体外扩增法分离培养兔骨髓来源的血管内皮祖细胞

背景:体外扩增法培养血管内皮祖细胞操作简便、费用低廉是实验中获取内皮祖细胞的主要方法。目的:拟从兔的骨髓中通过体外扩增法分离培养出血管内皮祖细胞,为进一步观察自体血管内皮祖细胞移植促进血管内皮的修复提供细胞学基础。设计、时间及地点:开放性实验,于2005-03/2006-02在解放军第二军医大学长征医院内科实验室完成。材料:6~8月龄新西兰大白兔8只,雌雄不拘,体质量(2.5±0.5)kg,抽取骨髓,密度离心法分离骨髓单个核细胞方法:将骨髓单个核细胞接种于密度为1×106cm-2,加入含有血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的M199培养基中体外扩增培养7d,通过DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞,显示红色荧光的为吞噬了乙酰化低密度脂蛋白的细胞,绿色荧光为结合BS-1的细胞,双染色为橙色荧光。免疫荧光染色及流式细胞仪检测CD133,CD34,Flk-1的表达。主要观察指标:①细胞形态观察。②血管内皮祖细胞的增殖能力。③乙酰化低密度脂蛋白和凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞结果。④血管内皮祖细胞免疫组织化学鉴定结果。⑤血管内皮祖细胞表面标志物流式细胞仪检测结果。结果:①细胞形态观察:新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养72h后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接,呈梭形的内皮样细胞。②血管内皮祖细胞的增殖能力:培养2~4d血管内皮祖细胞增殖较快,之后增殖速度减缓,生长曲线呈典型"S"形外观,培养第6,7天血管内皮祖细胞生长再次增快,吸光度值分别达到0.58±0.15和0.62±0.23。③在血管内皮祖细胞的胞质中,出现与乙酰化低密度脂蛋白结合的红色荧光聚集,阳性率达95%以上;与凝集素BS-1结合率几乎达100%;两者双染色率达90%以上。④血管内皮祖细胞免疫组织化学及流式细胞仪检测细胞表面标志物CD133,FlK-1,CD34均呈阳性。结论:体外扩增法成功地从兔骨髓中分离培养出具有血管内皮祖细胞特征的细胞群体。     

体外分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞及其生物学特性鉴定

背景:现阶段急需建立一种稳定的体外分离培养内皮祖细胞的方法,骨髓中内皮祖细胞的含量丰富,增殖能力强,而且容易获得,操作简单.目的:拟在体外分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞,并对其生物学特性进行鉴定.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-08/12在重庆医科大学附属第一医院中心实验室完成.材料:清洁级2周龄SD大鼠20只,由重庆医科大学实验动物中心提供.方法:无菌条件下分离大鼠股骨和胫骨,用预冷至4℃的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔,以密度梯度离心法收集单个核细胞层,含体积分数为20%胎牛血清的M199培养液重悬细胞,制成单细胞悬液后进行细胞计数,按1×109L-1浓度接种到预先用纤维连接蛋白包被的培养瓶中,37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度恒温培养.主要观察指标:倒置显微镜观察细胞形态变化,免疫细胞化学检测内皮祖细胞表面特异性抗原CD133、内皮祖细胞表面抗原CD34和血管内皮生长因子受体KDR的表达,并进行流式细胞仪定量分析和细胞生长曲线分析.结果:新分离获得的骨髓单个核细胞为小圆形,培养4 d后贴壁细胞呈"集落"样生长,中间为圆形贴壁细胞,外周梭形细胞较多,传代后梭形细胞首尾相连,呈"毛细血管"样排列.培养第4,7,10,14天贴壁细胞CD34,KDR,CD133均呈阳性表达,CD133阳性细胞第10天时开始减少.流式细胞仪检测结果显示,CD133/KDR双阳性细胞率逐渐升高,10 d时达峰值,随后下降.KDR阳性细胞率随培养时间的延长而逐渐升高.原代细胞生长曲线显示细胞在第3～6天处于指数生长期,贴壁细胞大量增殖,呈"集落"样生长.结论:采用密度梯度离心法可成功从SD大鼠骨髓中分离获得内皮祖细胞,加入M199培养液后能够贴壁增殖,并可以分化为内皮细胞.     

应用体外扩增法对兔骨髓来源内皮祖细胞的分离培养和鉴定

目的拟从兔的骨髓中通过体外扩增法分离培养出血管内皮祖细胞,为进一步研究自体血管内皮祖细胞移植促进血管内皮的修复提供细胞学基础.方法实验于2005-03/2006-02在解放军第二军医大学长征医院内科实验室完成.①DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白(molecular probes公司),FITC标记的凝结素BS-1(vector公司),鼠抗人CD34抗体(Biolegend公司),兔抗人Flk-1抗体(Biolegeng公司),鼠抗人CD133单抗(R&D公司).②选用新西兰大白兔8只,抽取骨髓,密度离心法分离骨髓单个核细胞.接种密度为1×106/cm2,加入含有血管内皮生长因子、碱性成纤维生长因子的M199培养基中体外扩增培养7 d,观察细胞生长情况及增殖能力.③通过DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞,显示红色荧光的为吞噬了乙酰化低密度脂蛋白的细胞,绿色荧光为结合BS-1的细胞,双染色为橙色荧光.④免疫荧光染色及流式细胞仪检测CD133,CD34,Flk-1 的表达.结果(①细胞形态观察新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养72 h后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接,呈梭形的内皮样细胞.②血管内皮祖细胞的增髓能力培养2～4 d血管内皮祖细胞增殖较快,之后增殖速度减缓,生长曲线呈典型"S"形外观,培养第6,7天血管内皮祖细胞生长再次增快,吸光度值分别达到0.58±0.15和0.62±0.23.③乙酰化低密度脂蛋白和凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞结果在血管内皮祖细 胞的胞质中,出现与乙酰化低密度脂蛋白结合的红色荧光聚集,阳性率达95%以上;与凝集素BS-1结合率几乎达100%;二者双染色率达90%以上.④血管内皮祖细胞免疫组化及流式细胞仪检测结果细胞表面标志物CD133,Flk-1,CD34均呈阳性.结论体外扩增法成功地从兔骨髓中分离培养出具有血管内皮祖细胞特征的细胞群体.     

大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养与鉴定

背景：内皮祖细胞参与血管新生,但其分离、培养、鉴定方法目前并不统一。目的：探索大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养及鉴定方法。方法：使用密度梯度离心法及差速贴壁法联合的方法培养内皮祖细胞,在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化,使用Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1双荧光染色、流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD133表达情况。结果与结论：培养前4d细胞增殖不明显,第5～10天迅速增殖,并可见细胞集落及线状结构形成。培养第7天的内皮祖细胞具有吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1的功能。流式细胞仪检测体外培养第10天的细胞,CD133＋细胞占19.2%,CD34＋细胞占28.7%,CD34＋/CD133＋细胞占19.1%。说明密度梯度离心法联合差速贴壁法可在体外有效分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞。     

人脐带血内皮祖细胞体外培养和鉴定

背景:传统免疫磁珠法分选内皮祖细胞的方法操作复杂、费用大,细胞获得率较低,且内皮祖细胞的增生及分化受限.目的:尝试改良人脐带血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法,为实现内皮祖细胞移植、改善血管功能提供足量细胞来源.方法:采用密度梯度离心方法获得人带血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,通过免疫组织化学、免疫荧光和流式细胞仪等技术对脐血来源的内皮祖细胞进行鉴定.结果与结论:脐带血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;在细胞培养至第7天,免疫组织化学显示:CD31、vWF在体外培养过程中的表达阳性;免疫荧光染色表明:(83.0±4.3)%的贴壁细胞双染呈阳性,并且DiI-acLDL标记的内皮祖细胞红色荧光在体外可以持续6周以上;第7天贴壁细胞流式细胞仪分析显示:CD34、CD133和KDR分别为(17.8±3.7)%、(22.1±4.4)%、(81.5±5.0)%.结果提示,实验成功从脐带血单个核细胞中分离培养出内皮祖细胞,在其体外可扩增并向为内皮细胞方向分化.     

大鼠骨髓和外周血早晚期内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：旨在从大鼠外周血及骨髓中提取内皮祖细胞,培养晚期内皮祖细胞,为干细胞移植治疗或通过内皮祖细胞联合基因治疗使内皮祖细胞高表达血管新生诱导因子,达到促进缺血性脑血管病血管新生的目的。目的：从大鼠骨髓及外周血中分离出内皮祖细胞并对其进行鉴定。方法：使用密度梯度离心及贴壁筛选法从大鼠骨髓和外周血中分离获得单个核细胞,进行诱导培养,观察并记录贴壁细胞的生物学特征;选取内皮祖细胞特异性表面标志CDl33、CD34、KDR对原代细胞进行免疫荧光检测,利用流式细胞学技术检测KDR、CD34表达,并通过吞噬功能实验进～步鉴定培养细胞。结果与结论：大鼠骨髓和外周血能够分离获得早晚期内皮祖细胞;贴壁细胞免疫荧光检测CD34、CDl33、KDR表达阳性;流式细胞学检测CD34、KDR表达阳性;贴壁细胞能够吞噬ac—LDL,结合UEA-1。实验成功从大鼠骨髓及外周血中分离出内皮祖细胞;并获得了增殖活性强的晚期内皮祖细胞,找到了更好的成血管干细胞的种子来源。     

人外周血内皮祖细胞的培养与鉴定

目的:探讨人外周血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法,为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打基础。方法:实验于2004-09/2005-05在解放军第四军医大学西京医院肝胆外科实验室完成。采集献血员抗凝外周血,经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在含有体积分数为0.1胎牛血清、20μg/L的血管内皮细胞生长因子和4μg/L的碱性成纤维细胞生长因子的M199培养液中培养和扩增,分别在培养的第6和14天,流式细胞仪检测其KDR,CD133,CD34和vWF阳性率,并通过检测其对异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素的吸附和内吞DiI-acLDL来进行细胞功能学的鉴定。结果:①人外周血单个核细胞经体外诱导分化,培养第6天的贴壁细胞表达KDR,CD133,CD34和vWF,流式细胞仪检测其阳性率分别为(46.4±9.3)%、(33.8±11.7)%、(73.5±6.3)%和(38.9±8.2)%,能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL。②培养第14天的贴壁细胞表达KDR,CD34和vWF,不表达CD133,流式细胞仪检测其阳性率分别为(81.5±7.6)%、(88.9±5.4)%和(78.3±13.6)%,能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL。结论:外周血来源的单个核细胞在一定的培养条件下可以分化为内皮祖细胞,为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打下基础。     

人脐血两种类型内皮祖细胞的体外分化研究

[目的]研究人脐带血中两种类型内皮祖细胞的体外分化特征.[方法]采用6%羟乙基淀粉沉降法和密度梯度离心法联合分离脐带血中单个核细胞,在含有VEGF和bFGF的培养基中培养.通过形态学、免疫荧光、RT-PCR和流式细胞分析细胞的生长特点和生物学特征.[结果]贴壁细胞分成两种类型的细胞,早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞;早期内皮祖细胞的形态从小的圆形细胞变成以集落为中心,周围呈发芽式向外生长的细胞群,晚期内皮祖细胞形成典型的"铺路石样".摄取DiI-acLDL及通过FITC-UEA-I染色初步鉴定内皮祖细胞.RT-PCR提示不同时间点内皮特异性基因表达变化,流式细胞分析不同时间点AC133、CD34、KDR的变化.[结论]在人的脐带血中获得两种类型的EPCs,为进一步研究EPCs提供实验基础.     

人脐带血内皮祖细胞与血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共培养及其增殖和迁移能力

背景:目前组织工程心脏瓣膜再内皮化种子细胞主要来源于成熟内皮细胞,内皮祖细胞作为内皮细胞的前体细胞越来越受到人们的关注。目的:分离和扩增人脐带血内皮祖细胞,观测其体外生物学特性。方法:密度梯度离心法分离新鲜的脐血中单个核细胞,在含血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的培养液中培养扩增,通过形态学、免疫荧光和流式细胞仪等对贴壁细胞进行鉴定;并与脐静脉内皮细胞进行增殖和迁移能力比较。结果与结论:随着培养和诱导时间延长,贴壁细胞形态发生明显的改变,从小圆形变成梭形,逐渐分化成典型成熟内皮细胞的鹅卵石样形态,并可形成特征性的克隆;体外诱导7d后90%以上贴壁细胞呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双阳性;贴壁细胞流式细胞仪分析显示:培养7d的细胞VEGFR-2、CD34和CD133表达分别占(77.4±4.9)%、(52.4±6.6)%和(19.4±2.1)%,培养28d的细胞VEGFR-2和CD34表达分别占(81.1±7.4)%和(7.6±3.1)%,而未检测到CD133表达;人内皮祖细胞增殖和迁移能力明显高于人脐静脉内皮细胞(P<0.05),并且细胞数量可扩增达109L-1。结果显示用密度梯度离心法和贴壁筛选法,可从人脐带血分离、纯化内皮祖细胞;内皮祖细胞可诱导分化为内皮细胞,增殖和迁移能力都很强。     

大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞的体外培养与鉴定

目的:目前内皮祖细胞主要从骨髓、脐带血和外周血获取,但其分离培养方法尚不成熟,外周血来源因损伤小、易获取而被普遍使用,但得到的内皮祖细胞纯度较低.实验拟探讨大鼠骨髓来源内皮祖细胞体外培养、诱导扩增和生物学特性鉴定方法.方法:实验于2006-08/2007-08 在南昌大学第一附属医院泌外研究所完成.①实验材料:2周龄SD大鼠由南昌大学医学院动科部提供,雌雄不拘,清洁级,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:应用梯度离心法采集大鼠骨髓单个核细胞,贴壁筛选法分离内皮祖细胞,置于添加了血管内皮细胞生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子的M199培养液中扩增培养,对培养2周的细胞采用免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体-2、CD34、CD133, 采用RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因表达.结果:①培养4 d,光电显微镜下可见细胞集落形成,梭形贴壁细胞从集落中央以放射状向外周生长.培养7～10 d,细胞集落相互连接,呈典型的"鹅卵石"样外观.2周左右可见细胞排列成条索状结构并可呈"微血管样"排列生长.②贴壁细胞免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、FLK-1、CD34、CD133阳性,RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因阳性表达.结论:采用梯度离心法从骨髓中分离单个核细胞,经诱导培养可实现内皮祖细胞的分离培养和体外扩增.     

全骨髓培养法扩增小鼠内皮祖细胞

背景：对于小型实验动物,通过分离骨髓单个核细胞进行内皮祖细胞培养、扩增的方法较为繁琐。目的：探讨采用全骨髓培养方式扩增小型动物内皮祖细胞的可行性。方法：采用全骨髓培养分离C57BL/6小鼠内皮祖细胞,培养第7天行DiL-acLDL和FITC-UEA-1双荧光染色检测,并利用流式细胞仪检测其CD34、FLK-1表达情况。同时检测其体外血管生成能力,黏附、增殖和迁移能力。设立骨髓单个核细胞培养法为对照。结果与结论：全骨髓培养至第2天便可见早期内皮祖细胞集落形成,第7天时可见大量短梭状内皮祖细胞,其具有吞噬DiL-acLDL及结合FITC-UEA-1的能力,内皮祖细胞在基质胶上同样能够形成血管样结构,培养至第2周晚期内皮祖细胞集落出现,迅速生长形成典型的铺路石样,并能够在体外传代培养,细胞数量、细胞表面CD34、FLK-1表达、体外黏附、增殖和迁移能力及晚期集落出现时间与对照组差异无显著性意义（P〉0.05）。说明采用全骨髓培养的方式能够实现小型动物内皮祖细胞的筛选扩增,且操作简便。     

小径聚氨酯人工血管内皮化种子细胞的体外诱导分化及种植实验

背景:目前,小径人工血管移植后由于缺乏内皮细胞衬里和抗血栓特性,长期通畅率低。有研究尝试用成熟内皮细胞种植人工血管以增强其抗血栓能力,以提高长期通畅率,但由于种子细胞和支架材料存在的缺陷,其效果并不令人满意。因此,临床上亟需寻找合适的种子细胞及血管支架材料,改善小径人工血管移植长期通畅率低这一现状。目的:探讨体外诱导骨髓单个核细胞分化成为内皮祖细胞的可行性,并种植聚氨酯小径人工血管表面,为小径聚氨酯人工血管内皮化提供合适的种子细胞。设计:观察性实验。单位:中山大学附属第一医院心血管医学部,免疫学教研室。材料:实验于2004-09/2005-05在中山大学附属第一医院完成。健康志愿者成人骨髓(n=7)约10mL。方法:收集健康成人骨髓单个核细胞,置于纤维连接蛋白预衬的DMEM培养基中,用血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子加以诱导,通过荧光显微镜和免疫组化分析等方法观察和鉴定诱导后的细胞。将诱导分化的内皮祖细胞种植到聚氨酯小径人工血管表面,用扫描电镜观察。主要观察指标:①细胞形态学变化。②免疫组化VWF和CD34抗体染色结果。③聚氨酯小径人工血管表面内皮祖细胞的黏附生长状态。结果:①在血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等诱导因子存在的条件下,骨髓单个核细胞分化成为内皮祖细胞,倒置荧光显微镜下呈典形的“纺锤样”梭形细胞,单层细胞贴壁生长融合时呈铺路石样排列。②免疫组化示VWF和CD34抗体染色阳性。②扫描电镜下,未种植细胞的聚氨酯小径人工血管表面呈典型的多孔蜂窝状结构,孔径大小比较适合内皮祖细胞爬行。种植细胞后,聚氨酯小径人工血管表面有大量的内皮祖细胞黏附、爬行及铺展生长,有时可见内皮祖细胞长入蜂窝状孔径内。结论:在体外能将骨髓单个核细胞诱导分化成为内皮祖细胞,而诱导分化的内皮祖细胞在小径聚氨酯人工血管上黏附生长状态良好,提示体外诱导骨髓单个核细胞分化为内皮祖细胞可作为小径聚氨酯人工血管内皮化的种子细胞。     

雷帕霉素和紫杉醇对骨髓内皮祖细胞数量及功能的影响

目的：研究雷帕霉素和紫杉醇对骨髓内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）数量及功能的影响。方法：将离心法获得的SD雄性大鼠的骨髓单个核细胞接种于明胶包被的培养板上,培养7d后收集贴壁细胞,加入不同浓度的雷帕霉素（0．1μg/mL,1μg／mL和5μg／mL）及紫杉醇（0．1μg／mL,1μg／mL和5μg／mL）培养24h。在激光共聚焦显微镜下观察细胞,DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI—acLDI．）和异硫氰酸荧光素标记的单叶豆凝集素1（FITCBS-1Lectin）双染色阳性的细胞为正在分化的EPCs,在倒置荧光显微镜下对其进行计数。然后分别采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法、改良的Boyden小室法和黏附能力检测实验来观察EPCs的增殖能力、迁移能力及黏附能力。结果：EPCs数量随着雷帕霉素及紫杉醇浓度的增加而减少,其增殖能力、迁移能力及黏附能力亦随药物浓度的增加而降低,各项指标有统计学意义（P〈0．05）。相同浓度的雷帕霉素和紫杉醇对EPCs数量及功能的影响无显著差异。结论：雷帕霉素和紫杉醇可降低EPCs的数量及其增殖能力、迁移能力和黏附能力,且两种药物对EPCs的效应呈浓度依赖性。     

大鼠骨髓与外周血来源内皮祖细胞生物学特性比较

背景：内皮祖细胞不仅参与胚胎血管生成,也参与出生后血管发生和血管内膜损伤后修复,对治疗缺血性疾病意义重大,但目前对内皮祖细胞的分离、培养、鉴定还存在争议。目的：体外分离、培养大鼠骨髓与外周血来源的内皮祖细胞,并比较其生物学特性。方法：密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓和外周血单个核细胞,接种于纤维连接蛋白铺被的培养瓶中贴壁培养,用加入血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子的完全培养基诱导培养,对获得的贴壁细胞进行细胞形态学,免疫细胞化学染色,流式细胞仪,透射电镜,以及Dil-acLDL、FITC-UEA-1双荧光染色法检测。结果与结论：骨髓来源的内皮祖细胞数量多,集落状生长,增殖能力强;外周血来源的内皮祖细胞数量较少,散在生长,消化后能贴壁但不能传代。两种不同来源的内皮祖细胞免疫细胞化学检测贴壁细胞CDl33、CD34、FIk-1、Ⅷ因子在不同时段呈阳性表达;激光共聚焦显微镜观察,Dil-acLDL、FITC-UEA-1均为双染。透射电镜检查外周血来源的内皮祖细胞发现W-P小体。提示大鼠骨髓和外周血均能分离培养出内皮祖细胞,但前者是早期内皮祖细胞,后者为晚期内皮祖细胞,两者生物学特性各不相同。     

促红细胞生成素对大鼠内皮祖细胞生物学特点的影响

背景:内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞,可参与新生血管的形成.研究发现,促红细胞生成素对骨髓内皮祖细胞有动员作用,促进血管的新生和损伤组织修复.目的:观察不同浓度促红细胞生成素对体外培养的大鼠内皮祖细胞功能的影响.方法:提取Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓,利用密度梯度离心方法分离单核细胞进行培养,分别在培养基中加入0,4,8 U/mL不同浓度的促红细胞生成索进行培养.培养7 d后,对内皮祖细胞利用FITC-UEA-1和Dil-Ac-LDL共同染色方法进行鉴定;同时利用CD34和CD133共同标记,以流式细胞仪进行鉴定;采用黏附实验、迁移实验及MTT实验对其功能进行评定.结果与结论:培养到7d左右,细胞形态变化完全,细胞之间形成联接,并可以围成似管腔状形态,十二三天时,细胞融合,形成铺路石样.培养细胞荧光染色显示内皮祖细胞里双阳性染色,经流式细胞仪鉴定培养的内皮祖细胞可以结合CD133和CD34.黏附实验、迁移实验及MTT实验显示,促红细胞生成素呈剂量依赖性提高内皮祖细胞的黏附、迁移和增殖能力.说明在0-8 U/mL浓度内,促红细胞生成素呈剂量依赖性提高内皮祖细胞的黏附、迁移和增殖功能.     

血管内皮祖细胞鉴定及其促血管新生机制的研究进展

血管内皮细胞(endothelial cells, ECs)既往被认为在出生后血管新生中发挥主要作用。1997年Asahara等从外周血分离出表达CD34抗原的单个核细胞,即血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)。EPCs是一类具有促血管生成能力的干细胞总称,尚未发现特异性免疫表型,故主要根据具有形成血管的功能鉴定。目前一般认为,EPCs来源于骨髓和外周血管壁,其中能分化为ECs者被称为内皮集落形成细胞(endothelial colony forming cells,ECFCs)。当组织缺血或损伤时,来自骨髓的EPCs被组织释放的损伤信号动员后进行迁移和归巢。活化的EPCs通过旁分泌作用招募更多的局部ECFCs和ECs来形成微血管,进而促进组织修复。因此,对EPCs的深入研究有助于临床上治疗性血管新生相关研究的进行和方法的发展。     

骨髓单个核细胞构建细胞化生物组织工程血管支架的研究

目的研究鼠骨髓来源平滑肌祖细胞(SPCs)和内皮祖细胞(EPCs)在细胞外基质支架上的生长特性,为生物组织工程血管寻找更新的种子细胞和支架。方法将鼠骨髓来源单个核细胞(BMCs)分别用不同的培养基进行诱导分化,于培养10 d后用免疫荧光双标技术(CD34/VWF)鉴定EPCs,用-αSMA/CD14鉴定SPC。将纤维蛋白原、层粘连蛋白和纤粘连蛋白按一定比例混合后,在新鲜大鼠血浆促凝作用下,构建毯状细胞外基质(ECM)支架,在支架表面种植诱导培养骨髓来源的第2代SPCs和EPCs。用扫描电镜和透射电镜观察和分析的支架表面结构以及细胞在支架上生长情况。结果单个核细胞经EBM-2培养基诱导,培养至10 d双荧光染色结果表明,培养贴壁细胞中约90%的EPCs呈VWF/CD34双阳性;经bFGF的M-199培养基诱导阳性率逐渐增加,培养至10 d双荧光染色结果表明,培养贴壁细胞中SPCs呈-αSMA/CD14双标阳性100%。将诱导培养的第2代SPCs,种植在支架上,4 d时倒置显微镜示SPCs在支架表面细胞融合呈现典型的"峰"、"谷"样形态,当EPCs被种植10 d时扫描电镜显示在支架表面形成一个完整的较平整的细胞平面。透射电镜发现在多层平滑肌祖细胞表面有单层内皮祖细胞,呈三维立体结构,具有天然血管的内膜和中膜,更接近天然血管的结构。结论BMCs将是组织工程血管最理想的细胞来源,细胞外基质支架能显著促进SPCs和EPCs粘附、增殖和分化,可作为SPCs和EPCs生长的载体,可作为一种新颖的合成人造血管的生物组织工程支架。     

细胞因子联合激活人骨髓和外周血免疫细胞的比较研究

在本研究中比较了某些细胞因子在体外联合激活骨髓和外周血免疫细胞后二免疫细胞数量、形态、细胞化学染色、免疫表型和细胞毒变化的差异。在体外加入INF－γ，rIL-1，rIL-2和McAb-CD3分别激培养骨髓笔外周血单个核细胞，培养过程中观察两组免疫细胞增数量及形态的变化，培养前后两组取样进行细胞化学染色和有型检测，用MTT法检测培养后两组的细胞毒情况。研究结果发现，两组的细胞数量在激活培养后均较培养前明显增加，但外周血组增加倍数更多（P＜0．05）；细胞化学染色可见两组培养以后髓过氧化物酶积分均较培养前减少，过碘酸雪夫染色见两组含较多粗颗粒的淋巴样细胞明显较培养前多，两组CD3^ ，CD56^＋和CD38^ 细胞较培养前明显增加（P＜0．05），但两组增殖无明显差别；骨髓组培养后CD3^ CD56^ 细胞无明显增加，而外周血组培养后激活增加显（P＜0．05）；两组激活培养后细胞的细胞毒无明显差异，结论：rIL-γ，rIL-1，rIL-2和CD3单抗联合激活骨髓和外周血单个核细胞可使二细胞数量和细胞毒明显增加，在临床上可利用激活的不同来源的细胞因子诱导的杀伤细胞进行细胞免疫治疗。