P21真核表达载体的构建及其对HepG2细胞增殖的影响

目的:构建核定位信号突变型P21基因的真核表达载体并初步探讨其功能.方法:采用基因定点诱变技术获得核定位信号突变型P21基因.采用DNA重组技术,将突变型P21基因亚克隆至pDsRed1-C1真核表达质粒中,重组为pDsRed1-C1-P21NLS-.酶切鉴定及DNA测序,脂质体转染HepG2细胞,RT-PCR检测目的基因pDsRed1-C1-P21NLS-的表达,荧光显微镜观测目的基因亚细胞定位,台盼蓝拒染法检测质粒转染HepG2细胞生长曲线.结果:成功克隆了核定位信号野生型及突变型P21基因,成功构建TpDsRed1-C1-P21WT及pDsRed1-C1-P21NLS-重组质粒,酶切片段分别为4.7和0.5 kb,酶切鉴定正确,测序结果与GenBank核酸序列数据库比对表明,核定位序列中共9个核苷酸发生变异,由CGAAAACGG突变为GCGGCCGCG,测序成功.高效表达的红色融合蛋白,野生型主要定位于细胞核:而突变型主要定位于细胞质.野生型P21抑制HepG2细胞的生长;突变型促进HepG2细胞的生长,二者差异具有统计学意义(P<0.01).结论:P21的亚细胞定位,对HepG2细胞增殖影响具有明显差异.胞核P21抑制肿瘤生长,而胞质P21促进肿瘤生长.     

AKT靶向miRNA表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖侵袭的影响

目的构建靶向AKT基因的miRNA真核表达载体,观察其转染胃癌BGC-823细胞后对胃癌细胞增殖及侵袭的影响。方法设计并合成两条针对AKT基因的特异性miRNA干扰序列,与载体pcDNATM6．2-GW／EmGFP—miR连接,转化大肠杆菌,纯化并鉴定后转染BGC-823细胞,实时定量PCR及Westernblot技术鉴定重组体对AKT基因表达的干扰效果。使用M1Tr法检测细胞增殖能力,Transwell法检测细胞的侵袭能力。结果针对AKT基因的miRNA干扰质粒构建成功,BGC-825细胞转染该质粒后AKTmRNA及AKT蛋白表达明显受抑制,细胞增殖和侵袭能力均显著下降（P均〈0．05）。结论AKT靶向miRNA真核表达载体构建成功;其可有效抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力。     

VEGF基因沉默对肝癌HepG2细胞侵袭和迁移的影响

目的观察VEGF基因沉默对人肝癌细胞株HepG2迁移和侵袭的影响。方法采用siRNA技术沉默HepG2细胞内血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因。体外成功构建针对VEGF的3种siRNA表达载体和1个阴性对照,分别命名为pGenesil-1-VEGF-shRNA-1、2、3和pGenesil-1-VEGF-shRNA-scramble。Lipofectamine 2000介导转染HepG2,用RT-PCR筛选出沉默效果最好的siRNA片断(pGenesil-1-VEGF-shRNA-2),将其重组质粒转染HepG2(观察组),以空质粒细胞(空载组)和空白细胞(空白组)作为对照。采用细胞创伤愈合试验、Transwell小室体外侵袭试验分别检测三组细胞迁移、侵袭能力。结果细胞创伤愈合试验显示,观察组细胞迁移速度为(3.02±0.03)μm/h,显著慢于空载组的(8.67±0.02)μm/h和空白组的(8.78±0.03)μm/h,P均<0.05;细胞侵袭试验显示,观察组穿膜细胞数为(14.0±1.3)个,显著低于空载组的(35.0±2.3)个和空白组的(36.0±2.5)个,P均<0.05。结论 VEGF基因沉默可抑制肝癌细胞株HepG2的迁移和侵袭能力。     

丙泊酚对HepG2细胞基因表达差异的影响

目的分别用新、旧两型丙泊酚处理HepG2细胞后,筛选在HepG2细胞中存在表达差异的基因,以研究其是否影响细胞代谢及其差异。方法用新、旧两型丙泊酚及相应的脂肪溶剂处理HepG2细胞后,提取mRNA逆转录为cDNA,运用基因表达谱芯片方法分析差异表达的基因。结果基因表达谱芯片分析发现,旧型丙泊酚处理细胞后基因表达水平显著上调和下调的分别是88个和34个,而新型丙泊酚处理细胞后基因表达水平显著上调和下调的分别是59个和14个。结论筛选出新、旧两型丙泊酚处理HepG2细胞后差异表达的基因,提示新剂型丙泊酚可能对细胞代谢影响更小,并为相关的分子生物学机制研究提供了重要依据。     

RNAi对HepG2．2．15细胞HBx基因表达和细胞迁徙的影响

目的探讨HBx基因在肝细胞癌侵袭转移中的作用。方法利用psiRNA-hHlneo质粒，构建针对HBx基因的shRNA表达载体psiRNA1、psiRNA2、psiRNA3，并转染HepG2．2．15细胞，用逆转录聚合酶链反应检测shRNA对HBx基因mRNA表达，用免疫印迹法（western Blot）检测shRNA对HBx蛋白的表达。应用改良Boyden小室法测定细胞迁移情况。结果成功构建shRNA表达载体，其中shRNA载体psiRNA1对HBx基因的抑制作用最强，对HBxmRNA抑制率达82．46％，对HBx蛋白的抑制率为65．59％；与空载体转染细胞比较，HepG2．2．15细胞在psiRNA1转染后24h、72h迁移率显著下降。结论HBx基因可能促进HCC的侵袭转移。     

构建shRNA真核表达载体抑制人COX-2的表达

目的构建编码人环氧合酶-2(COX-2)mRNA的shRNA真核表达载体质粒,特异性抑制人COX-2的表达。方法以人COX-2mRNA编码区中2条不同序列作为RNA干扰靶点,分别构建2个shRNA真核表达载体质粒,WBH1和WBH2,进行酶切鉴定和测序。用脂质体转染人胃癌细胞系SGC-7901,RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果。结果WBH-1高效特异地抑制了人COX-2的表达,抑制率达70.42%;而WBH-2未产生抑制效果。结论通过构建COX-2的shRNA真核表达载体导入细胞可以有效地抑制人胃癌细胞中COX-2的表达,其抑制效果与靶点的选择高度相关。     

吴茱萸碱对肝癌HepG2细胞侵袭和迁徙的影响

目的:研究吴茱萸碱对人肝癌细胞Hep G2细胞外调节蛋白激酶(extracellular-regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)表达的影响.方法:Transwell小室检测吴茱萸碱对Hep G2细胞侵袭及迁徙的影响.集落形成实验检测吴茱萸碱对Hep G2细胞集落形成能力的影响.Western blot检测Hep G2细胞ERK1/2、phospho-ERK1/2(P-ERK1/2)蛋白.结果:吴茱萸碱5、25、50μmol/L作用后,H e p G 2细胞侵袭细胞数分别为3 2.3个±1.3个、22.3个±2.5个、10.6个±3.7个,对照组为97.6个±6.3个,差异有统计学意义(P<0.05);迁徙细胞数为57.7个±3.2个、26.8个±1.6个、15.4个±3.9个,对照组为106.3个±3.2个,差异有统计学意义(P<0.05).5、25、50μmol/L吴茱萸碱作用Hep G2细胞集落形成数分别为147.0个±12.1个、94.3个±4.0个、0个,对照组为231.3个±15.4个,差异有统计学意义(P<0.05).Western blot分析5、25、50μmol/L吴茱萸碱处理Hep G2细胞24 h及30μmol/L吴茱萸碱处理Hep G2细胞24、48 h后,ERK1/2蛋白的表达无明显变化,但其活化形式P-ERK1/2蛋白的表达量减少.结论:吴茱萸碱可显著抑制人肝癌Hep G2细胞侵袭和迁徙及克隆增殖能力,其机制可能与吴茱萸碱抑制ERK1/2蛋白活化有关.     

RNAi技术沉默Bcl-xL基因表达对食管癌细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨RNA干扰（RNAi）技术沉默Bcl-xL基因表达对食管癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法将Bcl-xL小干扰RNA（siRNA）转染食管癌EC109细胞,分别采用荧光实时定量RT-PCR和Western blot方法检测食管癌细胞Bcl-xL mRNA和蛋白,采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型检测癌细胞增殖和侵袭力。结果与对照组相比,siRNA转染组细胞Bcl-xL mRNA和蛋白水平明显下调（P均〈0.05）,所形成的软琼脂集落数和穿膜细胞数明显减少（P均〈0.05）,并均呈浓度依赖性。结论采用RNAi技术沉默Bcl-xL基因表达,可抑制食管癌细胞的增殖和侵袭能力。     

苦参碱对人肝癌细胞株HepG2基因表达谱的影响

目的利用基因表达谱芯片研究苦参碱对体外培养的人肝癌细胞株HepG2基因表达谱的影响。方法苦参碱处理人肝癌细胞株HepG272h后，提取研究组和对照组细胞的总RNA，将两组RNA纯化为mRNA，逆转录成cDNA，用Cy3和cy5两种不同的荧光染料进行线性扩增标记，与人全基因组基因表达谱芯片杂交，采用生物信息学方法分析两组细胞基因表达谱的改变。结果用Panther生物学软件分析，总共发现差异基因385个，其中上调基因133个，下调基因252个，并对其进行生物学功能分类。结论应用全基因组表达谱芯片检测差异表达基因，苦参碱可改变人肝癌细胞株HepG2细胞基因谱，可以通过调控凋亡基因的表达，诱导HepG2细胞发生凋亡。     

蛋白激酶B短发夹环RNA表达载体的构建及其对血管平滑肌细胞增殖活性的影响

目的构建靶向蛋白激酶B基因的短发夹环RNA表达载体,观察其对血管平滑肌细胞增殖活性的影响。方法设计多个针对大鼠蛋白激酶B基因的短发夹环RNA序列,化学合成方法合成并经pGEM-T载体克隆后双酶切,将cDNA序列插入逆转录病毒载体pLXIN,包装后获得蛋白激酶B的逆转录表达载体,感染血管平滑肌细胞,Northern blot和Western blot法检测蛋白激酶B及其下游底物的表达变化,流式细胞仪检测细胞周期变化,MTT法检测血管平滑肌细胞增殖活性的改变。结果成功构建蛋白激酶B基因的逆转录病毒载体并包装,感染血管平滑肌细胞,证实其能显著抑制蛋白激酶B的mRNA和蛋白产物表达,下游的p70s6k表达相应减少;被感染血管平滑肌细胞的分裂、增殖过程受阻,更多细胞停滞在G0/G1期。结论成功构建蛋白激酶B基因逆转录病毒RNA干扰表达载体,感染血管平滑肌细胞能够明显抑制其分裂、分化和增殖。     

GPC-3特异性短发夹型RNA干预基因转录对肝癌细胞增殖与凋亡的影响

目的观察磷脂酰肌醇蛋白多糖（GPC）-3基因特异性短发夹型RNA（shRNA）对HepG2细胞增殖的抑制作用。方法设计、合成和筛选GPC-3特异的高抑制率shRNA并构建质粒;观察shRNA沉默GPC-3基因对肝癌细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。结果成功构建了4种GPC-3 shRNA干扰质粒,以脂质体介导分别转染HepG2细胞后,筛选出的shRNA干扰质粒抑制率最高达89.3%;以该高效GPC-3 shRNA质粒转染HepG2细胞24h、48h和72h后,细胞增殖较对照组分别下降了33.2%、56.0%和71.1%（P〈0.05）,细胞多被阻滞在G1期;HepG2细胞凋亡率达65.6%,显著高于对照组（约为5%,P〈0.05）。结论 GPC-3特异性的shRNA可有效降低HepG2细胞中GPC-3基因转录水平,抑制增殖并促进其凋亡。因此,GPC-3可望成为肝癌基因治疗的靶目标。     

miRNA沉默缺氧诱导因子1α基因对HepG2细胞增殖的抑制作用

目的 探讨以miRNA沉默缺氧诱导因子1 α(HIF-1 α)基因,观察其对肝癌细胞株(HepG2细胞)增殖的抑制作用.方法 构建靶向HIF-1 α基因miRNA干扰载体,转染HepG2细胞,以定量PCR和Western blot分析靶基因和蛋白的表达;构建含缺氧反应元件双荧光素酶报告基因检测转染后相对光单位值;酶联免疫吸附法定量检测血管内皮生长因子和血管生成素2的表达;细胞凋亡及增殖周期以流式细胞仪和膜联蛋白/碘化丙啶(V-FITC/PI)双重染色法分析.采用t检验和两因素方差分析及q或q'检验分析计量资料.结果 HepG2细胞在转染HIF-1 αmiRNA后72 h,HIF-1 α在转录和翻译水平上分别下降87%和56%双荧光素酶报告基因减少46%,血管内皮生长因子和血管生成素2分别减少54%和36%;癌细胞凋亡率为22.46%±0.61%(P＜0.01),G1和S期比例分别为61.49%±1.12%和22.40%±0.58%;联合阿霉素处理后,凋亡率增至36.99%±0.88%,G1、S期比例分别为65.68%±0.91%和19.47%±1.34%.结论 HIF-1 α miRNA可抑制HIF-1 α基因表达,联合阿霉素有效调控肝癌细胞周期,促进凋亡、抑制增殖.

Abstract：

Objective To investigate the effect of miRNA silencing HIF-1 α gene on the proliferation of HepG2 cells. Methods The eukaryotic expression plasmids of HIF- 1α miRNA and report gene containing hypoxia-reponse element were constructed and trasnfected into HepG2 cells. The expressions of HIF-1 α gene and protein were determined by real time-PCR and Western blotting. The expressions of HIF1 α, vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiopoietin-2 (Ang-2) were quantitatively detected by ELISA. The alterations of cell cycles and apoptosis rate were quantitatively measured by flow cytometry and Annexin V-FITC/PI double dyeing assay. Results 72 h after transfection the downregulations of HIF-1 α mRNA and protein were 87% and 56% respectively, and the decrease of target gene was 46% in the report gene, 54% in VEGF and 36% in Ang-2, respectively. The apoptotic ratio of HepG2 cells was 22.46 ± 0.61%(P ＜ 0.01). The cell cycle changed greatly at the ratio of G1 (61.49 ± 1.12%) and S (22.40 ± 0.58%, P ＜0.01). After being combined with doxorubicin, the apoptotic ratio increased to 36.99 ± 0.88% and the ratios of G1 and S phases were upregulated to 65.68 ± 0.91% and 19.47 ± 1.34% respectively. Conclusion HIF-1α miRNA or / and doxorubicin can regulate the growth cycles of HepG2 cells, promote the cell apoptotosis and inhibit the cell proliferation.     

胞内氯离子通道蛋白1基因沉默对小鼠肝癌细胞株增殖及侵袭能力的影响

目的 合成和筛选有效抑制细胞内氯离子通道蛋白1 (CLICl) 基因的shRNA序列,构建表达质粒,并进一步研究CLIC1基因的表达被抑制后小鼠肝癌细胞株Hca-F细胞增殖及侵袭能力的变化.方法 设计并合成3条理论上最佳的siRNA序列,进而将相应的双链DNA插入pGPU6/GFP/Neo质粒中,以脂质体Lipofectamine 2000将DNA质粒稳定转染至小鼠Hca-F细胞中,收取细胞进行逆转录多聚酶链反应分析各组的CLIC1 mRNA表达水平,选出最佳干扰序列.应用细胞计数试剂盒检测最佳干扰序列表达质粒稳定转染的Hca-F细胞,对比观察其干扰前后增殖情况的变化;应用transwell小室检测其侵袭能力的变化.对研究数据应用统计学软件SPSS13.0进行方差分析.结果 靶向CLIC1 mRNA的3个shRNA重组质粒载体经测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致.经酶切凝胶电泳证实载体构建成功.稳定转染pGPU6/GFP/Neo-shRNA-3表达质粒的Hca-F细胞对其CLIC 1 mRNA抑制效果明显,抑制率达42.4%.经该表达质粒的干扰后,Hca-F细胞的增殖能力明显增强,侵袭能力显著下降,空白对照组、无关序列处理组、shRNA干扰组的穿膜细胞个数分别为98.93±5.00、96.27±2.60、50.73±3.89,P值均<0.01.结论 pGPU6/GFP/Neo-shRNA-3表达质粒能高效地抑制小鼠Hca-F细胞中CLIC1 mRNA的表达,CLIC1基因具有抑制小鼠肝癌细胞的增殖和促进其侵袭的作用.     

MCFP慢病毒干涉载体及HepG2稳定细胞系的构建

目的:研究线粒体转运蛋白质超家族新成员SLC25A40(MCFP)RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体对人肝癌细胞系HepG2细胞中MCFP基因的沉默效果.方法:通过RNAi序列设计软件进行MCFP干涉片段设计,筛选出MCFP基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA,构建pSiCoR-MCFP慢病...     

鸟嘌呤核苷酸抑制因子2基因表达与肝癌细胞迁移和侵袭能力的关系

目的:探讨鸟嘌呤核苷酸抑制因子2(RhoGDI2)对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。方法:选取肝癌细胞株HCCLM3细胞,随机分为对照组、空白转染组和shRNA转染组,其中空白转染组转染空白质粒,shRNA转染组转染RhoGDI2-shRNA,采用MTT法检测各组细胞增殖,Transwell试验检测各组细胞迁移及侵袭能力,qRT-PCR检测各组细胞RhoGDI2 mRNA表达,Western blot检测各组细胞MMP-9、pAKT和VEGF表达。结果:shRNA转染组细胞RhoGDI2 mRNA相对表达量为(0.201±0.082),明显低于对照组和空白转染组(P<0.05);shRNA转染组细胞培养6 h、12 h和24 h时OD值分别为(0.312±0.110)、(0.562±0.107)和(0.700±0.110),明显低于对照组和空白转染组(P<0.05);shRNA转染组细胞迁移率和穿膜细胞数分别为(0.310±0.030)%和(9.28±1.11)个,明显低于对照组和空白转染组(P<0.05);shRNA转染组细胞MMP-9、pAKT和VEGF相对表达量分别为(0.762±0.100)、(0.201±0.092)和(0.501±0.101),明显低于对照组和空白转染组(P<0.05)。结论:下调RhoGDI2表达,可抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力,值得进一步研究。     

siRNA抑制survivin基因及其对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响

目的观察特异小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）抑制survivin基因表达对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响。方法构建survivin-siRNA真核表达载体,利用脂质体转染人肝癌HepG2细胞,采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测survivin基因mRNA表达水平。针对转染后不同的时间点采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞的增殖以及HepG2细胞的凋亡情况。结果构建的survivin-siRNA转染组survivin蛋白表达较对照组明显下调,差异有显著性（P〈0.01）,其增殖能力较对照组显著下降（P〈0.001）;而阳性对照组及未转染组对survivin表达及mRNA抑制作用不明显（P=0.219）。结论所构建的针对人survivin-siRNA可显著抑制survivin的表达及HepG2细胞凋亡。     

miR-21对HepG2细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响*

目的 研究miR-21对HepG2 细胞增殖和凋亡的影响并探讨其可能的分子机制。方法 体外培养HepG2细胞,并将细胞分为增强组、抑制组和对照组,分别给予Lipofectamine 2000和Hsa-miR-21 mimics （50 nm/L）、Lipofectamine 2000和Has-miR-21 inhibitor（100 nm/L）转染或者给予Lipofectamine 2000处理干预。采用Western blot法检测B细胞异位基因2（BTG2）蛋白表达,采用CCK-8法检测细胞增殖,使用流式细胞术（FCM）检测细胞周期和凋亡变化。结果 增强组细胞BTG2 蛋白表达水平最低,抑制组细胞BTG2 蛋白表达水平最高,对照组细胞BTG2蛋白表达水平强于增强组而低于抑制组,组间差异比较有统计学意义（P<0.05）;抑制组细胞增殖率较增强组和对照组明显降低（P<0.05）,增强组较对照组明显增强（P<0.05）;与增强组或对照组比,抑制组细胞周期S期明显减少（P<0.05）,而G2期则明显增多（P<0.05）,与对照组比,增强组S期明显增加,而G2期明显较少（P<0.05）;与增强组和对照组比,抑制组细胞凋亡率显著增加（P<0.05）,而与对照组比,增强组细胞凋亡率显著减少（P<0.05）。结论 miR-21可能通过直接靶向调控BTG2表达而影响HepG2细胞的生长,可能成为干预肝癌生长的新途径。     

沉默RET基因表达对甲状腺髓样癌细胞增殖的影响

目的 研究沉默RET基因表达对人甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma,MTC)细胞系TT细胞增殖的影响及其机制.方法 将含RET的双链DNA克隆入pSileneerTM 3.1-H1 neo真核载体,构建pSilencer-ret重组质粒,以脂质体转染高表达RET的TT细胞.实时定量PCR和Western印迹法检测RET mRNA和蛋白的表达,以及细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化水平,CCK-8法测定细胞增殖.结果 质粒测序证实重组质粒构建成功,转染后能明显抑制TT细胞RET mRNA和蛋白的表达,抑制细胞的增殖(P＜0.05),ERK磷酸化水平降低62.4%.结论 构建的pSilencer-ret重组质粒能有效地降低人MTC细胞RET的表达,抑制细胞增殖,与其降低ERK通路的信号转导有关,为MTC的基因治疗提供新策略.     

miR-363靶向调控E2F3表达影响HepG2细胞增殖和凋亡研究*

目的 探讨微小RNA-363（miR-363）靶向调控E2F转录因子3（E2F3）的表达对HepG2细胞增殖和凋亡的影响。方法 体外培养HepG2细胞,采用Lipofectamine法将miR-363抑制剂或其阴性对照转染到HepG2细胞,继续培养48 h,收获细胞,采用四噻唑蓝（MTT）法测定细胞增殖率,使用流式细胞术法检测细胞凋亡率,采用实时荧光RT-PCR法检测HepG2细胞miR-363 mRNA水平,采用Western Blot法检测HepG2细胞E2F3、BAX和Caspase-3蛋白表达水平。结果 对照组HepG2细胞增殖率为（96.4±9.7)%,显著高于抑制剂处理组【（72.3±6.5）%,P<0.05】,凋亡率为（8.2±1.4）%,显著低于抑制剂处理组【（9.7±0.8）%,P<0.05】;对照组HepG2细胞miR-363 mRNA相对水平为（1.0±0.1）,显著高于抑制剂处理组【（0.6±0.2）,P<0.05】,E2F3蛋白表达量为（1.0±0.1）,显著高于抑制剂处理组【（0.6±0.1）,P<0.05】,而对照组HepG2细胞Bax和Caspase-3蛋白表达量分别为（0.4±0.0）和（0.5±0.1）,均显著低于抑制剂处理组【（0.6±0.1）和（0.7±0.0）,P均<0.05】。结论 miR-363可靶向调控E2F3的表达,抑制HepG2细胞增殖,诱导其凋亡。本研究结果为肝癌靶向治疗提供了一定的理论依据。