联合应用SSH和cDNA表达谱芯片筛选肝星状细胞早期活化的相关基因

目的 利用抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）和cDNA表达谱芯片筛选早期活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）和大鼠正常肝脏组织、轻度肝纤维化组织、重度肝纤维化组织中差异表达的基因。方法 从SSH构建的大鼠轻度肝纤维化、重度肝纤维化2个差异cDNA文库中挑选1000条上调显著的基因，与正常大鼠4136条基因克隆制作成一张芯片，筛选早期活化的肝星状细胞相关基因。结果 获得与HSC早期活化相关的上调基因有202条，下调基因有80条，其中血清和糖皮质激素调节蛋白激酶（serum and glucocorticoid sensitive kinase，SGK）在正常大鼠基因克隆和2周及8周SSH上调差异基因中均呈上调信号。结论 联合应用SSH和cDNA表达谱芯片是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速、经济和有效的方法；SGK可能作为多种细胞信号传导通路和细胞磷酸化级联反应的一个功能性交汇点，参与了肝星状细胞的早期活化和信号传导。     

应用抑制消减杂交和cDNA表达谱芯片筛选肝星形细胞持续活化的相关基因

目的：利用抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）和cDNA表达谱芯片筛选早期活化的肝星状细胞与大鼠正常肝脏组织、轻度肝纤维化组织、重度肝纤维化组织中差异表达的基因.方法：从SSH构建的大鼠轻度和重度肝纤维化中两个差异cDNA文库中挑选1 000条上调显著的基因,与正常大鼠4 136条基因克隆制作成一张芯片,筛选持续期活化的肝星状细胞相关基因.结果：获得与HSC持续活化相关的上调基因633条,下调基因715条,其中血清和糖皮质激素调节蛋白激酶（SGK）在正常大鼠基因克隆和2、8周SSH上调差异基因中均呈上调信号.结论：联合应用SSH和cDNA表达谱芯片是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速、经济和有效方法;SGK可能作为多种细胞信号传导通路和细胞磷酸化级联反应的一个功能性交汇点,参与了肝星状细胞的早期活化和信号传导.     

siRNA干扰ADAMTS2基因对肝星状细胞的影响

目的 探讨siRNA干扰大鼠含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶2(ADAMTS2)基因后对大鼠肝星状细胞(HSC)生物学特性的影响及其机制,评估ADAMTS2基因作为一种新的靶向基因在抗肝纤维化治疗中的应用前景.方法 设计并化学合成3对针对大鼠ADAMTS2 mRNA 2237、2597及690位点的siRNAs.用筛选出的抑制效率最高的siRNA体外转染HSC-T6,应用实时PCR、Westem blot及MTT等方法研究沉默ADAMTS2基因对大鼠HSC活化、增殖等生物学特性及对基因ADAMTS2、α-SMA、COL1α1、COL(I)、TGF-β1、MMP-2和TIMP-3表达的影响.结果 在相同注射剂量(50 nmol/L)及时间(48 h)下,2237位点的siRNA-ADAMTS2具有最高的抑制效率;能显著抑制ADAMTS2基因mRNA和蛋白表达(抑制率80％以上);显著抑制COL(I)、α-SMA和TGF-β1在HSC中的表达.HSC的增殖能力显著降低.结论 化学合成的siRNA-ADAMTS2干扰载体能有效抑制ADAMTS2基因在大鼠HSC-T6细胞系中的表达,抑制HSC的活化和增殖,同时显著降低COL(I)、α-SMA和TGF-β1的表达,具有潜在的阻止甚至逆转肝纤维化的作用.ADAMTS2可能是抗肝纤维化治疗的有效靶位,抑制ADAMTS2在肝脏的表达可能是一种有效的抗肝纤维化治疗策略.     

肝纤维化时星状细胞激活的分子生物学机制

本文就肝纤维化时星状细胞激活的分子生物学机制作一综述.肝纤维化时星状细胞初始活化和持续活化主要表现在肝星状细胞的表型改变上.肝纤维化时星状细胞的活化涉及多基因、多因子的表达变化.     

紫衫醇对大鼠肝纤维化的抑制作用及机制研究

目的:探讨紫衫醇对大鼠肝纤维化的抑制作用及其分子机制。方法:将30只Wistar大鼠随机均分为正常对照组、肝纤维化模型组,肝纤维化模型+紫衫醇组,肝纤维化模型用腹腔注射二甲基亚硝胺每日1次连续7 d诱导,之后,肝纤维化模型+紫衫醇组大鼠给予尾静脉注射紫杉醇液,隔日1次,共3次;实验结束时,处死大鼠观察肝脏病理学和血清学指标变化,及肝组织中肝星状细胞标志物α-SMA的表达。将大鼠肝星状细胞HSC-T6分别用TGF-β1、紫杉醇+TGF-β1处理,以无处理的HSC-T6细胞为对照,分别检测各组细胞纤连蛋白及I、III型胶原m RNA与蛋白的表达。结果:正常对照组肝组织无病理学改变,肝纤维化模型组出现肝纤维化病变,肝纤维化模型+紫杉醇组可见肝组织中度坏死,无明显坏死结节;与正常对照组比较,肝纤维化模型组与肝纤维化模型+紫杉醇组转氨酶、总胆红素(TIBL)、透明质酸(HA)水平均明显升高,白蛋白(ALB)水平明显降低(均P0.05),后者较前者在TBIL、ALB、HA方面有明显改善(均P0.05);正常对照组肝组织无明显α-SMA表达,肝纤维化模型组和与肝纤维化模型+紫杉醇组肝组织均有α-SMA表达,后者的α-SMA阳性细胞数明显少于前者(P0.05);与无处理的HSC-T6细胞比较,TGF-β1与紫杉醇+TGF-β1处理后的HSC-T6细胞纤连蛋白及I、III型胶原m RNA与蛋白均明显上调(均P0.05),后者的上调程度明显低于前者(均P0.05)。结论:紫杉醇可抑制大鼠肝纤维化的产生和发展,机制可能与其抑制肝星状细胞中TGF-β信号通路从而减少肝星状细胞活化有关。     

视黄醇类核内受体-α基因慢病毒载体的构建及其对肝星状细胞的影响

目的:通过视黄醇类核内受体-α(retinoid X receptor-alpha,RXR-α)基因慢病毒表达载体的构建,及其对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)活化、增殖影响的研究,探讨RXR-α基因在肝纤维化中的作用。方法:①构建RXR-α基因慢病毒表达载体;②分离和体外培养大鼠HSC;③将自发活化的HSC分成3组,即正常对照组、阴性对照组和RXR-α载体组;分别将空白慢病毒载体和RXR-α慢病毒载体转染自体活化的HSC,采用Western印迹法检测各组细胞中RXR-α、α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达变化,用MTT法检测各组HSC培养24、48、72及96 h后的增殖情况。结果:正常对照组及阴性对照组HSC中几乎没有RXR-α蛋白的表达,而RXR-α载体转染组的HSC中出现RXR-α蛋白的明显表达。与正常对照组及阴性对照组相比,RXR-α载体组转染的HSC中α-SMA蛋白表达量显著下降(t=3.767,P0.01和t=8.491,P0.05),Ⅰ型胶原蛋白表达也显著降低(t分别为10.449和10.756,P值均0.01),同时HSC的增殖能力也显著下降(t分别为4.381和1.778,P值均0.05)。而阴性对照组与正常对照组相比,α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达量和HSC增殖能力无明显变化(P0.05)。结论:RXR-α基因在HSC内的增强表达能显著抑制HSC的活化和增殖,具有潜在的抑制肝纤维化的作用。     

肿瘤坏死因子-α对肝星状细胞形态及表达结缔组织生长因子的影响

目的 通过观察肿瘤坏死因子（TNF）-α对肝星状细胞（HSC）形态和结缔组织生长因子（CTGF）表达的影响，探讨TNF—α在肝纤维化中的作用机制。方法 采用体外培养大鼠肝星状细胞，加入TNF-α和TGF-β1，透射电镜观察肝星状细胞的形态学改变并应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测不同处理组HSC中CTGF的表达。结果 TNF-α、TGF—β1均诱导HSC中CT-GF表达；10μg／L浓度的TNF-α作用6、24和48h后，检测到CTGFmRNA表达，而TGF-β1在1μg/L浓度作用4h后，即可诱导HSC中CTGFmRNA表达。结论 TNF-α诱导HSC中CTGF的表达可能参与早期肝纤维化的形成。     

肝星状细胞在肝脏疾病中的作用

肝星状细胞（HSC）是肝脏内重要的非实质细胞之一,可分泌、释放多种胶原纤维和细胞骨架蛋白参与肝脏疾病的病理生理过程。正常状态下,HSC通过调节细胞外基质蛋白的合成和降解维持肝脏正常的组织结构;肝脏损伤时,HSC被激活,活化的HSC导致细胞外基质的增加是肝纤维化形成并最终导致肝硬化、肝衰竭的主要原因。因此,深入研究HSC在肝脏疾病发生与发展中的作用和机制,并研究与HSC相关的治疗策略,对于提高患者生存率具有一定意义。     

转化生长因子β_1刺激肝星状细胞差异表达下调基因筛选

目的筛选并克隆转化生长因子β1(TGF-β1)刺激肝星状细胞差异表达下调基因,阐明TGF-β1导致肝纤维化的分子生物学机制。方法以TGF-β1及磷酸盐缓冲液分别刺激大鼠肝星状细胞(即实验组和对照组),提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将对照组细胞cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与实验组细胞cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR扩增,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠埃希菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建了TGF-β1刺激肝星状细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到98个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。选取含有插入片段的35个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得了19种已知基因序列和2个未知功能基因。结论应用抑制性消减杂交技术成功构建了TGF-β1刺激的肝星状细胞差异表达基因的cDNA消减文库,为进一步阐明TGF-β1参与肝纤维化的分子生物学机制提供了理论依据。     

慢性胰腺炎与细胞外基质代谢失衡的关系

目的　研究慢性胰腺炎与细胞外基质 (ECM )代谢失衡的关系 ,探讨慢性胰腺炎的发病机制。方法　应用含有 40 96条人类全长基因的cDNA表达谱芯片 ,分别对 6例慢性胰腺炎及正常胰腺组织标本的基因表达谱进行分析。结果　在 6例慢性胰腺炎组织中 ,均有差异表达的基因2 0 7条 ,占芯片基因数的 5 .0 1%。从中筛选出与ECM代谢有关的显著表达差异基因 18条 ,其中表达上调基因 10条 ,下调基因 8条。结论　转化生长因子 (TGF) β1持续性高表达造成的ECM代谢紊乱 ,可能是导致慢性胰腺炎胰腺纤维化发生、发展的重要因素。     

人膀胱浅表性移行细胞癌基因表达变化的基因芯片研究

目的研究人膀胱浅表性移行上皮细胞癌（TCC）和正常膀胱组织差异表达基因。方法应用基因芯片技术对6例膀胱浅表性TCC癌组织和正常膀胱组织的总RNA进行检测。结果在13939条目的基因中共发现差异表达基因720条。在癌组织中234条表达增加，486条表达降低；678条能在GeneBank中登录。结论膀胱浅表性TCC的发生、发展足多基因异常引起多条传导通路异常致使细胞恶性转化的结果，基因芯片技术可同时定量研究大量基因表达水平，是一种稳定、高效的方法。     

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目的 利用基因芯片技术分析原发性下肢深静脉瓣膜功能不全(PDVI)所致大隐静脉曲张的基因表达谱和差异基因。方法 对10例PDVI所致的曲张大隐静脉和10例正常对照组织进行mRNA抽提，分别给予荧光素Cy5和Cy3标记以制备cDNA探针，并与含有1220个人类全长互补DNA的基因芯片进行杂交和分析。结果 在PVDI所致的曲张大隐静脉组织中共检测到21个差异基因，其中9个为上调基因，12个为下调基因。差异表达基因包括参与信号传导、细胞周期以及细胞生长、分化、代谢、增殖和凋亡的相关基因。结论 运用基因芯片技术筛选出的差异基因与PVDI所致大隐静脉曲张发病相关。     

特发性高草酸尿症大鼠肝脏差异表达基因的筛选研究

目的 从基因水平探索特发性高草酸尿症(IH)的发病机制,筛选可能导致其发病的相关基因.方法应用含有26 962条大鼠全基因组寡核苷酸芯片,研究3只IH模型大鼠和3只正常大鼠肝脏组织基因表达谱的差异性,同时进行生物信息学分析.结果 在IH模型大鼠与正常大鼠肝脏组织之间存在差异表达基因147条,其中上调基因123条,下调基因24条,包括细胞受体、免疫相关、细胞信号和传递蛋白、代谢蛋白、发育相关等多种基因.结论 基因芯片能有效筛选出IH模型大鼠肝脏中的差异基因,显著的基因差异表达与其发病机制可能存在相关性.     

特发性高草酸尿症大鼠肝脏差异表达基因的筛选研究

目的 从基因水平探索特发性高草酸尿症(IH)的发病机制,筛选可能导致其发病的相关基因.方法应用含有26 962条大鼠全基因组寡核苷酸芯片,研究3只IH模型大鼠和3只正常大鼠肝脏组织基因表达谱的差异性,同时进行生物信息学分析.结果 在IH模型大鼠与正常大鼠肝脏组织之间存在差异表达基因147条,其中上调基因123条,下调基因24条,包括细胞受体、免疫相关、细胞信号和传递蛋白、代谢蛋白、发育相关等多种基因.结论 基因芯片能有效筛选出IH模型大鼠肝脏中的差异基因,显著的基因差异表达与其发病机制可能存在相关性.     

特发性高草酸尿症大鼠肝脏差异表达基因的筛选研究

目的 从基因水平探索特发性高草酸尿症(IH)的发病机制,筛选可能导致其发病的相关基因.方法应用含有26 962条大鼠全基因组寡核苷酸芯片,研究3只IH模型大鼠和3只正常大鼠肝脏组织基因表达谱的差异性,同时进行生物信息学分析.结果 在IH模型大鼠与正常大鼠肝脏组织之间存在差异表达基因147条,其中上调基因123条,下调基因24条,包括细胞受体、免疫相关、细胞信号和传递蛋白、代谢蛋白、发育相关等多种基因.结论 基因芯片能有效筛选出IH模型大鼠肝脏中的差异基因,显著的基因差异表达与其发病机制可能存在相关性.     

特发性高草酸尿症大鼠肝脏差异表达基因的筛选研究

目的 从基因水平探索特发性高草酸尿症(IH)的发病机制,筛选可能导致其发病的相关基因.方法应用含有26 962条大鼠全基因组寡核苷酸芯片,研究3只IH模型大鼠和3只正常大鼠肝脏组织基因表达谱的差异性,同时进行生物信息学分析.结果 在IH模型大鼠与正常大鼠肝脏组织之间存在差异表达基因147条,其中上调基因123条,下调基因24条,包括细胞受体、免疫相关、细胞信号和传递蛋白、代谢蛋白、发育相关等多种基因.结论 基因芯片能有效筛选出IH模型大鼠肝脏中的差异基因,显著的基因差异表达与其发病机制可能存在相关性.     

特发性高草酸尿症大鼠肝脏差异表达基因的筛选研究

目的 从基因水平探索特发性高草酸尿症(IH)的发病机制,筛选可能导致其发病的相关基因.方法应用含有26 962条大鼠全基因组寡核苷酸芯片,研究3只IH模型大鼠和3只正常大鼠肝脏组织基因表达谱的差异性,同时进行生物信息学分析.结果 在IH模型大鼠与正常大鼠肝脏组织之间存在差异表达基因147条,其中上调基因123条,下调基因24条,包括细胞受体、免疫相关、细胞信号和传递蛋白、代谢蛋白、发育相关等多种基因.结论 基因芯片能有效筛选出IH模型大鼠肝脏中的差异基因,显著的基因差异表达与其发病机制可能存在相关性.     

特发性高草酸尿症大鼠肝脏差异表达基因的筛选研究

目的 从基因水平探索特发性高草酸尿症(IH)的发病机制,筛选可能导致其发病的相关基因.方法应用含有26 962条大鼠全基因组寡核苷酸芯片,研究3只IH模型大鼠和3只正常大鼠肝脏组织基因表达谱的差异性,同时进行生物信息学分析.结果 在IH模型大鼠与正常大鼠肝脏组织之间存在差异表达基因147条,其中上调基因123条,下调基因24条,包括细胞受体、免疫相关、细胞信号和传递蛋白、代谢蛋白、发育相关等多种基因.结论 基因芯片能有效筛选出IH模型大鼠肝脏中的差异基因,显著的基因差异表达与其发病机制可能存在相关性.