胚胎与成人视网膜神经细胞培养

目的 建立胚胎及成人视网膜神经细胞体外培养系统，为视网膜神经细胞的基础研究与药物开发提供实验模型。 方法 10～13周龄胎儿及20～40岁成人视网膜神经层用不同的酶进行消化，分散的细胞接种于预先经过包被的细胞培养盘内，加入或不加入表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor, BDNF)、神经营养素 4(neurotrophic-4，NT-4)等培养。通过BrdU掺入、免疫组织化学及免疫荧光等方法检测培养细胞增殖并辨别细胞成分。 结果 胚胎及成人视网膜细胞可在体外连续培养100及180 d以上。加入EGF、FGF、BDNF或NT-4可明显促进胚胎与成人视网膜神经元存活，胎儿视网膜细胞增殖。与对照组相比，处理组神经元或神经节细胞的百分率较高。 结论 胚胎及成人视网膜神经细胞培养技术为视网膜神经细胞基础研究及药物开发提供了一种十分有价值的手段，加入外源性的生长因子可促进培养的视网膜神经细胞存活、增殖与分化。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 279-282)     

全细胞膜片钳技术在视网膜神经元电压门控离子通道研究中的应用

了解视网膜各种神经元神经电信号特点、产生机制及影响因素，对从功能角度评价视网膜神经细胞培养状态和移植效果具有重要意义。本介绍一种先进的电生理学研究方法－全细胞膜片钳法在视网膜神经生理学中的应用，以及通过该方法对视网膜神经节细胞、双极细胞、水平细胞和无长突细胞部分电压门控离子通道进行研究所取得的进展。     

体外无血清培养新生SD大鼠视网膜神经细胞

目的 采用无血清培养建立新生SD大鼠视网膜神经细胞的体外培养方法,为视网膜神经细胞的体外实验研究奠定基础.方法 取出生后3～5d的SD大鼠视网膜,用胰蛋白酶消化分离获取细胞悬液,使用无血清神经原培养基(Neurobasal TM-A Medium)和添加剂B-27 Supplement Minus AO进行培养.倒置相差显微镜观察细胞形态及轴突生长情况.培养至第5天,用抗微管相关蛋白2抗体、抗视紫红质蛋白抗体及抗胶质纤维酸性蛋白抗体,行免疫细胞化学鉴定并计算视网膜视杆细胞的纯度.结果 采用无血清法培养的视网膜神经细胞生长良好,细胞伸出突起,部分神经元的突起交织呈网状.生长至第5天经免疫细胞化学证实其中神经元细胞占95.6％,而38.6％为视网膜视杆细胞,同时神经胶质细胞的生长得到了很好地抑制.结论 无血清培养法可以获取纯度较高的视网膜神经细胞,为研究视网膜光感受器细胞提供了理想的体外实验模型.     

银杏叶提取物对培养大鼠视网膜神经细胞的保护作用

目的 观察银杏叶提取物（EGb761）对大鼠视网膜神经细胞线粒体膜电位（MMP）的影响及其对抗谷氨酸兴奋性毒性对视网膜神经细胞的保护作用。方法培养视网膜神经细胞，用Rhodaminel23标记培养7d的视网膜神经细胞线粒体，分为正常对照组、EGb761组、符氨酸组以及EGb761＋谷氨酸组，共聚焦激光显微镜动态检测MMP的变化。结果与正常对照组比较谷氨酸组MMP下降；EGb761组MMP及EGb761＋谷氨酸组MMP升高，P〈0．01。结论EGb761可能通过升高视网膜神经细胞MMP的途径影响线粒体的功能；并且可对抗谷氨酸兴奋性毒性，保护视网膜神经细胞。     

成年人视网膜神经细胞体外培养的实验研究

目的建立成年人视网膜神经细胞的体外培养体系,研究细胞体外生长特性和结构特点。设计实验性研究。研究对象体外培养的成年人视网膜神经细胞。方法以成年人视网膜为研究对象,进行体外细胞培养;取培养7～10天的细胞行免疫组织化学鉴定;取培养10天的细胞行扫描电镜超微形态学检查。主要指标细胞形态,结构。结果在适宜的条件下,成年人视网膜神经细胞可以在体外培养并表现特有的结构特点和生长特性,免疫组化鉴定显示大部分细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性,说明所培养细胞大部分为神经细胞。扫描电镜下观察贴壁伸展生长细胞主要为感光细胞、双极细胞、水平细胞等神经细胞和少量胶质细胞。结论在适宜的培养条件下,成年人视网膜神经细胞可以在体外进行培养并且表现出良好的生长活性。     

培养的胚胎视网膜神经细胞Ca2+分布与Ca2+通道特征

目的 检测分析培养的胚胎早期视网膜神经细胞游离钙（Ca^2 )分布与钙（Ca^2 ）通道特征。方法 体外培养11－15周胎儿视网膜神经细胞，在含Ca^2 与不含Ca^2 的Hepes缓冲液中与钙荧光指示剂Fluo3孵育染色，同时加入或不加入异博定、佩尔地平或地塞米松，共聚焦显微镜观察记录游离Ca^2 分布，以及受不同浓度K^ 刺激后Ca^2 通道开放与Ca^2 转移情况。结果 培养的11－15周胎儿视网膜神经元及神经胶质细胞受K^ 刺激后均出现明显的Ca^2 转移与再分布，在缺乏细胞外Ca^2 的情况下，细胞浆内钙库仍可迅速释放Ca^2 并转移至细胞核内。异博定、佩尔地平及地塞米松能够抑制细胞外Ca^2 进入视网膜神经细胞内。结论 胚胎早期视网膜神经元及神经胶质细胞存在L型Ca^2 通道，并已基本发育成熟。     

大鼠视网膜神经细胞的原代培养

目的:在前人建立的方法上优化SD大鼠视网膜神经细胞体外培养的技术和方法,为后续研究提供实验基础。方法:使用胰酶消化法分离新生1～3dSD大鼠视网膜神经细胞,以DMEM/F12为培养基体外培养,免疫组织化学染色的方法进行鉴定。结果:观察光镜下培养的细胞贴壁生长,部分细胞伸出突起,且有些突起相互连接。免疫细胞化学染色显示,培养的细胞大多数抗神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)抗体反应阳性。结论:视网膜神经细胞体外培养成功为进一步进行视网膜疾病的研究创造了条件。     

成人视网膜神经细胞的原代培养和初步鉴定

目的建立成人视网膜神经细胞培养系统，为深入研究视网膜细胞及观察药物作用提供基础。方法采用组织块培养法，以含100g·L^-1 FBS的IMDM作为细胞培养液，培养成人视网膜细胞，对培养7—10d的细胞进行初步细胞鉴定。结果体外培养成人视网膜细胞原代培养可达80d左右，早期培养的细胞中视网膜神经细胞占65％左右，其中可见多数带有外节段的感光细胞。结论这种培养方法提供的视网膜细胞早期主要以神经细胞为主，可用于视网膜神经细胞的药物作用研究。     

全细胞膜片钳技术在视网膜神经元电压门控离子通道研究中的应用

了解视网膜各种神经元神经电信号特点、产生机制及影响因素 ,对从功能角度评价视网膜神经细胞培养状态和移植效果具有重要意义。本文介绍一种先进的电生理学研究方法———全细胞膜片钳法在视网膜神经生理学中的应用 ,以及通过该方法对视网膜神经节细胞、双极细胞、水平细胞和无长突细胞部分电压门控离子通道进行研究所取得的进展     

培养鼠视网膜神经细胞的腺苷/腺苷酸受体研究

目的 检测体外培养鼠视网膜神经细胞上腺苷/腺苷酸受体的存在，方法 先进行兔视网膜Mueller细胞培养，而后依此细胞作基质培养鼠视网膜神经细胞，应用自由钙指示剂Fura-2AM及ARGUS-100系统，监测不同条件下细胞内自由钙的变化，从而确定腺苷/腺苷酸受体的存在。结果 1.0μmol/LATP可引起多量神经细胞内自由钙的变化，A2，P2x,P2y受体激动剂在不同浓度下也各自具有类似的作用。此作用不能被电压依赖性钙通道阻滞剂所抑制。结论 培养的视网膜神经细胞上具有A2，P2x,P2y的受体，表明ATP及去磷酸代谢物可能在视网膜功能活动中具有重要的神经介质功能。     

视网膜Muller细胞在视网膜病变中的作用和研究现状

视网膜Muller细胞是视网膜内最主要的神经胶质细胞，它贯穿整个视网膜，包绕与联系视网膜上的各类神经细胞，从而与视网膜神经细胞发生多种功能的交互作用。Muller细胞不仅起着支持和营养神经元的作用。还包括维持细胞外离子的稳定及参与谷氨酸盐循环，突触传递等作用。近年来。随着对视网膜Muller细胞的深入研究，发现Muller细胞还参与多种病理和生理过程，并且在视网膜的各种疾病中都发现伴有Muller细胞的神经胶质增生反应。对视网膜Muller细胞的形态和生理功能作了描述和分析，并对在各种病理状态下Muller细胞发生的改变和目前对Muller细胞的研究现状作一综述。     

SD大鼠视网膜神经细胞培养上清液对胚胎干细胞体外分化的诱导作用

目的 探讨视网膜神经细胞培养的上清液对胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES）体外分化的诱导作用。 方法 收集SD大鼠视网膜神经细胞培养上清液，抽滤后按2∶3比例与DMEM培养液混合，用该混合液进行ES 细胞的诱导分化，每天倒置相差显微镜观察ES细胞的生长及分化情况,对诱导分化后的细胞进行神经丝蛋白(nellcofilament protein，NFP)免疫组织化学检查。 结果 加入了视网膜神经细胞培养上清液的ES细胞生长出类似神经细胞突起样结构，NFP免疫组织化学染色阳性。 结论 SD大鼠视网膜神经细胞培养的上清液具有诱导ES细胞向神经细胞分化的作用。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 134-136)     

神经营养因子和生长因子等对培养的成人视网膜神经细胞的影响

目的　探讨成人视网膜神经细胞体外培养条件 ,脑源性神经营养因子 (BDNF)、神经营养素 (NT 4 )、表皮生长因子 (EGF)、成纤维细胞生长因子 (FGF)、诱导分化因子全反式视黄酸 (RA)等对成人视网膜神经细胞生长、增殖、凋亡的影响及调控机制。方法　胰蛋白酶消化结合机械吹打分离成人视网膜神经细胞 ,在培养基中加入或不加入BDNF、NT 4、EGF、FGF、RA。根据细胞形态、生长方式及免疫细胞化学特征确定细胞类型。比较各组中神经元的数目、转录调控因子c fos、c jun及细胞凋亡调控因子Bcl 2、Bax表达水平。结果　与对照组相比 ,BDNF、FGF处理组存活的神经元特异性烯醇酶、Thy1.1抗体和Bcl 2、c fos及c jun表达阳性细胞数也增多 (均P <0 0 1) ,培养的视网膜神经细胞在体外存活时间可长达 8个月 ;RA处理组c fos、c jun阳性细胞数较对照组增多 (均P <0 0 1) ;而NT 4、EGF处理组各项指标与对照组比较 ,差异无显著意义 (均P >0 0 5 )。结论　BDNF、FGF、RA能显著提高体外培养的成人视网膜神经细胞的存活 ,其机制可能涉及上调转录调控因子c fos、c jun及凋亡抑制因子Bcl 2的表达 ,或下调凋亡促进因子Bax的表达。但EGF、NT 4对体外培养的视网膜神经细胞存活状态无明显改善作用。     

N-甲基-D-天冬氨酸及其非竞争性受体阻滞剂和钙离子对培养的鼠视网膜神经细胞的作用

目的　探讨N 甲基 D 天冬氨酸 (N methyl D aspartate,NMDA)及其非竞争性受体阻滞剂(MK80 1)和Ca2 + 对培养的鼠视网膜神经细胞的作用及其相互间的关系。方法　取生后 1～ 3d鼠龄的Sprague Dawley(SD)乳鼠视网膜作为原代视网膜神经细胞进行体外培养 ,对培养 7d的视网膜神经细胞经抗神经丝蛋白 (neurofilamentprotein ,NF)、Thy1 1及抗胶质纤维酸性蛋白 (glialfibrillaryacidicprotein ,GFAP)单克隆抗体进行鉴定 ,同时在培养 7d的神经细胞中单独及联合加入NMDA、MK80 1和Ca2 + ,锥虫蓝拒染 ,计算细胞活性。结果　 2 0 0 μmol/L的NMDA及 10mmol/L的Ca2 + 所致视网膜神经细胞失活与对照组比较 ,差异有显著意义 (F =2 6 0 91;P =0 0 2 5 ,P <0 0 0 1) ,2 0 μmol/L的MK80 1对视网膜神经细胞的影响不明显 ,对Ca2 + 所致细胞毒性无保护作用 ,但可阻断NMDA的作用。结论NMDA、一定浓度的Ca2 + 对培养的视网膜神经细胞有毒性作用 ,MK80 1可阻断NMDA的毒性作用 ,但对Ca2 + 的毒性无阻断作用 ,Ca2 + 致神经元死亡可能还有其他途径     

小鼠视网膜神经细胞在不同培养模式中的形态表现

目的:观察不同培养环境对小鼠视网膜神经细胞的影响。方法:分别培养新生小鼠的视网膜神经细胞和色素上皮细胞,并纯化培养视网膜神经节细胞,将纯化和未纯化的视网膜神经细胞分别与视网膜色素上皮细胞接触和分层共培养,相差显微镜观察视网膜神经细胞在不同培养模式中的表现。结果:混合培养的视网膜神经细胞较纯化培养的神经节细胞生存时间长,突触联系多。与视网膜色素上皮细胞共培养时,神经细胞的存活时间进一步延长,突触联系增多,但是神经细胞在与视网膜色素上皮细胞分层和接触共培养的两种模式中,显示出了不同的细胞形态。结论:视网膜神经胶质细胞和视网膜色素上皮细胞不但对神经节细胞具有滋养作用,细胞间的立体结构关系可能还影响着细胞的成熟分化。     

新生大鼠视网膜神经元及节细胞体外短期培养方法

目的　建立新生大鼠视网膜神经元原代培养体系 ,观察视网膜神经元和神经节细胞 (retinalganglioncells,RGC)在体外短期培养的生长特点。方法　将新生大鼠视网膜细胞悬液接种于预先用鼠尾胶原包被的 96孔细胞培养板中 ,按 4 0 0× 10 3 ·cm-2 (高密度 )及 2 0 0× 10 3 ·cm-2 (低密度 ) 2种密度接种 ,抑制非神经元生长 ,MTT比色法评价细胞活力 ;上述细胞悬液按高密度接种于 2 4孔细胞培养板中 ,进行HE染色和Thy1单克隆抗体的免疫化学染色 ,测量视网膜神经元和RGC轴突的长度。结果　视网膜神经细胞有聚集成簇生长的倾向 ,细胞活力在高密度培养时明显高于低密度培养 ;第 3天细胞活力最高 ;视网膜神经元在体外形态多样 ,最初 2d轴突生长速度最快 ,超过 12 .0 μm·d-1;大多数RGC从第 1天就再生出 2个或 2个以上的突起 ,第 1天的平均轴突长度为 12 .5 μm·d-1,从第 2天起保持在8 0 μm·d-1。第 4天的平均轴突长度为 2 9.4 5 μm。结论　以鼠尾胶原为支持物 ,经过酶消化法得到的新生大鼠视网膜神经元 ,包括RGC ,能够在短期内表现出较高的细胞活力并再生出较长的轴突 ;高密度培养 ( 4 0 0× 10 3 ·cm-2 )更有利于视网膜神经元在体外生长存活。     

乳鼠视网膜细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为视网膜神经节样细胞

目的 探讨乳鼠视网膜细胞对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的诱导分化作用.方法 从出生8 d的大鼠骨髓中分离培养BMSCs,同时培养乳鼠视网膜神经细胞.在Transwell双层培养体系下,利用乳鼠视网膜细胞诱导BMSCs,诱导后细胞经RT-PCR及免疫荧光鉴定.结果 加入乳鼠视网膜细胞共培养第7 d有神经元样细胞形成,经nestin、NF、β-III Tubulin、Thy1.1行免疫组织化学、RT-PCR、免疫荧光鉴定,细胞呈阳性反应.结论 BMSCs在体外培养条件下,经过新生乳鼠视网膜细胞诱导,可以分化为视网膜神经节样细胞.     

B族维生素对体外培养大鼠视网膜神经细胞及节细胞的神经营养作用

目的评价维生素B1、B6、B12及其衍生物甲钴胺对视网膜神经细胞及神经节细胞(RGCs)的生存和轴突再生伸长的影响。方法采用新生大鼠视网膜神经细胞体外原代培养技术，与不同浓度的B族维生素共同培养，MTT比色法检测细胞活力，进行HE染色和抗Thy1免疫细胞化学染色，测量视网膜神经细胞和RGCs轴突长度，比较各种维生素对细胞轴突伸长的影响。结果维生素B1、B6、B12和甲钴胺的最有效作用浓度分别为100、100、1．0、1．0μmol／L；高密度培养该营养作用更明显。用该浓度作用于细胞，维生素B6、B12和甲钴胺可促进视网膜神经细胞和RGCs轴突伸长。结论B族维生素在体外短期内能够显著提高视网膜神经细胞和RGCs的活力，促进上述细胞轴突再生伸长。     

色素上皮衍生因子对糖尿病视网膜病变神经细胞的保护作用

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）是糖尿病眼部最严重的并发症,诸多研究表明,在糖尿病早期即已发生视网膜神经元损害,逐渐危害患者视力。色素上皮衍生因子（pigment epithelium—derived factor,PEDF）是从胎儿视网膜色素上皮细胞培养液中发现的具有保护神经元和抗新生血管形成双重效能的细胞因子。PEDF可修复DR受损的视网膜神经细胞及维持视网膜内环境稳定,从而为DR治疗提供新的理论依据。本文就PEDF对DR中神经细胞保护机制的研究现状和进展作一综述。     

大鼠视网膜神经细胞体外培养

目的 建立视网膜神经层分散细胞的培养方法，以进一步对视网膜神经元细胞(尤其是视网膜神经节细胞)和神经胶质细胞进行体外实验研究。方法 取出生后1～3d的SD乳鼠的视网膜，用胰酶消化法制备分散细胞悬液后，接种于置有包被poly-D-lysine玻片的24孔培养板中培养，倒置相差显微镜观察细胞生长规律。培养第7d，用抗神经元特异性核(NeuN)抗体和抗神经丝(Neurofilament-200，NF-200)抗体分别标记视网膜神经元细胞和神经节细胞(RGCs)，并计算每10个高倍镜下的细胞数以及RGCs所占百分数。结果 体外培养的视网膜神经元细胞经历了贴壁、重聚、迁移和相互接触的过程，有突起样生长，其中RGCs占神经元的55％左右。结论 视网膜神经层分散细胞体外培养成功，并有较好的RGCs生长率，为进一步进行视网膜疾病的研究创造了条件。