抑制连接蛋白43介导半通道活性促进脂多糖诱导的人牙髓细胞成牙本质分化

目的 ：探讨连接蛋白43(connexin 43,Cx43)在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的人牙髓细胞（human dental pulp cells,hDPCs）成牙本质分化过程中的作用和机制。方法：建立SD大鼠上颌第一磨牙损伤模型,免疫荧光（im munofluorescence,IF）染色检测Cx43在牙髓组织损伤后修复中的表达模式变化。分别采用0、1、10、100和1 000 ng/mL LPS刺激hDPCs 6 h,筛选最适浓度,随后抑制和过表达hDPCs中Cx43的表达。实时定量PCR(qRT-PCR)及免疫印迹法检测Cx43和成牙本质分化相关因子牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP）、牙本质基质蛋白1(dental matrix protein-1,DMP-1)、成骨相关转录因子（osterix,Osx）表达及细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinase,ERK）活性变化。进一步对hDPCs施以特异性Cx43通道抑制剂,检测Cx43介导的通道活性在hDP...     

低浓度氟化钠对人牙髓细胞的成骨/成牙本质分化的影响

目的 探讨低浓度氟化钠对人牙髓细胞（human dental pulp cells,hDPCs）成骨/成牙本质分化的影响。方法 本研究已通过单位伦理委员会审查批准。原代培养hDPCs，采用MTT法检测不同浓度氟化钠对hDPCs增殖的影响；选取合适浓度的氟化钠加入成骨/成牙本质分化诱导培养液中，对hDPCs进行体外诱导，通过茜素红染色检测hDPCs成骨/成牙本质分化能力的变化，RT-qPCR检测分化相关基因的mRNA表达；同时通过RT-qPCR和Western blot检测h DPCs成骨/成牙本质分化过程中内质网应激相关基因的表达。结果 低浓度氟化钠（0.1 mmol/L）在体外可刺激h DPCs增殖，高浓度氟化钠（5～10 mmol/L）可抑制hDPCs增殖（P<0.05）。选取0.1 mmol/L氟化钠体外混合成骨/成牙本质分化诱导培养后hDPCs的茜素红染色增加，成骨/成牙本质分化相关基因牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP）、骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）和骨钙蛋白（osteocalcin,OCN）mRNA...     

人牙髓细胞内Smad 2、3在转化生长因子β1信号转导中的作用

目的：探讨人牙髓细胞内Smad 2、3在转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1)信号转导过程中的作用。方法：原代培养人牙髓细胞，用激光共聚焦显微镜观察TGF－β1刺激初期牙髓细胞内Smad 2、3由胞质向胞核转位的现象，同时采用Western blot方法检测刺激后期Smad 2、3蛋白表达的变化。结果：TGF－β1刺激2h内，Smad2、3在胞质中表达渐弱，在胞核内表达渐强，呈现由胞质向胞核逐步转位的趋势。Smad 2蛋白总量在TGF－β1刺激前后几乎无变化，而Smad 3在刺激后24h表达量明显下降，48h后表达十分微弱。结论：Smad 2、3可能是人牙髓细胞内TGF－β1的信号转导分子。TGF－β1刺激初期Smad 2、3通过发生转位参与转导TGF－β1信号至核内，刺激后期Smad 3表达水平的下调可能与TGF－β1负反馈调节自身的信号有关。     

促红细胞生成素对人牙髓细胞增殖和成骨分化的影响

目的：探讨促红细胞生成素（EPO）对体外培养的人牙髓细胞（hDPCs）增殖和成骨分化的影响。方法：体外培养鉴定人牙髓细胞。使用 EPO 对在成骨诱导培养基中培养的牙髓细胞进行刺激,CCK-8检测 EPO 对牙髓细胞增殖的影响;20 U ／ml EPO 培养 hDPCs 7 d 和14 d,采用碱性磷酸酶活性（ALP）检测和茜素红染色观察 EPO 对牙髓细胞矿化的影响;利用 Real-time PCR 检测加入 EPO 后牙髓细胞成牙本质向分化相关基因的表达情况。结果：EPO 以时间和剂量依赖性方式促进牙髓细胞的增殖;20 U ／ml 的 EPO 后作用,牙髓细胞碱性磷酸酶活性显著提高（P ＜0．05）,钙结节形成明显增多;成牙本质向分化相关基因 DSPP、OCN、OSTERIX、RUNX2的表达明显上调（P ＜0．05）。结论：EPO 能促进人牙髓细胞的增殖和分化。     

Notch 1信号蛋白在早期牙髓损伤修复中表达的免疫组化研究

目的 :通过建立大鼠牙髓损伤动物模型 ,观察Notch1信号蛋白在牙髓损伤修复过程中的表达。方法 :在大鼠第一磨牙牙合面开髓 ,分别对损伤后 2h、12h、2 4h、3d、7d及正常大鼠牙髓标本进行HE染色、免疫组化染色 ,检测各组标本中Notch1信号的表达。结果 :Notch1信号蛋白在正常成年大鼠牙髓组织中无表达 ,在牙髓损伤后表达上调。牙髓损伤 12h ,Notch1在成牙本质细胞层、部分牙髓细胞间质中呈弱阳性表达。损伤后 1～ 3d ,Notch1在成牙本质细胞层、部分牙髓细胞间质及接近损伤部位的牙髓细胞中呈阳性着色。损伤后 7d ,Notch1的表达位于成牙本质细胞层和穿髓孔下方的细胞增殖层。结论 :Notch1信号蛋白在大鼠牙髓损伤后早期阶段表达逐渐上调 ,随后在成牙本质细胞区及富细胞区牙髓细胞中表达增强 ,并沉积于穿髓点附近的细胞增殖层。提示它可能在牙髓损伤的早期自身修复和牙本质矿化中起作用     

重组人结缔组织生长因子对牙髓细胞增殖与成牙本质分化的影响

目的：研究重组人结缔组织生长因子（recombinant connective tissue growth factor, rCTGF）对牙髓细胞（human dental pulp cells,hDPCs）增殖及分化的影响。方法：利用不同浓度（0、1、10、100 ng/mL）rCTGF分别处理牙髓细胞,CCK8法检测牙髓细胞增殖情况;茜素红染色和半定量试验检测细胞矿化结节的形成变化,qRT-PCR测定成牙本质分化相关基因DMP-1、DSPP和OC的表达情况,Western 免疫印迹法测定rCTGF刺激牙髓细胞后,ERK1/2信号通路的磷酸化水平。采用SAS 9.3软件包对数据进行统计学分析。结果：高浓度的rCTGF（100 ng/mL）可以促进牙髓细胞增殖;经矿化诱导后,10 ng/mL rCTGF促进牙髓细胞矿化结节形成的效果最好,钙盐沉积量最明显（P<0.05）,成牙本质分化相关基因DMP-1、DSPP的表达显著上调（P<0.05）。Western 免疫印迹结果显示,10 ng/mL rCTGF刺激牙髓细胞后,p-ERK1/2蛋白的表达升高。结论：rCTGF可能通过激活ERK1/2信号通路,促进牙髓细胞的增殖与分化。     

Cx43通过Erk1/2促进BMP-2诱导的人牙髓细胞成牙本质分化

目的:探讨骨形态发生蛋白(BMP)-2和连接蛋白(Cx) 43在促进人牙髓细胞(hDPCs)成牙本质分化过程中的联系。方法:在hDPCs中过表达Cx43并施以300 ng/m L BMP-2刺激1 h,qRT-PCR、Western blot和免疫荧光(IF)检测成牙本质分化标记物的表达变化;检测BMP-2介导的Smad1/5/9和Erk1/2通路活性,并施加PD98059(Erk1/2抑制剂)刺激1 h,检测抑制Erk1/2后过表达Cx43对BMP-2诱导的DSPP等的表达变化影响。结果:BMP-2上调hDPCs内osterix、DSPP、DMP-1、ALP和OCN RNA水平以及osterix蛋白表达,增强hDPCs中DSPP的荧光强度。过表达Cx43明显促进BMP-2诱导的hDPCs成牙本质分化。BMP-2激活hDPCs中的Smad1/5/9通路,过表达Cx43上调hDPCs中Erk1/2磷酸化水平。抑制Erk1/2明显减弱过表达Cx43对BMP-2诱导的osterix、DSPP、DMP-1、ALP、OCN mRNA表达以及osterix蛋白水平和DSPP染色强度的增强作用。结论...     

Smad8在成牙本质细胞系MDPC-23内BMP-2信号转导中的作用

目的：观察成牙本质细胞系MDPC-23内Smad8蛋白的表达,以及Smad8蛋白在骨形成蛋白-2（bonemorphogenetic protein-2,BMP-2）信号转导中的作用.方法：免疫组化法观察MDPC-23细胞内Smad8蛋白的表达,以及BMP-2和转化生长因子β1（TGF-β1）对MDPC-23细胞内Smad8分子定位的改变.结果：MDPC-23细胞的胞浆和胞核均有Smad8表达,在BMP-2刺激1 h后,Smad8从胞浆向胞核转位聚集.TGF-β1刺激后无类似现象发生.结论：成牙本质细胞系MDPC-23内存在Smad8的表达,且Smad8可特异性地将BMP-2的信号由胞浆转至胞核,但不能转导TGF-β1信号.     

高迁移率族蛋白B1对人牙髓细胞迁移能力和增殖效应的影响术

目的：观察高迁移率族蛋白B1（HMGBl）在人牙髓细胞（Human dental pulp cells,hDPCs）中的表达,以及对hDPCs增殖和迁移能力的影响。方法：采用组织块培养法,培养原代hDPCs,取第3-6代细胞用于实验。免疫荧光检测HMGBl在hDPCs中的表达及定位;分别用含不同质量浓度（0．1ng／mL、1ng／mL、10ng／mL、50ng／mL、100ng／mL、500ng／mL、1000ng／mL）HMGBl的培养液培养hDPCs,5天后采用CCK一8法检测细胞增殖能力;细胞划痕实验法观察1ng／mL质量浓度HMGBl对hDPCs迁移能力的影响。结果：HMGBl表达在hDPCs胞核：低浓度HMGBl（O．1ng／mL、1ng／mL、10ng／mL、50ng／mL、100ng／mL）明显促进细胞增殖;1ng／mLHMGBl明显促进hDPCs迁移能力。结论：HMGBl表达在正常hDPCs胞核中,细胞外低浓度HMGBl可以促进细胞增殖和迁移。     

转化生长因子-β受体在人牙髓中的表达和意义

目的：探讨转化生长因子β受体在人牙髓中的表达和牙髓细胞对 Ｔ Ｇ Ｆβ作用的反应机理。方法：用免疫组化方法检测转化生长因子βⅠ型受体（ Ｔβ Ｒ Ｉ）和Ⅱ型受体（ Ｔβ ＲⅡ）在健康及龋坏人牙髓中的表达。结果：转化生长因子βⅠ型受体和Ⅱ型受体在成牙本质细胞层强阳性表达,其中Ⅰ型受体较Ⅱ型受体表达量多,两种受体在成牙本质细胞层下方的富细胞区及中心部牙髓有表达或弱表达,龋坏牙髓与正常牙髓有相同的反应模式。结论：转化生长因子βⅠ型和Ⅱ型受体在健康及龋坏人牙成牙本质细胞及牙髓其它细胞皆有表达,提示成牙本质细胞及牙髓其它细胞在牙髓损伤修复过程中具有重要作用。     

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目的观察大鼠磨牙应用矿物三氧化物凝聚体（MTA）直接盖髓术后牙髓组织中转化生长因子-β1（TGF—β）的表达变化及其在牙髓损伤修复中的作用。方法本研究于2012年10月至2013年3月在中国医科大学口腔医学院中心实验室进行。28只雌性Wistar大鼠第一磨牙机械穿髓后用MTA直接盖髓,并以对侧第一磨牙为对照,分别于术后1、3、5、7、14、21、28d处死动物并取材（每次处死4只）,进行免疫组化染色,观察TGF-β1在牙髓组织的动态表达和定位情况,用图像分析软件测定各组标本中TGF—β1阳性染色的光密度值。结果在正常牙髓组织中TGF—β1基本无表达,MTA直接盖髓后TGF—β1表达强度呈先升高后降低的基本变化,其中盖髓后5d的TGF—β1表达最强,21d时接近正常水平。表达主要位于盖髓剂下方中性粒细胞、成牙本质细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞。结论MTA直接盖髓后,TGF—β1可能参与牙髓的损伤修复过程。     

miR-146a在人牙髓细胞中的表达及其作用研究

目的 检测miR-146a在正常及脂多糖（LPS）刺激的人牙髓细胞（hDPC）中的表达,探讨miR-146a对hDPC分泌炎性因子的影响及其机制.方法 （1）实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）方法测定正常及LPS刺激的hDPC miR-146a的表达水平.（2） Lipofectamine 2000脂质体分别转染化学合成的miR-146a类似物（miR-146a mimics）、miR-146a抑制剂（miR-146a inhibitor）及其相应无关序列小RNA对照,转染24 h后1μg/ml LPS刺激hDPC,4h后实时荧光定量PCR检测白细胞介素6（IL-6）、IL-8 mRNA的表达,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞上清IL-6、IL-8的分泌;Western blot 法检测miR-146a下游靶标白细胞介素1受体相关激酶1（IRAK1）及肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）的蛋白表达水平.两组比较采用独立样本t检验,多组比较采用方差分析.结果 （1）经LPS刺激的hDPC miR-146a表达水平高于正常hDPC（12 h：t=8.488,P=0.014;24 h：t=39.661,P＜0.001）.（2）转染miR-146a mimics的hDPC在1μg/mlLPS刺激下产生炎性因子IL-6、IL-8的水平低于阴性对照,差异有统计学意义（IL-6 PCR：P＜0.001,IL-6 ELISA：P＜0.001;IL-8 PCR：P＜0.001,IL-8ELISA：P=0.011）;过表达miR-146a后IRAK1及TRAF6蛋白水平明显下调（IRAK1：P=0.002; TRAF6：P＜ 0.001）.结论 miR-146a在LPS刺激的hDPC中表达上调,转染miR-146a可下调其靶基因IRAK1及TRAF6表达并降低IL-6、IL-8分泌,推测miR-146a参与牙hDPC的炎症反应调控.     

自体来源富血小板血浆对大鼠牙髓细胞增殖作用的研究

目的:初步探讨富血小板血浆及之中生长因子对大鼠牙髓细胞增殖的作用.方法:采用Landesberg 法制备PRP,ELISA测定PRP中两种主要生长因子:转化生长因子(TGF - β1)和血小板源性生长因子(PDGF -AB)的浓度;CCK-8法观察5％、10％PRP在48h时对牙髓细胞的增殖作用;在5％PRP中加入TGF-β1抗体和PDGF-AB抗体分别拮抗TGF-β1和PDGF-AB的作用并观察对细胞增殖的影响.结果:所制备的PRP中血小板含量为1790.58±388.08×109个/L,ELISA的方法测定PRP中TGF-β1及PDGF-AB的浓度分别为3.080 ng/ml和10.706 ng/ml.CCK-8法测定5％和10％PRP对牙髓细胞均有增殖作用(P＜0.05,与对照组相比);屏蔽生长因子可以明显改变5％PRP对大鼠牙髓细胞的增殖作用(P＜0.05);拮抗PDGF-AB组比拮抗TGF - β1组降低增殖作用明显(P＜0.05).结论:本实验制备的PRP含有高浓度的TGF - β1及PDGF-AB,不同浓度的PRP均能有效促进牙髓细胞增殖;屏蔽PDGF-AB明显降低5％PRP对大鼠牙髓细胞的增殖作用.     

组蛋白去甲基化酶KDM5A在人牙髓细胞及成牙本质细胞分化中的表达

目的探讨组蛋白赖氨酸去甲基化酶KDM5A在人牙髓细胞（hDPC）中的表达模式及成牙本质分化诱导对其表达量的影响。方法体外培养hDPC,实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot检测第1代至第8代（P1-P8代）hDPC中KDM5A mRNA和蛋白的表达量;免疫荧光检测KDM5A在hDPC中的分布;对P3代细胞进行成牙本质分化诱导,于第7天和第14天分别检测KDM5A mRNA和蛋白的表达水平。结果体外传代培养hDPC中可检测到KDM5A的表达,KDM5A mRNA和蛋白量均呈先增加后减少的趋势;hDPC细胞质及细胞核中均表达KDM5A;成牙本质向分化诱导7和14 d,KDM5A mRNA和蛋白量高于未诱导组细胞,诱导14 d表达量高于诱导7 d（P〈0.05）。结论 hDPC表达KDM5A,矿化诱导可提高KDM5A的表达。     

硅酸钙生物陶瓷对牙髓细胞体外增殖分化的影响

目的:应用硅酸钙(CaSiO3,CS)生物陶瓷作用于人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs),研究其对hDPCs增殖及向成牙本质细胞方向分化的影响。方法:从年轻健康患者(18²0岁)拔除的智齿或前磨牙牙髓组织中获取hDPCs进行培养。将质量浓度为0.2 g/mL的CS浸提液按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64和1/128倍比稀释后作用于hDPCs。MTT实验检测不同质量浓度CS浸提液对hDPCs增殖的影响,进而筛选出最佳浓度。以最佳质量浓度(1/64倍比稀释)CS浸提液培养hDPCs 2、4 d后,Real-Time PCR检测以下hDPCs成牙本质相关基因的表达:牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein 1,DMP-1),Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,COL-Ⅰ)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN);培养7、14 d后碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及半定量检测ALP活性。结果:最佳质量浓度(1/64倍比稀释)CS浸提液能够促进hDPCs的增殖,对牙髓细胞DSPP、DMP-1、COL-1、OPN等成牙本质相关基因的表达有较为明显的促进作用。ALP染色及半定量分析显示该浓度的CS浸提液能够提高hDPCs分泌ALP的活性。结论:最佳质量浓度(1/64倍比稀释)CS浸提液能够明显促进hDPCs的增殖,提高成牙本质相关基因的表达,进而促进hDPCs向成牙本质细胞方向分化,为后期hDPCs结合CS支架材料进行牙本质再生的研究打下基础。     

大鼠磨牙矿物三氧化物凝聚体直接盖髓术后牙髓组织中转化生长因子-β1表达变化研究

目的 观察大鼠磨牙应用矿物三氧化物凝聚体（MTA）直接盖髓术后牙髓组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达变化及其在牙髓损伤修复中的作用。方法 本研究于2012年10月至2013年3月在中国医科大学口腔医学院中心实验室进行。28只雌性Wistar大鼠第一磨牙机械穿髓后用MTA直接盖髓,并以对侧第一磨牙为对照,分别于术后1、3、5、7、14、21、28 d处死动物并取材（每次处死4只）,进行免疫组化染色,观察TGF-β1在牙髓组织的动态表达和定位情况,用图像分析软件测定各组标本中TGF-β1阳性染色的光密度值。结果 在正常牙髓组织中TGF-β1基本无表达,MTA直接盖髓后TGF-β1表达强度呈先升高后降低的基本变化,其中盖髓后5 d 的TGF-β1表达最强,21 d时接近正常水平。表达主要位于盖髓剂下方中性粒细胞、成牙本质细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞。结论 MTA直接盖髓后,TGF-β1可能参与牙髓的损伤修复过程。     

Toll样受体4在人成牙本质细胞和牙髓组织中的表达

目的 探讨人牙髓组织和成牙本质细胞中Toll样受体4（TLR4）的表达与分布特点，及其在牙髓组织天然免疫防御中的可能作用。方法从新鲜拔除的人第三磨牙获取牙髓组织和成牙本质细胞，扫描电镜观察牙髓摘除后髓腔壁成牙本质细胞形态和附着情况；RT—PCR检测人牙髓组织以及成牙本质细胞中TLR4mRNA的表达情况：采用免疫印迹技术和免疫组织化学方法检测TLR4蛋白的表达与定位。结果扫描电镜观察牙髓摘除后成牙本质细胞大部存留在髓室壁上，细胞形态良好：RT-PCR结果发现健康牙髓、成牙本质细胞均可表达TLR4mRNA，产物大小为278bp；免疫印迹法检测正常牙髓、成牙本质细胞在相对分子质量89000附近出现蛋白条带；免疫组化显示牙髓组织中的成牙本质细胞、血管内皮细胞TLR4免疫反应阳性。正常牙髓中牙髓成纤维细胞不表达TLR4。结论成牙本质细胞通过表达TLR4参与牙髓牙本质复合体的先天免疫反应，TLR4在牙髓抵御外来病原微生物入侵的宿主免疫防御中起重要作用。     

双向电泳分析重组人白细胞介素-1β对人牙髓细胞的影响

目的：观察rhIL-1β对培养的HDPCs产生蛋白质的影响,揭示rhIL-1β与牙髓炎的关系。方法：在HD-PCs的培养液中加入rhIL-1β,用2-DE分离HDPCs全蛋白,获得对照组和诱导组HDPCs蛋白质图谱,ImageMaster2DElit 5.0软件分析确认差异表达蛋白。结果：比较对照组和诱导组蛋白质图谱,发现了39个蛋白质点差异明显。其中15个蛋白质点在诱导组高表达,新增13个蛋白质点,7个蛋白质点低表达,4个蛋白质点仅在对照组中表达。结论：HDPCs对rhIL-1β的应答反应是一个非常复杂的过程,多种蛋白质分子涉及其中。     

Toll样受体4在大鼠炎症牙髓表达的免疫组化研究

目的研究内毒素(LPS)诱导大鼠牙髓炎模型中Toll样受体4(TLR4)的表达特点,以探讨TLR4在牙髓炎症中的可能作用,推测它在牙髓炎发生发展中的意义。方法通过对LPS诱导的大鼠磨牙牙髓炎组织切片,同时采用免疫组化方法检测大鼠牙髓炎中TLR4的表达情况。结果 1 d组:成牙本质细胞呈中度阳性表达,牙髓成纤维细胞为中度至强阳性表达;3⁷ d组:成牙本质细胞、牙髓成纤维细胞阳性表达减弱;2周组:坏死区扩大呈均质弱阳性表达,成牙本质细胞、牙髓成纤维细胞及内皮细胞减少,呈阳性,修复牙本质呈弱阳性表达;3周组:大部分坏死牙髓组织呈均质弱阳性表达。结论 TLR4在大鼠牙髓炎发生、发展呈动态表达,TLR4可能参与调节牙髓炎发生、发展及修复过程。