南海红树林来源链霉菌Streptomyces sp. OUC6819遗传操作系统的建立

摘 要: 目的 建立南海红树林来源链霉菌Streptomyces sp. OUC6819菌株的遗传转化系统,通过基因阻断方法来研究次级代谢产物的生物合成途径。方法 分别以整合型载体pSET152和用于同源重组的、包含可能参与大环多烯类化合物生物合成的DNA片段的非复制型cosmid质粒,通过大肠杆菌—链霉菌属间接合转移导入Streptomyces sp. OUC6819之中。结果 通过在接合转移过程中对菌丝体进行超声破碎,成功获得了正确的接合子。采用PCR方法验证了pSET152的导入和目标基因orf1的阻断,进一步对突变株的发酵产物进行了HPLC分析,结果显示突变株丧失了合成大环多烯类化合物的能力。结论 成功建立了基于菌丝体超声破碎的海洋链霉菌遗传转化系统,为对其它基因进行遗传学操作奠定了基础,也为其它不便进行遗传操作的链霉菌提供了参考。     

多效调控基因wblAyo对海洋链霉菌Streptomyces youssoufiensis OUC6819次级代谢产物及形态分化的影响

目的 激活南海红树林来源的链霉菌Streptomyces youssoufiensis OUC6819中不表达或表达水平低的隐性基因簇,进一步挖掘新颖的次级代谢产物。方法 采用PCR-targeting策略敲除WhiB-like（Wbl）家族的wblAyo基因,通过HPLC分析野生株和突变株发酵产物的差异,检测发酵液粗提物和C18开放柱层析组分对5种多重耐药（MDR）菌（Staphylococcus aureus CCARM 3090, Salmonella typhimurium CCARM 8250, Escherichia coli CCARM 1009, Enterococcus faecium CCARM 5203,Enterococcus faecalis CCARM 5172）的抑制活性,通过固体平板实验和光学显微镜观察链霉菌形态分化的改变。结果 得到了正确的ΔwblAyo阻断突变株,HPLC分析结果表明：与野生株相比,突变株中化合物峰1和2分别提高了15.6和9.3倍;突变株发酵液粗提物和组分11对E. faecium CCARM 5203,E. faecalis CCARM 5172和S. aureus CCARM 3090的抗菌活性与野生株相比明显提高,而且突变株丧失了产生孢子的能力。结论 wblAyo参与了S. youssoufiensis OUC6819的次级代谢和形态分化过程。wblAyo的阻断激活了S. youssoufiensis OUC6819中抗MDR菌活性次级代谢产物的产生,为继续挖掘活性化合物提供了必要基础,还为其他海洋链霉菌中隐性基因簇的激活提供了参考。     

深海链霉菌 Streptomyces sp.OUCT16-23中放线菌素类次级代谢产物的研究

目的 对1株深海链霉菌Streptomyces sp.OUCT16-23的次级代谢产物进行研究,发现具有新颖化学结构和良好生物活性的化合物.方法 采用V6培养基对Streptomycessp.OUCT16-23进行发酵培养,经高效液相色谱(HPLC)纯化得到化合物1和2,并综合运用质谱(MS)、核磁共振(NMR)等波谱...     

海洋链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 1666活性代谢产物替达霉素A和B的发酵优化及分离鉴定

目的对南海海洋沉积物中分离的海洋放线菌进行体外抗肿瘤细胞和抗菌模型筛选,选取生物活性强的海洋链霉菌菌株Streptomyces sp.SCSIO1666进行发酵条件优化和活性产物的分离及结构鉴定。方法用针对6种NCI肿瘤细胞株A549、DU145、H1299、HCT15、HEP3B和SF268的体外抗肿瘤模型及其抑菌模型对提取物进行筛选,进一步优化发酵条件,采用HPLC-UV和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)抑菌活性追踪,利用有机溶剂萃取、正相硅胶和反相硅胶等各种色谱层析分离,通过理化性质和波谱数据分析进行结构鉴定。结果与结论从一株海洋链霉菌菌株Streptomyces sp.SCSIO 1666发酵产物中分离得到替达霉素A和B(TirandamycinsA and B),替达霉素A和B的生产对海盐的依赖程度较高,在不加盐的条件下产量极低,加3%粗海盐时,其发酵产量提高250倍以上,说明盐胁迫是海洋链霉菌菌株SCSIO1666产生活性物质的重要条件。替达霉素B是终产物,加入2%大孔吸附树脂发酵时,替达霉素A的产量得到明显提高。     

海洋芽孢杆菌B-9987中抗MDR菌活性成分研究

挖掘具有优良多重耐药菌(MDR)抗菌活性的次级代谢产物,为海洋新药研发提供分子多样性。方法 对海洋芽孢杆菌B-9987进行大发酵,将发酵产物进行提取分离,每一步分离过程进行MDR活性追踪。结果 B-9987粗提物对4株MDR菌(金黄色葡萄球菌CCARM 3090、沙门氏菌CCARM 8250、大肠杆菌CCARM 1009、粪肠球菌CCARM 5203)具有良好的抗菌活性。通过HPLC分离纯化及MS、NMR等波谱分析获得了化合物1(Macrolactin F)和化合物2(Bacillaene A)。化合物1对MDR菌没有抗菌活性。由于化合物2对光、温度、氧气十分不稳定,无法直接测试活性。对含有化合物2的组分进行活性测试,确定了B-9987的MDR菌抗菌活性来自于Bacillaene类化合物。结论 鉴定了B-9987中的抗MDR菌活性成分。     

海洋链霉菌Streptomyces sp. S598中抗菌活性产物的研究

目的 对海洋链霉菌Streptomyces sp. S598固体发酵提取物的抗菌成分进行研究。方法 采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20、反相柱色谱、硅胶柱层析及半制备HPLC等方法分离纯化该菌株的活性次级代谢产物,并通过ESI-MS、NMR等波谱技术结合文献对比鉴定其结构。结果 从10L固体发酵提取物中分离得到5个单体化合物,分别鉴定为缬氨霉素(1)、二活菌素(2)、亚油酸(3)、亚油酸甲酯(4)和油酸(5)。结论 海洋链霉菌Streptomyces sp. S598能代谢产生具有多种生物活性的化合物。化合物1对MRSA 28300和白念珠菌(ATCC10231)的MIC为1μg/mL,化合物2具有较强的广谱抗细菌活性,对肺炎链球菌、流感嗜血菌的MIC为0.125μg/mL,尤其具有显著的抗MRSA的活性,对MRSA 28300的MIC<0.125μg/mL。化合物1和2均为首次从该种放线菌中分离得到,且本文首次报道其对MRSA均具有抑制活性。     

海洋链霉菌Streptomyces sp. rssa2的次生代谢产物及其抗菌活性研究

目的 研究1株珊瑚来源的共附生链霉菌菌株Streptomyces sp. rssa2的次生代谢产物及其抗菌活性。方法 采用正相硅胶柱色谱、ODS反相硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱以及半制备高效液相色谱（HPLC）等手段对rssa2的发酵产物进行分离纯化,通过核磁、质谱数据并结合文献数据鉴定化合物结构;通过滤纸片法和稀释法对化合物的抗菌活性进行测定。结果 从海洋链霉菌Streptomyces sp. rssa2的液体麦芽提取物培养基发酵产物中分离得到3个主要成分,其结构分别鉴定为大环内酯类化合物aldgamycin G(1)、aldgamycin E(2)、swalpamycin(3)。抗菌活性测试结果显示,化合物1～3均对溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的生长具有弱抑制活性。结论 化合物1～3均为首次从珊瑚共附生链霉菌中分离获得,并且发现它们具有一定程度的抗菌活性,具有潜在的研究价值。     

一株海洋来源Streptomyces sp. SCSIO 1682中那西肽(nosiheptide)的分离鉴定及其生物合成基因簇分析

目的 对一株海洋来源的菌株SCSIO 1682进行16S rDNA分子生物学鉴定,对发酵产物中的抑菌活性化合物进行分离鉴定,并对抑菌活性化合物的生物合成基因簇进行分析。方法 通过构建基于16S rDNA序列的系统发育树来进行菌株鉴定;通过有机溶剂萃取、正相和反相硅胶层析等化学分离手段对菌株SCSIO 1682的次级代谢产物进行活性追踪分离纯化;运用HR-ESI-MS,₁H和₁₃C NMR等波谱手段对所得化合物进行结构解析;通过对菌株SCSIO 1682进行全基因组扫描测序鉴定所得化合物的生物合成基因簇。结果 该菌株被鉴定为Streptomyces sp. SCSIO 1682,所得抑菌活性化合物为那西肽,鉴定了那西肽的生物合成基因簇并进行生物信息学分析。结论 从海洋链霉菌Streptomyces sp. SCSIO 1682中分离鉴定了那西肽,那西肽生物合成基因簇的鉴定为利用组合生物合成和合成生物学技术对那西肽进行结构改造提供了新的基因资源。     

海洋链霉菌211726代谢产物的研究

目的对来自海洋环境的链霉菌211726(Streptomyces sp.211726)的代谢产物进行分离鉴定。方法采用大孔吸附树脂和硅胶柱色谱对链霉菌211726(Streptomyces sp.211726)的代谢产物进行分离,并通过理化性质及波谱学手段对所得化合物进行结构鉴定。结果与结论分离并鉴定了2个化合物:Nocardamine(1)及其铁络合物Ferrioxamine E(2),化合物2为首次从链霉菌中分得,化合物1、2为首次同时从同一微生物中分离获得。     

多烯大环内酯类抗生素—链霉菌FR—008代谢产物的研究

链霉菌ＦＲ－００８ 是一株抗生素产生菌。发酵液经萃取、大孔树脂吸附、分配层析等方法处理,从中获得了一种七烯大环内酯类抗生素,即抗生素ＦＲ－００８。ＨＰＬＣ分析研究表明,它与灰色链霉菌ＩＭＲＵ ３５７０产生的杀假丝菌素是同一种物质,均含有４个保留时间完全相同的主要组分。其中抗生素ＦＲ－００８ｂ 经核磁共振（ＮＭＲ）研究被证实为杀假丝菌素Ｄ;ＦＲ－００８ａ也经１Ｈ－ＮＭＲ的比较分析提出了它的可能结构。     

响应面法优化具有抑菌作用的链霉菌D-8菌株的发酵工艺研究

目的 采用响应面法(RSM)优化链霉菌D-8菌株产抑菌物质的发酵条件.方法 采用单因素试验确定由章鱼肠道获得的链霉菌D-8菌株产抑菌物质的最佳碳源与用量、NaC1浓度及培养时间.以金黄色葡萄球菌为指示菌,双层平板透明圈法测定发酵液的抑菌活性,采用响应面Box-benhnken试验设计,对链霉菌D-8菌株产抑菌物质的工艺条件进行优化.结果 建立了该菌株抑菌性随可溶性淀粉含量、NaCl浓度及培养时间变化的多项二次回归方程,得出该菌株产抑菌物质的最佳工艺条件是可溶性淀粉2.44％,氯化钠浓度3.50％,培养时间为100h,在此条件下,透明圈直径达到2.51cm,比优化前提高了2.21倍,与预测值(2.42cm)较为接近.结论实验结果表明预测模型可靠,用该模型对链霉菌D-8菌株的抑菌活性进行预测是可行的.     

云南美登木共生放线菌菌株3C产生的苯丙素类化合物

从云南美登木共生放线菌菌株3C的发酵提取物中分离得到两个苯丙素类化合物1和2.通过谱学特征鉴定了化合物的结构,其中,化合物2为新化合物.通过乙酰化反应得到了相应的乙酰化产物,并通过纸片扩散法测定了所有化合物的抗细菌活性.     

北极放线菌T-2-3胞外多糖体外抗氧化作用研究

为找外源性的自由基清除剂和抗氧化剂,课题对北极放线菌T-2-3胞外多糖(Arctic Streptomyces sp.extracellular polysaccharide,ASEP)的抗氧化能力进行了研究。通过测定总还原能力(T-AOC)、亚铁离子鳌合能力、超氧阴离子自由基(O2-.)清除能力、羟基自由基(.OH)清除能力和H2O2清除能力,对ASEP和进一步分离组分ASEP-3进行了抗氧化活性初步评价。此外,体外检测了ASEP和ASEP-3对.OH诱导的小鼠肝线粒体MDA生成影响,对H2O2引起的小鼠红细胞溶血的抑制作用及对.OH诱导的肝线粒体肿胀程度的影响。结果显示,ASEP具有一定的抗氧化活性,当ASEP和ASEP-3浓度为200μg/mL时,其对.OH的清除作用分别达到58.0%和99.5%,对O2-.的清除作用达到38.9%和74.2%,对H2O2的清除作用达到12.1%和20.4%,对H2O2引起的氧化溶血的抑制作用达到10.2%和22.8%,对小鼠肝线粒体脂质过氧化的保护作用达到7.9%和14.5%,均呈一定的量效关系,表明ASEP具有一定的抗氧化作用。     

云南美登木共生放线菌菌株1B1产生的一个新的angucycline抗生素

从云南美登木共生放线菌菌株 1B1的发酵提取物中分离得到了一个新的angucycline抗生素 ,并通过其谱学特征鉴定了化合物 1的化学结构。