鼠疫FI McAb致敏红细胞用于反向间接血凝试验检测鼠疫菌及其FI抗原

用鼠疫FI McAb致敏红细胞反向间接血凝试验,检测鼠疫FI抗原16ng/ml、鼠疫EV菌1.5×15~6菌体/ml、鼠疫强毒菌5×10~4～1.5×10~6菌体/ml均出现阳性反应;检测2株缺乏FI抗原的鼠疫菌、5株鼠疫菌的近缘菌,菌液浓度为10~9菌体/ml,均为阴性反应;检测感染鼠疫强毒菌病死动物脾脏浸液,小白鼠阳性率24/24,长尾黄鼠阳性占检菌阳性的50/52。本检测方法可用于鼠疫动物病的追溯诊断。     

鼠疫FI单克隆抗体杂交瘤株的建立

先后两次分别用鼠疫EV活菌和FI抗原免疫BALB/C小鼠的脾细胞与SP2/0瘤细胞混合,大容量40％PEG处理后离心法杂交,用IHA和PPA-ELISA检测McAb,建立了21株分泌抗鼠疫FI抗原的McAb的杂交瘤株,初步鉴定了其中5株。观测了1株杂交瘤分泌的McAb用于RIHA的特异性和敏感性。     

用聚苯乙稀胶乳吸附鼠疫F1抗原检查鼠疫抗体试验的初步研究

用聚苯乙烯胶乳吸附鼠疫菌FI抗原检查鼠疫抗体,具有特异性强、快速、操作方法简单等特点,适用于野外对鼠疫大面积的检测工作。     

液体鼠疫菌FI抗原致敏血球的实验观察

鼠疫菌FI抗原（简称FI抗原），具有很强的特异性。鼠疫FI抗原致敏血球（简称FI血球）是鼠疫FI抗体间接血球凝集检测药盒（简称血凝正向药盒）的关键试剂。鼠疫间接血凝试验（IHA）在国内外已经成为鼠疫检测、诊断和科研的主要血清学方法之一，它具有敏感性高，特异性强，简便快捷的特点。本文报道了初步试制FI抗原的效价，并且与标准冻干的FI抗原做比较，将其致敏到红血球表面上，生产出与标准冻干FI抗原敏感性一致的高质量液体鼠疫FI抗原致敏血球。     

ABC-ELISA检测鼠疫FI抗原的研究

为比较ABC-ELISA法和常规ELISA检测鼠疫FI抗原的灵敏度,本文用两法对鼠疫颗粒性抗原和可溶性抗原进行平行检测以资对比。结果表明,ABC-ELISA检测鼠疫菌可少至2万～30万菌/ml,比常规ELISA敏感近3倍;检测实验动物脏器鼠疫FI抗原,ABC-ELISA比常规ELISA敏感近4倍。ABC-ELISA对腐败(30天)动物脏器中鼠疫FI抗原的检测获得了满意的结果,并且健康腐败动物中无一例假阳性反应出现,充分说明了本法具有良好的特异性。上述结果表明,ABC-ELISA法是一种比常规ELISA法灵敏的检测鼠疫FI抗原的方法。     

鼠疫FI单克隆抗体致敏红细胞用于反向血凝抑制试验检测鼠疫FI抗体的试验研究

本文介绍了鼠疫FI MCAb致敏红细胞用于反向血凝抑制试验检测鼠疫FI抗体的试验。结果表明,用该法检测95份正常人和8种动物血清,7种非鼠疫菌免疫动物血清,全部阴性;检测9份抗鼠疫强毒株和1份弱毒株血清及1份接种鼠疫菌苗的人血清,全部阳性,滴度比间接血凝试验(IHA)高2~1～2~3。该法可省去另做一排抑制试验的操作程序,较IHA简便、快速,在鼠疫疫源地调查和疫情监测中有良好的应用前景。     

放射免疫沉淀试验检测鼠疫FI抗体的研究——Ⅰ.特异性与敏感性

试验证明,用放射免疫沉淀试验(RIP)检测鼠疫抗体时,将被试血清与相应的阴性对照血清的结合比定为≥3作为反应标准是适宜的;用RIP检测假结核,小肠结肠炎菌等抗血清30份,这些抗血清在1:10到1:100的各种稀释度中与~(125)I-鼠疫FI抗原均无交叉反应,从非鼠疫疫区收集的2196份哺乳动物血清,亦未发现阳性反应,说明该法特异性强。由于RIP是用分离剂沉淀鼠疫抗原-抗体复合物,故能检出不完全抗体,检出率不仅高于常规的间接血球凝集试验(IHA)和酶联免疫吸附试验(ELISA),且滴度往往高十几倍、几十倍,乃至几百倍。所以用RIP检测潜在性鼠疫疫源地、考核灭源效果以及在科研中用于检测微量鼠疫抗体具有重要意义。加之该法自动化程度高,测试信息以数字显示,因而指标客观,容易分析,适于大规模现场调查。     

ABC—ELISA检测鼠疫FI抗原的研究

为比较ABC—ELISA法和常规ELISA检测鼠疫FI抗原的灵敏度,本文用两法对鼠疫颗粒性抗原和可溶性抗原进行平行检测。结果表明,ABC—ELISA检测鼠疫苗可少至2万—30万菌/ml,此常规ELISA敏感近3倍;检测实验动物脏器鼠疫FI抗原,ABC—ELISA比常规ELISA敏感近4倍。ABc—ELISA对腐败(30天)动物脏器中鼠疫抗原的检测获得了满意的结果,且健康腐败动物中无一例假阳性反应出现,说明本法具有较高的敏感性和良好的特异性。     

四种耶尔森氏菌的抗原抗体相关性研究

目的了解鼠疫、假结核、小肠结肠炎和中间型耶尔森氏菌抗原抗体在免疫血清学中是否存在相关性?方法用四种耶尔森氏活菌分别或混合家兔耳静脉注射4次获得高效价抗血清,用鼠疫FI抗原和其他耶尔森氏菌全菌冻溶和耐热抗原,作鼠疫RIP试验和抑制试验。结果RIP仅能检出鼠疫菌单独或混合其他菌抗血清中的特异性FI抗体,FI抗原能完全抑制EV株、A2株和A2株混合其他耶尔森氏菌抗血清中的特异性抗体,假结核、小肠结肠炎、中间型耶尔森氏菌冻溶抗原对EV株抗血清抑制2~3管,对A2株混合不同耶尔森氏菌的抗血清不能抑制,假结核耐热抗原对EV株抗血清能抑制6~7管,对A2株混合其他耶尔森氏菌抗血清抑制2管。结论FI抗原对三种耶尔森氏菌抗体没有相关性,其他3种耶尔森氏菌冻溶抗原对EV株、A2株抗体有一定的相关性,而伪F2、519、520株耐热抗原对EV株抗体有较强亲缘相关性,对A2株抗体仅有一定的相关性。     

ELISA双抗原夹心法检测鼠疫FI抗体的效果评价

目的比较ELISA双抗原夹心法与IHA法检测人血清中鼠疫FI抗体的最低检出限,符合率以及检测ELISA的特异性,以确定ELISA检测技术能否在鼠疫监测、诊断和流行病学调查中得到应用。方法分别用ELISA双抗原夹心法和IHA（间接血凝法）检测血清298份和鼠疫阳性诊断血清1份。结果ELISA双抗原夹心法检出4份阳性血清,IHA也检出4份阳性血清,2种方法阳性检出率无差别,符合率为75％,最低检出限均为1：160。结论ELISA特异性强,阳性检出率与IHA相当,结果容易判定,可以在鼠疫病例诊断及鼠疫监测中作为常规方法推广使用。     

鼠疫耶尔森菌小肽基因sORF34缺失株毒力及短期免疫保护效果评价

目的 探索小肽基因34(sORF34)缺失对鼠疫耶尔森菌毒力影响,并评价sORF34缺失株免疫保护活性。方法 基于鼠疫耶尔森菌201株和鼠疫耶尔森菌EV76疫苗株利用λ-Red一步法构建小肽基因缺失株。比较鼠疫小肽基因缺失株和亲本株之间的毒力差别,并采用皮下免疫方式对小鼠进行免疫,与EV76疫苗株比较,评价体液免疫、保护率等方面的差异。结果 PCR扩增结果证实,小肽基因缺失株构建成功。通过皮下LD₅₀测定、生存曲线测定,表明小肽基因缺失株较亲本株毒力下降。鼠疫201ΔsORF34和EV76ΔsORF34皮下免疫后可刺激机体产生抗F1-IgG,其中鼠疫201ΔsORF34免疫组抗体滴度与EV76疫苗株免疫组差异无统计学意义(P>0.05),EV76ΔsORF34免疫组较EV76疫苗株免疫组抗体滴度低;鼠疫EV76ΔsORF34株可刺激机体产生低滴度抗LcrV-IgG,而EV76和201ΔsORF34株不能刺激机体产生抗LcrV-IgG。初免后42 d使用致死剂量鼠疫201株进行皮下攻毒和滴鼻攻毒,3组保护率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 小肽基因缺失株经皮下途径感染BALB/c小鼠的毒力下降,鼠疫EV76ΔsORF34株较EV76疫苗株残存毒力进一步下降,但保护率差异无统计学意义(P>0.05),EV76ΔsORF34株有作为鼠疫减毒活疫苗候选株的潜力。     

鼠疫菌感染兔血清抗体谱分析

目的分析鼠疫耶尔森菌感染的兔血清(鼠疫菌感染兔血清)中抗体产生的种类与规律,为了解鼠疫菌的致病机制及筛选新的疫苗亚单位提供实验依据。方法利用含有145个鼠疫菌毒力相关蛋白的蛋白质芯片检测鼠疫菌感染兔血清抗体谱,并与鼠疫菌活疫苗EV76株免疫兔血清(免疫兔血清)抗体谱比较。结果在鼠疫菌感染兔血清中共检测到41个蛋白相应的抗体,其中28个抗体在免疫兔血清中也检测到,有6个蛋白抗体只在鼠疫菌感染兔血清中检测到。结论鼠疫菌感染兔血清的抗体谱与免疫兔血清的抗体谱不完全一致,通过对鼠疫菌感染兔血清抗体谱的研究,可为深入了解细菌的致病机制及筛选新的疫苗亚单位奠定基础。     

荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究

目的　利用LightCycler建立一种简便、特异的荧光定量PCR检测方法 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测。 方法　采用SYBRGreenI随机掺入法 ,以Roche试剂盒为标准 ,比较两公司的DNA聚合酶 ,用鼠疫菌 310 0 4建立荧光PCR反应体系 ;针对鼠疫耶尔森氏菌特异的染色体标识序列和质粒上F1抗原基因设计引物 ,检测其灵敏度和特异性 ,以盲测试验进行验证 ;在此基础上鉴定 2 75株鼠疫耶尔森氏菌 ,并测试该法检测脏器污染模拟标本的灵敏度。结果　建立以一个公司试剂为主较低成本的PCR反应体系 ;EV76的检测灵敏度可达每反应体系 1.6个菌 ;检测我国 18个生态型共计 2 75株鼠疫耶尔森氏菌及 2 8株非鼠疫菌株的PCR扩增结果表明 ,鼠疫菌株均出现特异的扩增结果 ,2 8株对照菌株均为阴性 ;肝、脾、肺模拟标本检测灵敏度可达每反应体系 4 0 0 0个菌。结论　该方法对于检测鼠疫耶尔森氏菌具有简便、快捷、高敏感性和特异性的特点 ,适用于鼠疫紧急疫情时的快速诊断和疫源地监测     

用放射免疫沉淀试验检查几种感染鼠疫菌的试验动物F1抗体

用RIP对感染鼠疫菌的黄胸鼠等5种鼠类血清和脏器进行测定,结果表明脏器可检出F1体:一般情况,检出菌及IHA阳性标本难于查出抗体,而检出F1抗体者又难于培养出鼠疫菌:血清抗体阳性率及滴度与鼠疫菌攻击量无相关关系而与感染率有一定关系。     

从动物和土壤中直接检测鼠疫耶尔森氏菌

目的　探讨用防污染的 PCR- EL ISA(U DPE)技术检测人为污染的土壤和感染的动物标本的可行性。方法　根据鼠疫耶尔森氏菌 Cafl和 Pla基因分别设计了 3条引物 ,组合成 3对引物 ,建立 U DPE检测技术。结果　利用该实验体系可以检出每克土壤中 10 0 0个鼠疫耶尔森氏菌的污染。比检测纯细菌的敏感性低 2 0 0倍 ,说明土壤中有抑制 PCR反应的因子。对 2 0只实验组动物 40份标本 (肝脏和脾脏 )的培养、U DPE和 PCR-电泳检测表明 ,3种方法的检出吻合率为 10 0 % ,均能从 40份标本中检出靶细菌 ,而用 3种方法检测对照组动物的 2 0份肝脏和脾脏均为阴性。结论　利用 UDPE技术可以被用于动物脏器中鼠疫耶尔森氏菌的检测     

鼠疫菌EV76对达乌尔黄鼠血气的影响

目的研究鼠疫菌EV76对达乌尔黄鼠血气各项指标的影响.方法用2亿个EV76菌株加0.25%的硫酸亚铁攻击实验动物8只;设正常对照一组8只.两组动物饲养观察2～7d后分别取动脉血进行血气测试.结果免疫组动脉血pH值极显著低于正常组(P＜0.01);Pco2显著高于正常组(P＜0.05);Po2极显著低于正常组(P＜0.01);K+显著高于正常组(P＜0.05).结论鼠疫菌EV76对生物机体血气各项指标影响显著.     

鼠疫耶尔森杆菌YPO0388蛋白的原核表达与鉴定

目的构建表达鼠疫耶尔森杆菌(Yersinia Pestis)的假想蛋白YPO0388的重组质粒,为鼠疫耶尔森杆菌的诊断方法的发展提供支持。方法用PCR方法扩增出ypo0388基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中转化到大肠杆菌(E.co-liBL21(DE3)),用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,用WesternBlot鉴定其免疫原性,并纯化出目的蛋白。结果根据单、双酶切鉴定和DNA测序结果显示,目的基因ypo0388已成功连接到表达载体pET32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物rYPO0388相对分子质量约为69.71kDa。重组蛋白经Western blot鉴定,能被兔抗鼠疫菌EV株血清识别。结论成功克隆并构建了pET32a-ypo0388重组基因原核表达系统,所表达的重组蛋白rYPO0388具有较好的可溶性与抗原性,有可能做为研制新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的备选抗原。     

鼠疫耶尔森杆菌蛋白YPO1996的融合表达与鉴定

目的在比较蛋白质组结果的基础上选择并构建pET32a-ypo1996,表达鼠疫耶尔森杆菌（Yersinia pestis）特异的假想蛋白YPO1996重组蛋白（rYPO1996）,为新鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的研究提供备选抗原。方法根据鼠疫菌CO92株全基因组序列设计引物,用PCR方法扩增目的基因YPO1996,将其定向插入表达载体pET32a（＋）上,转化至大肠埃希菌BL21（DE3）,用IPTG诱导,使重组质粒在工程菌中稳定高效地表达带组氨酸标签的融合蛋白,并亲和纯化该目的蛋白。通过SDS-PAGE方法对表达的蛋白产物进行初步分析,并用Western blot分析其抗原性。结果单、双酶切鉴定及DNA测序显示,目的基因YPO1996成功连接到表达载体pET32a（＋）上,SDS-PAGE显示表达产物分子质量单位约为53.11 ku,与预期值相符。重组蛋白经Western blot鉴定,能被兔抗免疫鼠疫菌EV株血清识别。结论成功构建了pET32a-ypo1996重组基因原核表达系统,表达的重组蛋白rYPO1996具有较好的可溶性及抗原性,可作为研发新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的备选抗原。     

鼠疫活菌苗接种人群和豚鼠血清学反应及豚鼠自动保护力试验观察

用PHA、PHA-SPA和ELISA-SPA法检测138人和40只豚鼠免疫接种后血清中FI抗体滴度。结果显示:在接种后的3个月内,人和豚鼠血清中抗体滴度分别介于1:20～1:2560和1:20～1:5120之间,免疫接种后6个月从人血清中未检出FI抗体,豚鼠的FI抗体滴度为1:20。人和豚鼠血清抗体阳转率在免疫接种后1个月分别为24～38％和100％,在免疫接种后3个月分别为2.1％和5～15％。免疫接种后3个月和6个月,用250和500MLP141鼠疫菌株攻毒的豚鼠的保护率分别为100％和50～80％。     

弱毒鼠疫菌在鼠蚤体内的繁殖和传播

本文观察印鼠客蚤叮咬带菌鼠,吸入弱毒鼠疫菌后,在体内可存活30天。再叮咬时可把鼠疫菌传给健康动物。而缓慢细蚤吸入弱毒鼠疫菌后,可在蚤体内大量繁殖,并存活20天。但叮咬健康动物,不能传播鼠疫,这与印鼠客蚤不同。