424-5p阴性对照+过表达ATG14阴性对照组（mi-NC+NC组）;过表达miR-424-5p阴性对照+过表达ATG14组（mi-NC+ ATG14组）;过表达miR-424-5p +过表达ATG14阴性对照组（mi-miR-424-5p+NC组）;过表达miR-424-5p +过表达ATG14组（mi-miR-424-5p +ATG14组）。qRT-PCR法及Western blot法验证各组miR-424-5p和ATG14的转染情况。采用MTT法检测各组细胞的细胞增殖,流式细胞术检测各组细胞的细胞凋亡水平,Western blot检测各组细胞的ATG14和自噬相关蛋白LC3、Beclin1和P62的表达水平,双荧光素酶报告基因实验检测miR-424-5p和ATG14之间的相互作用。结果 在肝癌组织和细胞中ATG14高表达,miR-424-5p低表达。与相应对照组相比,过表达miR-424-5p抑制肝癌细胞增殖和促进凋亡（P<0.05）;干扰miR-424-5p表达及过表达ATG14促进肝癌细胞增殖和抑制凋亡（P<0.05）;miR-424可能通过靶向ATG14发挥抑癌的作用。干扰miR-424-5p表达及过表达ATG14均能提高肝癌细胞自噬体标志蛋白LC3-ΙΙ/LC3-Ι、Beclin1的表达水平（P<0.05）,降低自噬受体蛋白P62的表达水平（P<0.05）;过表达miR-424-5p则降低肝癌细胞自噬体标志蛋白LC3-ΙΙ/LC3-Ι、Beclin1的表达水平（P<0.05）,提高自噬受体蛋白P62的表达水平（P<0.05）。结论 miR-424调控ATG14表达影响自噬,从而抑制肝癌细胞增殖。     

HBV影响甲磺酸阿帕替尼治疗肝细胞癌效果的机制研究

目的 研究乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染对阿帕替尼干预下肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）细胞增殖、迁移、凋亡的影响。 方法 体外培养阿帕替尼干预的人肝癌HepG2和HepG2.215细胞,细胞计数试剂（cell counting Kit-8,CCK-8）法检测细胞增殖抑制作用,细胞划痕实验检测细胞迁移力,流式细胞术检测细胞凋亡率。 结果 阿帕替尼干预后的HepG2细胞组划痕愈合率明显低于HepG2.215细胞,早期凋亡率、晚期细胞凋亡率及总凋亡率均高于HepG2.215细胞组,差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论 HBV状态影响甲磺酸阿帕替尼抑制肝癌细胞迁移和诱导细胞凋亡的效果,阿帕替尼在HBV阴性HCC细胞中可能更好地发挥抗肿瘤作用。     

沉默中期因子对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

目的  探讨中期因子（MDK）在肝细胞肝癌（HCC）中的表达及对肿瘤细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法  选取2015年1月-2016年10月该院收治的50例肝癌患者组织标本，免疫组织化学染色分析组织中MDK的表达。利用沉默核糖核酸（siRNA）沉默人肝细胞癌HepG2细胞内MDK表达，分别采用CCK-8、流式细胞仪及插入式细胞培养皿、穿透小室（Transwell）检测沉默MDK后HepG2细胞增殖、凋亡及侵袭能力变化。结果  肝癌组织中MDK蛋白的表达水平较癌旁组织提高（χ2=19.643，P =0.000）；在HepG2细胞中，沉默MDK的表达可抑制HepG2细胞增殖（F =22.204，P =0.037）和侵袭（t =5.611，P =0.008）能力，并提高HepG2细胞的凋亡比例（t =5.702，P =0.006）。结论  MDK在肝癌中表达升高，沉默肝癌HepG2细胞内MDK表达能够抑制肝癌细胞生长和侵袭。

     

IGF-ⅠR抑制剂联合西妥昔单抗对人肝癌细胞的体外抑制作用

目的探讨西妥昔单抗与胰岛素样生长因子-Ⅰ受体(IGF-ⅠR)抑制剂aIR3对人肝癌细胞株HepG2细胞的作用。方法选用浓度递增的西妥昔单抗(5~500)mg/mL和aIR3(2.5～250.0)μmol/L,单独或联合作用于HepG2细胞,观察不同时间对细胞增殖的抑制作用以及联用时的两药协同系数。结果单药西妥昔单抗与aIR3对HepG2细胞增殖的抑制作用均呈浓度依赖性与时间依赖性,二药单独作用于HepG2细胞72 h最大抑制率分别为42.2%、82.3%,二药联合作用于HepG2细胞72 h最大抑制率达91.8%。西妥昔单抗与аIR3不同浓度在各时间点的协同系数均小于1。结论西妥昔单抗和aIR3在体外对HepG2细胞的增殖均具有一定的抑制作用,联合应用时具有明显的协同效应。