Livin和Survivin基因联合靶向siRNA重组表达载体的构建和鉴定

目的 构建Livin和Survivin联合靶向的siRNA重组表达载体,探讨用RNA干扰方法同时下调Livin和Survivin基因表达的增效作用.方法 通过前期的实验,分别从靶向Livin基因和Survivin基因的siRNA序列中各挑选出1对最有效的siRNA序列,然后采用1个载体编码2个shRNA技术,将其构建到同一个真核表达载体上,转化DH5a菌株,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析.结果 经酶切鉴定和测序分析证实Livin和Survivin联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功.结论 Livin和Survivin联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功.     

癌胚抗原相关细胞黏附分子6-shRNA及双自杀基因yCDglyTK的联合基因载体构建

目的 构建新型靶向联合双自杀基因载体pCDNA3.1-yCDglyTK-CEACAM6-shRNA.方法 根据已知的癌胚抗原相关细胞黏附分子6(Carcinoembryonic antigen associated cell adhesion molecule 6,CEA CAM6)序列构建含有hU6启动子和CEACAM6-shRNA表达框的重组质粒,并将CEACAM6-shRNA表达框(含hU6启动子)通过双酶切方式亚克隆至双自杀基因栽体pCDNA3.1-yCDglyTK,构建新型靶向联合双自杀基因载体pCDNA3.1-yCDglyTK-CEACAM6-shRNA.通过酶切、测序等鉴定重组质粒.结果 实验所构建的最终裁体酶切产物所得的片段大小为7.5 kb,与预期片段一致.测序证实最终载体与pCDNA3.1-ycDglyTK-CEACAM6-shRNA序列一致.结论 成功构建新型靶向联合双自杀基因载体pCDNA3.1-yCDglyTK-CEACAM6-shRNA.     

Survivin靶向的短发夹RNA表达载体的构建

目的：构建存活素（Survivin）基因短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）重组质粒并测序鉴定,为下一步探索乳腺癌基因治疗的RNA干扰途径建立基础。方法：设计并合成有小发夹结构的8条DNA片段,退火成互补双链后克隆至pSilencer adeno 1．0-CMV载体中构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5。菌株,提取质粒行酶切鉴定后测序分析。结果：酶切鉴定和测序结果证实构建成功。结论：survivin shRNA重组质粒的成功构建为下一步用腺病毒包装,并感染荷瘤裸鼠行靶向RNA干扰抗乳腺癌的研究打下基础。     

Nogo-A短发夹样RNA真核表达载体的构建

目的:构建靶向Nogo-A基因的短发夹样RNA(shorthairpinRNA,shRNA)真核表达载体。方法:根据Genebank中提供的Nogo-A基因核苷酸序列,设计并化学合成2条shRNA,退火后克隆到pGenesil-1质粒的U6启动子下游从而构建重组载体,行限制性内切酶酶切和基因测序进行鉴定。结果:序列分析结果表明,两个重组质粒的shRNA编码序列均成功插入到预定位置。结论:成功构建靶向Nogo-A的shRNA真核表达载体,为进一步研究Nogo-A蛋白的功能及轴突再生抑制的基因治疗提供了新的方法。     

靶向大鼠gnas基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定靶向大鼠gnas基因的小干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体.方法:根据大鼠gnas基因mRNA序列设计并合成3条shRNA特异性寡核苷酸片段,退火形成双链后克隆进入线性化pGenesil-1.1载体,并进行酶切鉴定和测序,同时构建针对大鼠GAPDH基因的阳性对照质粒和不具有基因同源性的非特异性基因的质粒做阴性对照.结果:经酶切和测序鉴定分析,构建的shRNA已成功插入载体,并且与设计序列完全相符.结论:成功构建了靶向大鼠gnas基因的shRNA真核表达载体,为后续研究Gs a 蛋白在心力衰竭中作用的体内外实验奠定了基础.     

Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和测序

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以survivin为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定. 方法:设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSilencer3.1-H1-hygro中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定. 结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列. 结论:Survivin靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,可利用所得的小RNA序列干扰survivin基因的mRNA转录,供抗肿瘤研究参考.     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和序列分析

目的 利用pgenesil-1质粒载体,以bcl-2为靶基因,设计构建重组体,以用于后继的RNA干扰研究.方法 设计3对有小发夹结构的两条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体pgenesil-1上构建重组体,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切电泳鉴定后,进行测序分析.结果 将合成的DNA片段退火后克隆至载体上,经酶切及序列鉴定为目的 序列.结论 靶向bcl-2基因转录shRNA的重组质粒可以在体外成功构建,为下一步利用该重组体干扰肿瘤细胞中bcl-2的mRNA转录,探索肿瘤基因治疗的新途径打下基础.     

靶向COX-2基因短发夹RNA重组表达载体的构建及鉴定

目的 利用RNA干扰技术,以COX-2为靶基因,构建靶向COX-2基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达质粒并进行鉴定分析.方法 设计、合成1对COX-2编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,经退火形成互补双链,通过定向克隆至质粒pGenesil-1,构建shRNA真核表达载体.转化JM109大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析;RT-PCR和Western blot检测重组表达质粒对COX-2 mRNA和蛋白表达的抑制效果.结果 酶切证实目的DNA定向克隆至载体上,测序分析结果与目的序列相同.RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组比较,pshRNA-COX-2重组表达质粒对β-actin基因无明显影响,而对COX-2有明显抑制作用.COX-2 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为66.9%和50.3%.结论 成功构建的靶向干扰COX-2基因重组质粒能够显著抑制COX-2基因表达.     

NF-κB基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的构建转录因子NF-κB的RNA干扰(RNAi)质粒,为研究NF-κB参与的细胞信号通路及以其为靶点的基因治疗提供稳定转染的RNAi质粒。方法设计针对NF-κB的shRNA特异性序列,应用基因重组技术克隆到pSilencer 1.0-U6表达载体,EcoRⅠ和ApaⅠ双酶切及DNA测序鉴定重组克隆;脂质体转染RNAi重组载体至前列腺癌细胞PC-3后,Western blot分析各组NF-κB蛋白表达水平。结果双酶切和DNA测序证实shRNA正确插入pSilencer 1.0-U6质粒;Western blot结果显示与空质粒对照组比较NF-κB转染组细胞NF-κB表达明显下调。结论成功构建人NF-κB基因RNAi质粒,为研究NF-κB参与的细胞信号通路提供了稳定转染细胞的干扰质粒,为靶向NF-κB的基因治疗提供了有力工具。     

靶向mdr1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:设计并构建靶向mdr1基因shRNA真核表达质粒.方法:以mdr1为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pSilencerTM 3.1-H1 neo载体,构建重组的短发夹shRNA表达载体.采用酶切法和测序法鉴定.结果:经限制性内切酶酶切电泳后显示有66 bp模板寡核苷酸片段和4.3 kbp的线性化的pSilencerTM 3.1-H1 neo载体片段.重组子测序结果与Genebank中的mdr1基因cDNA序列相符.结论:重组靶向mdr1基因shRNA表达载体构建正确,为进一步转染耐药的肿瘤细胞逆转肿瘤耐药研究奠定了基础.     

靶向PTTG和survivin双干扰siRNA表达载体的构建及鉴定

目的:构建同时干扰人垂体瘤转化基因(PTTG)和生存素(survivin)基因表达的RNA共干扰载体,并检测其对人脑胶质瘤U251细胞中PTTG基因和survivin基因的干扰作用.方法:根据GenBank数据库中PTTG和survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰PTTG和生存素基因的重组干扰质粒pGene...     

干扰HSP70-2的shRNA表达载体的构建及筛选

目的:利用pGenesil-1质粒构建针对热休克蛋白HSP70-2的短发夹RNA(shRNA)表达载体。方法:设计针对HSP70-2表达shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析。利用质粒转染大鼠精原细胞,用RT-PCR和Western blotting法检测转染后HSP70-2 mRNA和蛋白表达变化。结果:成功构建靶向HSP70-2的3个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-HSP70-21、pGenesil-1-HSP70-22和pGenesil-1-HSP70-23。酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。质粒筛选实验提示pGenesil-1-HSP70-23质粒对精原细胞HSP70-2基因的抑制作用最强,而pGenesil-1-HSP70-21的抑制作用最弱。结论:成功构建表达靶向HSP70-2的shRNA重组质粒载体。     

人细胞周期蛋白D1及细胞周期蛋白激酶CDK4的原核表达及鉴定

【目的】构建表达人细胞周期蛋白D1及细胞周期蛋白激酶CDK4融合蛋白的重组体。【方法】用RT-PCR从HL-60细胞中扩增细胞周期蛋白D1及CDK4基因片段,克隆到pGEM-Teasy载体上。测序鉴定后切下相应的片段,连接到表达载体pET-22b(+)上,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DL3),使之高效表达融合蛋白细胞周期蛋白D1及CDK4。SDS-PAGE电泳及Westernblotting鉴定表达蛋白。【结果】用PCR扩增得到了正确的目的基因片段并构建成pET-cyclinD1和pET-CDK4两个原核表达载体。将其转化大肠杆菌,Westernblot检测证实了转化的大肠杆菌能表达细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白。【结论】本研究成功构建了细胞周期蛋白D1及CDK4原核表达载体,后两者在细胞内能正确表达细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白。     

干扰转酮醇酶的短发卡RNA表达载体的构建与筛选

目的筛选出干扰小鼠转酮醇酶(TK)的短发卡RNA(shRNA)表达载体。方法针对TK基因序列设计4条TK干扰序列:hMGFP-shRNA1、hMGFP-shRNA2、hMGFP-shRNA3、hMGFP-shRNA4,PstⅠ酶切鉴定其序列。然后利用质粒转染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6,用逆转录-聚合酶链式反应和酶活性方法检测转染TKshRNA后Hepa1-6细胞内TK mRNA和蛋白表达变化。结果经酶切凝胶电泳证实shRNA载体构建正确,质粒筛选实验表明hMGFP-shRNA1质粒对TK基因的抑制作用最强。结论成功构建表达靶向TK的shRNA重组质粒载体。     

5-LO真核表达载体的构建及其在RAW264.7细胞中的表达的初步研究

目的构建5-LO真核表达载体并初步研究其在RAW264．7细胞中的表达,为建立5-LO高表达转基因小鼠模型提供表达载体。方法从人全血标本中提取细胞总RNA,以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法扩增5-LO基因,分别构建5-LO目的基因的克隆载体与表达载体,提取质粒,进行酶切、PCR和DNA测序鉴定,将重组融合表达载体pEGFP-5-LO稳定转染RAW264．7细胞,RT-PCR、western blot方法检测pEGFP-5-LO的表达情况。结果构建了重组克隆载体pUCm-5-LO和真核表达载体pEGFP-5-LO,经酶切、PCR及测序鉴定正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到pEGFP-5-LO融合蛋白的表达,RT—PCR和Westemblot结果表明转染pEGFP．5-LO的RAW264．7细胞中有5-LO的表达。结论成功克隆了5-LO基因,构建的表达载体pEGFP-5-LO在RAW264．7细胞中表达5-LO蛋白,为进一步5-LO高表达转基因鼠模型的建立和临床应用奠定了基础。     

发卡样CTGF特异性RNA干扰重组体的构建及筛选

目的：利用Pgenesil 1质粒载体构建介导结缔组织生长因子(CTGF)短发夹RNA表达的质粒，并筛选有效的抑制序列。方法:分别设计3对有小发夹结构的两条DNA序列及1对非特异对照序列，经退火成互补双链,再克隆至带有U6启动子的质粒载体Pgenesil 1中，构建重组体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析。将构建成功的4组重组体转染HSC T6 24?h后，通过半定量RT PCR分析HSC T6 CTGFmRNA的表达水平，与空白对照及仅加转染试剂组比较分析。结果:CTGF的shRNA片段被成功克隆到Pgenesil 1质粒载体中，经酶切与测序证实构建成功，转染HSC T6 24?h后，与空白对照组相比，通过半定量RT PCR分析发现有两组细胞CTGFmRNA水平明显下降，24?h抑制效率分别为(74±5)%,(P<0.01);(61±3)%,(P<0.05)。转染非特异shRNA组及仅加转染试剂组CTGFmRNA表达水平无明显变化。结论:成功构建了能表达CTGFshRNA的3组重组体，并筛选出能高效抑制CTGF表达的shRNA序列，为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了实验基础。     

大鼠野生型TRAF6基因和TRAF6 shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠野生型肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)基因及其特异性短发卡状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察其在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达和沉默TRAF6基因的情况?方法:用DNA重组技术将针对大鼠TRAF6基因的CDS区序列(加HA标签)和针对其不同位点所设计的3种shRNA序列分别克隆到pcDNA3.1及pGenesil-1/GFP真核表达质粒中?在酶切鉴定及序列测定正确后,用NeonTM电转仪,将上述质粒分别转染入培养的大鼠GMC中,然后用Western blot检查HA-TRAF6融合蛋白的表达情况,同时筛选最有效的TRAF6 shRNA?结果:限制性酶切及核酸序列分析确证,上述TRAF6基因过表达和shRNA表达质粒均构建成功?Western blot显示,构建的pcDNA3.1-HA-TRAF6质粒能在大鼠GMC中表达,且TRAF6 shRNA-1具有最佳的沉默效率?结论:本实验成功构建了大鼠野生型TRAF6真核表达质粒及其特异性的shRNA表达载体,这为今后进一步研究TRAF6基因的生物学功能提供了实验基础?     

结核分枝杆菌候选抗原基因克隆与表达质粒构建

目的 克隆并构建编码结核分枝杆菌(MTB)ESAT6，Ag85B和MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中分别扩增出ESAT6，Ag85B和MPT64基因(288bp，978bp and 687bp)，并克隆到T载体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转化大肠杆菌E．coli Dh5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与献报道一致，证实符合表达框架。结论 成功地克隆并构建了ESAT6，Ag85B和MPT64基因的重组表达质粒pGEX-ESAT6,pGEX-Ag85B和pGEX-MPT64。