人类Pax-5基因外显子1B的5''''侧翼区碱基序列分析

目的：探讨Pax- 5基因表达在B细胞分化发育的调节机制。方法：利用分子克隆及亚克隆技术对Pax-5基因外显子1B的5’侧翼区分离克隆。用双链双脱氧终止法进行核苷酸序列测定，并对侧序资料进行序列程序分析。结果：整段碱基序列（6671 hp）分析表明：无TATA盒共同序列存在，近段启动子包括3个CAT盒,1个SP1和1个E盒；上游进一步推测的调节位点显示6个LMO2COM，5个NFAT，2个LPOLYA-B，3个GATA1，2个AP4,10个AZF1，1个ETS1-B,1个GATA3，1个NKX25，2个RORA1,1个LYFI，2个Ikaros2,2个ICF11，1个GATA-C和1个FREAC7确定在序列上。结论：Pax-5基因外显子1B的5’侧翼区与Pax-5表达的调节有关，且对保证B细胞谱系和B细胞发育起重要调节作用。     

人类survivin基因的克隆及在胃粘膜中表达的初步分析

目的：克隆人类Survivin(SVV)基因并分析其在胃粘膜中的表达情况。方法：采用逆转录聚合酶链反应从人胃癌组织中克隆SVV基因，地高辛标记cRNA探针，原位杂交检测其在胃粘膜中的表达。结果：得到两个SVV基因cDNA克隆、即SVV－S4A与SVV－S1B，前者与已知SVV基因cDNA序列相同，后者发生了SVV第3外显子丢失。原位杂交显示SVV－S4A主要表达于胃癌细胞的胞质，SVV－S1B主要表达于正常胃组织。结论：SVV－S4A和SVV－S1B在胃癌组织与正常胃粘膜组织中的表达存在不同特征。     

Pax5对B细胞分化发育调控作用的研究进展

转录因子Pax5在B细胞定向分化发育过程中发挥重要调控作用。B细胞定向分化发育相关的转录因子如PU.1、干扰素调节因子4(Interferon regulatory factor 4,IRF4)、IRF8和NF-κB结合在Pax5基因5’上游增强子区,转录因子EBF、STAT5结合在Pax5基因5’上游启动子区,从而共同促进Pax5基因的表达。表达的Pax5蛋白不仅通过IgH的V(D)J片段染色质的甲基化和乙酰化修饰来调节IgH V(D)J重排,并且通过B细胞特异性基因(mb-1、VpreB、λ5、CD19、BLNK等)表达调控B细胞的定向分化发育。若Pax5基因缺失,影响组蛋白H3-K9的修饰,导致B细胞向非B细胞分化。总之,Pax5在B细胞定向分化发育中起到重要调控作用。     

雌激素和高胰岛素调节胰岛素受体底物-1，2表达机制研究

目的：研究雌激素和高浓度胰岛素对胰岛素受体底物(IRS)-1和-2表达的分子机理。方法： 将IRS-1，2基因5′调控区克隆至含荧光素酶表达载体pGL3质粒，转染HeLa细胞，加雌激素（1 nmol/L）或高浓度胰岛素(100 nmol/L)培养，检测IRS-1，2基因5′调控区相对转录活性。结果： 高浓度胰岛素刺激细胞48 h，IRS-2基因5′调控区相对转录活性减低，IRS-1无明显差异；雌激素处理显著增加IRS-1，2基因5′调控区的相对转录活性。结论： 高胰岛素可能通过作用于IRS-2基因5′调控区中胰岛素作用元件，使其转录活性降低。而雌激素则通过作用于IRS-1，2基因5′调控序列，使其转录活性提高，增强其表达。     

内皮素—1基因的研究进展

内皮素（ET）具有广泛的生物活性,为强效的缩血管肽和血管平滑肌细胞有丝分裂原,ET有族成员有三种异构体ET－1和ET－3,各种异构体之间仅有2－6个氨基酸不同,有组织特异性,人的ET－1基因全长12464bp,结构基因由5个外显子和3个内含子组,ET－1基因的表达决定于基因中的特异转录调节因子和其本身的结构,这些调控位点除存在于ET基因启子区结构中外,也存在于ET基因的3'端侧翼序列,GATA与AP1位点是ET－1启动子功能所必需的,GATA与AP1有协同作用,ET－1基因表达受许多因素的调控,各种因素通过作用于其受体,而影响一种或多种调控因子的表达,最后作用于ET－1基因的顺式调控元件,促进或抑制ET－1基因的顺式调元件,促进或抑制ET-1基因的表达,其中GATA和AP1位点的调控元件是ET－1基因调控的主要途径。     

内皮素-1基因的研究进展

内皮素 (ET)具有广泛的生物活性 ,为强效的缩血管肽和血管平滑肌细胞有丝分裂原。 ET家族成员有三种异构体ET- 1、ET- 2和 ET- 3,各种异构体之间仅有 2～ 6个氨基酸不同 ,有组织特异性。人的 ET- 1基因全长 12 46 4bp,结构基因由 5个外显子和 3个内含子组成。ET- 1基因的表达决定于基因中的特异转录调节因子和其本身的结构。这些调控位点除存在于ET基因启动子区结构中外 ,也存在于 ET基因的 3′端侧翼序列。GATA与 AP1位点是 ET- 1启动子功能所必需的 ,GATA与AP1有协同作用。ET- 1基因表达受许多因素的调控 ,各种因素通过作用于其受体 ,而影响一种或多种调控因子的表达 ,最后作用于 ET- 1基因的顺式调控元件 ,促进或抑制 ET- 1基因的表达。其中 GATA和 AP1位点的调控元件是 ET- 1基因调控的主要途径。     

CaMK Ⅱα基因启动子的克隆和神经细胞特异性Cre表达载体的构建

目的克隆和鉴定CaMKⅡα基因启动子序列，构建神经细胞特异性Cre重组酶的真核表达载体。方法采用高保真PCR方法分步扩增CaMKⅡα基因5′端8．1kb的调控区DNA片段，该片段包括了CaMKⅡα基因5′端调控区的所有序列。经克隆和部分序列测定后，依次与pCre—IRES—EGFP质粒框架连接，构建载体。结果克隆的CaMKⅡα基因5′端侧翼区酶切图谱与公布的C57BL/6J小鼠相应序列的酶切位点相一致，其中文献报道的富含顺式调控元件的序列与公布的小鼠序列完全相同。CaMKⅡα基因启动子正确地连接于Cre基因的5′端，构建了目标载体。结论这一载体的构建为建立前脑神经细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠奠定了基础，有助于神经系统相关疾病的研究。     

6q25区域内一个新基因MTLC的克隆及特性分析

目的：克隆6q25区域内喉癌相关新基因。方法：以表达序列标签为电子探针，在人类基因组数据库中进行电子杂交，钓出相就基因组DNA克隆后进行基因预测。根据获得的基因序列设计引物，逆转录－聚合酶链反应扩增新基因cDNA。结果：克隆了1个6q25区域内的新基因。该基因全长约21kb，含两个外显子，其cDNA序列长1006bp，编码蛋白包括235个氨基酸。其5’侧翼序列存在癌蛋白c-Myc的结合位点，将其命名为MTLC（c-Myc target from laryngeal cancer cells）基因。同源性分析表明该基因编码蛋白与小鼠MT－MC1蛋白同源性达78％。MTLC蛋白一级结构含有一个核定位信号结构域，亚细胞定位实验证实该基因主要在细胞核表达，Northern印迹分析表明MTLC基因在心肌、肝、肾、脑等多个组织有表达。结论：成功克隆了1个新基因MTLC，该基因可能作为c-Myc的靶基因以转录因子形式参与维持细胞正常生理功能。     

人EPHB2基因启动子的初步鉴定

目的为进一步研究人EPHB2基因的表达调控机制,初步鉴定、分析该基因的启动子。方法在对人EPHB2基因的生物信息学分析的基础上,在EPHB2基因的转录起始位点已明确的前提下,克隆了该基因的5′侧翼区,并对该区进行功能分析,分别构建了5种含不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达质粒,将它们瞬时转染293细胞,检测其荧光素酶活性。结果EPHB2的5′侧翼区的-138～ 83区域的启动子活性不高,而从-425～ 83开始显著升高,-1174～ 83区域的启动子活性又出现明显降低。结论人EPHB2基因启动子的较小区域位于其5′侧翼区的-425～-139区域。另外,在-1174～-970区域可能存在着沉默子。     

P选择蛋白的高度多态性:在心肌梗死(MI)病人中Pro715等位基因频率减少

P选择蛋白是一种在激活细胞表面表达的粘着分子，它能介导激活的上皮细胞或血小板与白细胞之间的反应。P选择蛋白在动脉粥样硬化斑处表达增加，在不稳定型心绞痛病人中也发现这种蛋白分子具有高血浆水平。作者把P选择蛋白作为一种心肌梗死（MI）的可能候选基因进行了研究。P选择蛋白基因定位于lq2卜24，全长大于50汕，含有17个外显子。通过聚合酶链反应／单链构象多态（PCR／SSCP）和测定序列筛查了患者的4O个等位基因的宁侧翼区和外显子的多态性，确定了13个多态，5个在5’侧翼区，8个在外显子序列，有4处多态（Ser290Asn，Asn562A…     

低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因的基因组结构

目的 确定2低密度脂蛋白受体相关蛋白5（low density lipoprotein receptor related protein,5 LRP5）的基因组结构。方法 以LRP5基因的cDNA序列为线索，采用计算机杂交方法首先通过对比分析该基因的cDNA序列和基因组序列，初步确定LRP5基因的基因组结构，按分析得到的基因组结构设计引物，扩增并测定外显子序列和外显子内含子接头序列，确定该基因的基因组结构。结果 LRP5基因的基因组DNA全长为131.6kb，含4有23个外显子和22个内含子；在编码序列中检测到3个单核苷酸多态，即位于第2外显子的A459G，位于第10外显子的C2220T和位于第21外显子的G4416C；LRP5基因含有4个已知的短串联重复序列，即D11S1917，D11S4087，D11S1337和D11S4178，它们分别位于该基因的5'端和第1，4，13内含子内。结论 LRP5基因的基因组结构的确定，为分析该基因突变和功能研究奠定了基础。     

t(1:19)易位的人类白血病:Pbxl同源结构域蛋白与E_2A蛋白融合构建成转录活化因子

同源结构域蛋白通过调节含特定DNA识别序列的靶基因影响发育分化。某些同源盒基因的异常表达及突变同源结构域的表达,导致人类T与B细胞白血病的异常分化。约有20％的前B细胞急性淋巴细胞白血病患儿,出现t(1:19)(q23:p13.3)染色体易位,即定位于1号染色体t(1:19)易位断裂点的Pbxl基因与E2A转录因子基因的5'末端融     

MPTP损伤侧猴中脑黑质组织的基因表达

目的：采用mRNA差异显示技术（mRNA differential display,mRNA DD)寻找MPTP诱导和未诱导的猴中脑黑质组织差异表达的cDNA。方法：对诱导侧及未诱导侧的黑质mRNA用3′端3个锚定引物分别与5′端30种随机引物进行逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色显示目的的条带。结果：获得一批表达差异的cDNA片段，对其克隆后作DNA序列测定，同源性比较分析发现，其中2个克隆为未知序列，已被GenBank接收，接收号为AF159161、AF159162。结论：MPTP诱导后黑质可能有效新基因的表达。     

fgfr3基因敲除载体的构建及中靶ES细胞的筛选与鉴定

目的构建成纤维细胞生长因子3型受体(nbroblast growth factor receptor-3,FGFR3)基因敲除载体,并对中靶ES细胞进行筛选与鉴定,为最终建立FGFR3条件性敲除小鼠模型或FGFR3功能减低小鼠,研究FGFR3在小鼠骨骼等器官发育、损伤修复过程中的作用打下基础。方法在分析小鼠fgfr3基因组DNA序列结构的基础上,设计并构建了针对小鼠fgfr3外显子9、10的条件性基因敲除载体,采用电穿孔法转染ES细胞,用G418与Gancyclovir对电转的ES细胞进行正负筛选,最后对ES细胞克隆做Southern与PCR鉴定。结果对ES细胞正负筛选后共挑取180个克隆;用5′端探针进行Southern杂交鉴定后发现2株阳性克隆;经PCR检测发现这两株克隆fgfr3的8号内含子内的LoxP序列丢失。结论得到两株fgfr3基因中只含有neo基因的ES细胞克隆,fgfr3的表达是降低的,可用来建立FGFR3功能降低的小鼠。     

定位于12q24的腓骨肌萎缩症2L型10个候选基因的排除克隆

目的克隆定位于12号染色体微卫星标记D12S1720和D12S161l之间约6．8cM的区间内的腓骨肌萎缩症2L型的致病基因。方法应用生物信息学方法筛选10个候选基因，设计合成扩增10个基因外显子及外显子与内含子交界的引物，DNA直接测序法进行序列变异分析。结果在基因外显子及侧翼区共发现11个序列变异，其中杂合序列变异共5个，纯合序列变异共6个。上述序列变异与疾病表型无共分离现象。结论排除了10个候选基因（TAOK3、RAB35、RPLPO、PXN、RIVFl0、RHOF、VPS33A，RSN、DENR、RNP24）为腓骨肌萎缩症2L型致病基因的可能。发现了以上10个候选基因共11个单核苷酸多态，除镜影细胞（reed-steinberg cell，RS）细胞特异性中间丝相关蛋白基因的3207G→C在多态数据库已报道，其余均为新发现的单核苷酸多态。     

一个新的锌指蛋白基因ZNF333 cDNA的分离及表达谱分析

本研究通过生物信息学和分子生物学相结合的方法成功克隆了一个新的锌指蛋白基因ZNF333 cDNA。ZNF333基因包含14个外显子，编码665个氨基酸。蛋白质N端包含2个保守的KRAB－A盒，2个多态的KRAB－B盒，而C端包含10个重复的C2H2型锌指基序。ZNF333的表达在心脏组织中最高，在其他组织中也可检测到表达。同时还发现该基因存在选择性剪切形式。通过与人类基因组框架图的比较将ZNF333定位在19p13.1。     

人神经母细胞瘤细胞株Nav1.5 Na~+通道编码基因Nav1.5/SCN5A的克隆

目的克隆人神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB-1)细胞河豚毒抵抗型(TTX-R)Nav1.5Na+通道编码基因Nav1.5/SCN5A。方法使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对NB-1细胞TTX-R Nav1.5Na+通道α亚单位编码基因Nav1.5/SCN5A进行克隆。结果人神经母细胞瘤Nav1.5Na+通道编码基因Nav1.5/SCN5A命名为hNbR1,其开放阅读框架可编码2016个氨基酸残基。序列分析显示其与心肌Nav1.5/SCN5A基因(hH1)编码的氨基酸相似性达99.1%;在DⅠ/SS1-SS2之间,存在一个半胱氨酸(c373)残基,提示hNbR1为TTX-RNa+通道;DⅠS3-S4之间一个位于第3号染色体的新的外显子(第6A外显子)编码了该通道α亚单位。另外,一个删除了DⅡ-Ⅲ之间第18外显子的选择性剪接体(hNbR1-2)被发现。结论 Nav1.5/SCN5A基因新的变构体参与编码神经肿瘤组织Nav1.5Na+通道,同时发现该基因的一个新外显子参与编码该通道,且发现Nav1.5/SCN5A基因比以往所知具有更加广泛的表达。     

四环素基因表达调控系统介导的HBV X基因体外表达细胞株的建立

目的：建立稳定，高效的HBxAg体外表达的细胞株，以便进一步研究HBV X基因和HBxAg的致癌作用及机理，方法：构建带有完整四环素基因关闭（Tet-off)系统的HBV X基因重组表达质粒pBPSTR1-FlagX，用该重组质粒转染NIH 3T3细胞，筛选嘌呤霉素抗性细胞克隆，用抗－FlagM2单抗和兔抗－HBx作蛋白质免疫印迹分析，检测细胞内Flag-HBxAg表达和四环素调控其表达的情况。结果：重组质粒pBPSTR1-FlagX转染NIH 3T3细胞后获得30个生长良好的嘌呤霉素抗性细胞克隆。其中12个细胞克隆有Flag-HBxAg的稳定表达，且有5个克隆的Flag-HBxAg表达受四环素调控，当四环素浓度逐渐增高时，细胞内Flag-HBxAg的表达逐渐减弱。四环素浓度达1μg/ml时，Flag-HBxAg表达被完全抑制。结论：本研究成功构建了四环素调控系统介导的HBV X基因体外表达细胞株，该细胞株不仅能稳定高水平地表达HBxAg，而且具有定时“开”“关”和定量调节HBxAg表达水平的特性，是HBVX基因功能研究的一个有用工具。     

人朊蛋白基因外显子Ⅰ及其上游序列具有启动子样活性

目的 鉴定朊蛋白（ＰｒＰ）基因转录启动子位置。方法 利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增人ＰｒＰ基因外显子Ⅰ及其上游序列，序列鉴定后插入ＣＡＴ报道质粒ｐＢＬ－ＣＡＴ６，分别转染ＨｅＬａ、ＣＯＳ７和Ｓｈ－ｓｙ５ｙ细胞系，检测ＣＡＴ表达值；提取三种细胞蛋白，以条带移动实验检测细胞转录激活因子ＳＰ１含量。结果 人ＰｒＰ基因外显子Ｉ及其上游序列为ＧＣ富含，带有多个ＳＰ１可能性综合位点，但无明显ＴＡＴＡ盒；瞬时转染结果显示这段序列可诱导２～３倍的ＣＡＴ表达增强；定量移动条带实验证明ＨｅＬａ细胞中含有较高浓度的ＳＰ１，而ＣＯＳ７和Ｓｈ－ｓｙ５ｙ细胞中ＳＰＩ含量极低。结论 人ＰｒＰ基因外显子Ｉ及其上游序列具有启动子样功能，为弱的非ＴＡＴＡ盒启动子；不同组织来源的细胞中ＳＰ１含量不同，在神经细胞系Ｓｈ－ｓｙ５ｙ中人ＰｒＰ基因外显子Ｉ