密度梯度离心与贴壁法相结合体外分离培养兔骨髓基质干细胞：1～3代细胞生长特性

目的:采用密度梯度离心与贴壁培养相结合的方式,对兔骨髓基质干细胞进行体外分离、培养和扩增。方法:实验于2006-11/2007-08在广西医科大学完成。①实验方法:取6周龄大白兔8只,麻醉后切开皮肤充分暴露下肢骨,无菌条件下穿刺股骨干骺端,抽吸骨髓液约12mL,以等体积磷酸盐缓冲液稀释,注入含有等体积人淋巴细胞分离液的离心管中,离心收集中间云雾状细胞层,磷酸盐缓冲液洗涤,去除多余的脂肪细胞及组织液,加入适量的含双抗的10%胎牛血清DMEM培养液吹打制成细胞悬液,离心后弃上清,以1×108L-1密度接种于培养瓶中,37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养。48h后首次换液,弃去未贴壁或已死去的细胞,隔日换液。至8～12d贴壁细胞融合为单层时胰蛋白酶消化传代。②实验评估:用倒置相差显微镜观察每天细胞的生长情况。取第1～5代处于对数生长期的细胞,计算贴壁率,同时绘制细胞生长曲线。结果:①兔骨髓基质干细胞生长情况及形态学特点:原代培养8h骨髓基质干细胞开始贴壁生长,其他杂质细胞悬浮于培养基中;3d后贴壁细胞逐渐变为梭形并且增大,少数细胞呈现多角形,高倍镜下可见细胞质丰富,细胞较大,呈椭圆形,轮廓清晰,核内可见核仁存在;1周后大部分细胞贴壁延伸,体积变大,数目增多,多呈长梭形或三角形;第12天细胞呈集落生长。第1～3代兔骨髓基质干细胞体外培养生长稳定,增殖迅速,细胞形态基本相同。第4代细胞体积始增大,胞内有颗粒样物质出现。第5代细胞体积更大,细胞呈椭圆形改变,部分细胞开始脱落死亡,增殖能力较前4代明显下降。②细胞贴壁率:接种后12h第1～3代细胞贴壁率为95%,第4代细胞贴壁率为88%,至第5代细胞贴壁能力差,贴壁率仅为72%。③细胞生长曲线:第1～3代细胞生长曲线基本相同,第4,5代细胞长势均明显下降。结论:采用密度梯度离心与贴壁培养相结合的方式能够成功分离培养兔骨髓基质干细胞,第1～3代细胞体外培养生长稳定,贴壁率高,活性良好。     

兔骨髓基质细胞体外培养的操作技术特征

目的:探讨原代细胞取材、分离方法及首次换液时间对体外培养兔骨髓基质细胞生长、增殖的影响。方法:实验于2004-01/06在山东中医药大学细胞学实验室完成。选择普通级4周龄雌性新西兰大白兔1只,抽取其两侧股骨大转子部骨髓液2mL,加入到盛有等体积Ficoll淋巴细胞分离液的离心管中分离单个核细胞,进行首次提纯获取骨髓基质单细胞,置培养箱中培养传代,逐日在倒置显微镜下观察细胞生长情况。培养5d后,轻轻振荡培养瓶,吸除培养液,以后每两三天换液1次。继续传代。观察、记录、绘制细胞生长曲线并测定细胞群体贴壁及融合单层时间,观察细胞形态变化和生长增殖情况。在操作方法中注重了以下3点:①原代细胞培养取材于4～8周龄的新西兰大白兔。②分离方法采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞进行初次提纯获取骨髓基质细胞,消化时间不宜超过5min。在分离、纯化操作减少离心次数和时间,减少吹打和抽吸的次数,以避免对细胞的机械性损伤。③首次换液时间:选择在原代细胞接种后5d行初次换液比较合适。结果:①兔骨髓基质细胞体外培养生长增殖及形态变化:原代培养细胞接种后见大量悬浮呈圆形的细胞,轮廓清晰。24～36h后开始贴壁,呈不规则形态或呈类圆形或椭圆形。48～72h时呈集落生长,显示为短梭形或星形。4d时每个细胞集落中心部位细胞轮廓不清,体积较小,周边细胞呈细梭形,向周围呈辐射状排列。6d时贴壁细胞呈长梭形外观,部分区域融合成片。13～16d细胞融合单层,呈典型细长梭形外观,成集束状排列。传代细胞形态一周左右融合成单层。②第1代细胞生长曲线:从传代后第1天细胞数量开始增加,第4天增加幅度最大,至第6天细胞数量最大。以后数量略有下降。说明其潜伏期<24h,传代培养对数增殖期为2～5d,对数增殖期结束后,第6天细胞生长缓慢,进入平台期。由此可以得出细胞群体倍增时间约为24h。③第1代细胞贴壁率:传代细胞接种2h已有部分细胞贴壁,12h细胞基本贴壁完全,14h已有部分细胞开始增殖。传代细胞接种存活率为98%。④兔骨髓基质细胞镜下形态观察:苏木精-伊红染色可见骨髓基质细胞呈梭形、多角形等,有的有多个树状突起。胞浆呈细网状,淡红色略带蓝色,并见较多胞浆颗粒。细胞核清晰、深蓝色,位于中央,中间可见深染的数个点状染色质,可见分裂相。结论:取材于4～8周龄的新西兰大白兔的骨髓基质细胞采用密度梯度离心法培养传代,以原代细胞接种后5d行初次换液,在此体外培养条件模式下,兔骨髓基质细胞早期生长性状稳定,增殖速度快,适应性强,呈典型的成纤维细胞样外观,可连续观察10代以上仍具有以上特征,未出现明显衰老现象,适合用作骨组织工程学的种子细胞。     

改良Dexter法与IMDM培养基培养骨髓基质细胞的比较

背景:体外分离培养骨髓基质细胞,并于骨髓移植后将其注入严重联合免疫缺陷鼠体内,对于促进造血及免疫重建尤为必要.目的:比较骨髓基质细胞在不同培养条件下的生长状况,寻找一种体外分离培养扩增骨髓基质细胞简单而实用的方法.设计、时间及地点:体外对比观察实验,于2006-07/2007-01在太原市中心医院皮肤科实验室完成.材料:人骨髓取自太原市中心医院血液科经筛选的正常骨髓(取材均经患者同意).方法:分离人骨髓单个核细胞,对照组采用改良Dexter法培养:将骨髓单个核细胞用5×10-7mol/L氢化可的松的RPMI1640培养基调整细胞浓度为1×109L-1,以每孔1 mL接种于24孔培养板,培养2 d后全量换液,去除非贴壁细胞,之后每3 d半量换液1次.细胞生长至半融合状态时传代,传两三代后用胰酶消化,收集细胞,液氮冷冻保存.实验组用IMDM培养基培养:用不含氢化町的松的IMDM培养基培养,其余成分及培养条件均与对照组相同.2 d后全量换液,去除非贴壁细胞,之后每4天半量换液1次.传代及收集方法同对照组.主要观察指标:通过倒置显微镜观察细胞贴壁情况、形态变化及增殖状态,MTT比色法检测细胞增殖活性.结果:倒置显微镜下,两组培养细胞在接种24 h后细胞大量贴壁并伸展开,随着培养时间延长,贴壁细胞数量增多,14 d左右细胞铺满板底达融合状态.传代细胞经消化后变形,24 h后恢复原来形态,并贴壁增殖,形态和原代细胞相似,4.0～5.0d后呈融合状态.两种方法培养的骨髓基质细胞增殖活性差异无显著性意义(P>0.05).结论:改良Dexter法及IMDM培养基培养均可使骨髓基质细胞在短期内贴壁及增殖.IMDM培养基由于不需加氢化可的松,故比改良Dexter法更易于操作.     

贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果验证

背景:骨髓中的间充质干细胞含量不高,且随着年龄增加或体质衰弱,骨髓间充质干细胞的数量会逐渐减少.目的:验证贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果.方法:大鼠麻醉后取双侧股骨和胫骨,剪去骨骺端,暴露骨髓腔,用含小牛血清的DMEM培养基冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞,反复吹打制成单细胞悬液,接种后置于37 ℃、体积分数为5%的CO_2培养箱内孵育,24 h后全量换液,以后每周全量换液1次,筛选易贴壁但贴壁不牢的细胞进行传代培养.观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪及免疫细胞化学染色鉴定骨髓间充质干细胞表面标志的表达.结果与结论:培养24 h后细胞能够贴壁生长,呈梭形或三角形;第二三天贴壁细胞迅速增殖;培养15 d左右出现致密的贴壁细胞层,呈漩涡状生长或成簇生长.细胞在接种后2 d进入对数生长期,12 d左右进入平台期,约15 d细胞可铺满瓶底.分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞CD90和CD54均呈阳性表达.结果验证了采用贴壁法可在体外成功分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,操作简单,造成污染的环节和机会较少,不需离心,可以更好的保持细胞活性.     

兔骨髓基质细胞在条件培养液中向成骨细胞转化的特征

目的：观察不同类型的培养液环境对骨髓基质细胞向成骨细胞转化的诱导作用。方法：实验于2004-04／08在哈尔滨医科大学附属一院实验中心完成。实验动物为日本大耳白兔。制备标准培养液和条件培养液，体外分离兔长骨骨髓基质细胞，标准培养液和条件培养液体外培养骨髓基质原代细胞，3d后半量换液，其后每两三天换液1次。当细胞融合80％，用25g／L胰蛋白酶消化，以1：2传代培养。应用倒置相差显微镜逐日观察体外培养的骨髓基质细胞的形态，采用常规24孔培养板计数法测定第3代细胞在标准培养液及条件培养液培养条件下的细胞生长曲线。以5&;#215;10^7L^-1细胞接种到96培养板中，培养24h后，更换标准培养液、条件培养液，继续培养至第5天及第10天，经处理，每孔加100μL碱性磷酸酶底物溶液，37℃孵育40min，每孔加1mol／L氢氧化钠50μL终止反应，在490nm波长测定各孔吸光度值，以U／L表示细胞碱性磷酸酶相对活性。将传代培养至第10天的标准培养液和条件培养液细胞分作2组，去除培养液，磷酸盐缓冲液pH7．3清洗，10g／L多聚甲醛固定1h，行常规VonKossa染色观察矿化结节形成。实验数据进行配对资料t检验。结果：①骨髓基质细胞在标准培养液中生长良好，细胞接种后1d少量细胞贴壁，呈圆形，2d可见贴壁细胞增多，3d有少量细胞呈纺锤形，6d后见细胞呈多种形态，且形成分散的集落，其间混有少量圆形透光度较好的细胞。1周后细胞集落迅速增多，且集落中的细胞明显增多，近12～14d集落融合成片，细胞排列有一定的方向性，呈旋涡状排列，表现为类成纤维样细胞集落生长。②条件培养液有较明显的增加骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性的作用，条件培养液组碱性磷酸酶活性在各时间点均显著高于标准培养液组（P〈0．05），条件培养组液随培养时间延长其碱性磷酸酶活性显著增高（P〈0．05），而标准培养液组碱性磷酸酶活性在各时间点无显著差异。③条件培养组VonKossa染色强阳性，细胞间连接处可见大量黑色沉积物，证实有大量矿化结节的存在。而在标准培养液组未见黑色沉积物，VonKossa染色阴性。结论：骨髓基质细胞在体外条件培养液中可明显增强其形成矿化组织的能力。     

兔骨髓基质细胞体外培养的操作技术特征

目的：探讨原代细胞取材、分离方法及首次换液时间对体外培养兔骨髓基质细胞生长、增殖的影响。方法：实验于2004-01／06在山东中医药大学细胞学实验室完成。选择普通级4周龄雌性新西兰大白兔1只，抽取其两侧股骨大转子部骨髓液2mL，加入到盛有等体积Ficoll淋巴细胞分离液的离心管中分离单个核细胞，进行首次提纯获取骨髓基质单细胞，置培养箱中培养传代，逐日在倒置显微镜下观察细胞生长情况。培养5d后，轻轻振荡培养瓶，吸除培养液，以后每两三天换液1次。继续传代。观察、记录、绘制细胞生长曲线并测定细胞群体贴壁及融合单层时间，观察细胞形态变化和生长增殖情况。在操作方法中注重了以下3点：①原代细胞培养取材于4～8周龄的新西兰大白兔。②分离方法采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞进行初次提纯获取骨髓基质细胞，消化时间不宜超过5min。在分离、纯化操作减少离心次数和时间，减少吹打和抽吸的次数，以避免对细胞的机械性损伤。③首次换液时间：选择在原代细胞接种后5d行初次换液比较合适。结果：①兔骨髓基质细胞体外培养生长增殖及形态变化：原代培养细胞接种后见大量悬浮呈圆形的细胞，轮廓清晰。24～36h后开始贴壁，呈不规则形态或呈类圆形或椭圆形。48～72h时呈集落生长，显示为短梭形或星形。4d时每个细胞集落中心部位细胞轮廓不清，体积较小，周边细胞呈细梭形，向周围呈辐射状排列。6d时贴壁细胞呈长梭形外观，部分区域融合成片。13～16d细胞融合单层，呈典型细长梭形外观，成集束状排列。传代细胞形态一周左右融合成单层。②第1代细胞生长曲线：从传代后第1天细胞数量开始增加，第4天增加幅度最大，至第6天细胞数量最大。以后数量略有下降。说明其潜伏期&;lt;24h，传代培养对数增殖期为2～5d，对数增殖期结束后，第6天细胞生长缓慢，进入平台期。由此可以得出细胞群体倍增时间约为24h。③第1代细胞贴壁率：传代细胞接种2h已有部分细胞贴壁，12h细胞基本贴壁完全，14h已有部分细胞开始增殖。传代细胞接种存活率为98％。④兔骨髓基质细胞镜下形态观察：苏木精一伊红染色可见骨髓基质细胞呈梭形、多角形等，有的有多个树状突起。胞浆呈细网状，淡红色略带蓝色。并见较多胞浆颗粒。细胞核清晰、深蓝色，位于中央，中间可见深染的数个点状染色质，可见分裂相。结论：取材于4～8周龄的新西兰大白兔的骨髓基质细胞采用密度梯度离心法培养传代，以原代细胞接种后5d行初次换液，在此体外培养条件模式下，兔骨髓基质细胞早期生长性状稳定，增殖速度快，适应性强，呈典型的成纤维细胞样外观，可连续观察10代以上仍具有以上特征，未出现明显衰老现象，适合用作骨组织工程学的种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养条件的优化组合

背景：骨髓间充质干细胞分离培养方法的不同可导致其活性与纯度各异，直接影响组织工程的修复效果。目的：对骨髓间充质干细胞体外分离培养条件进行优化组合，并验证其获取骨髓间充质干细胞的效果。设计、时间及地点：细胞学体外实验，于2007-10／12在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。材料：清洁级3月龄新西兰白兔2只，由山西畜牧研究所提供。方法：向含有新鲜骨髓的DMEM培养液中加入等量淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心和差速贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞，每间隔8h将未贴壁细胞转移入新的培养瓶，接种5d后首次换液，细胞融合率达90％时胰酶消化传代，第1、3、5代细胞用于实验。主要观察指标：镜下观察细胞形态及生长状态，绘制细胞生长曲线，测定倍增时间，流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44标记率。结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈圆形、梭形、多角形等，48h可见贴壁细胞有伸展现象，呈梭形，多角形，成纤维细胞样展开，细胞核清晰，首次换液后可见细胞透亮并充分展开，14d左右可达90％融合。第1、3、5代骨髓间充质干细胞整体呈S型，1～3d为潜伏期，3d后进入对数生长期，7～8d为平台期，平均倍增时间为24．22h。第2代骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达，标记率为93．0％。结论：采用密度梯度离心联合差速贴擘、离心介质选择淋巴细胞分离液、接种5d首次换液的体外分离培养纯化方法，获得的骨髓间充质干细胞生长状态良好，且纯度较高。     

体外分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞及其生物学特性鉴定

背景:现阶段急需建立一种稳定的体外分离培养内皮祖细胞的方法,骨髓中内皮祖细胞的含量丰富,增殖能力强,而且容易获得,操作简单.目的:拟在体外分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞,并对其生物学特性进行鉴定.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-08/12在重庆医科大学附属第一医院中心实验室完成.材料:清洁级2周龄SD大鼠20只,由重庆医科大学实验动物中心提供.方法:无菌条件下分离大鼠股骨和胫骨,用预冷至4℃的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔,以密度梯度离心法收集单个核细胞层,含体积分数为20%胎牛血清的M199培养液重悬细胞,制成单细胞悬液后进行细胞计数,按1×109L-1浓度接种到预先用纤维连接蛋白包被的培养瓶中,37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度恒温培养.主要观察指标:倒置显微镜观察细胞形态变化,免疫细胞化学检测内皮祖细胞表面特异性抗原CD133、内皮祖细胞表面抗原CD34和血管内皮生长因子受体KDR的表达,并进行流式细胞仪定量分析和细胞生长曲线分析.结果:新分离获得的骨髓单个核细胞为小圆形,培养4 d后贴壁细胞呈"集落"样生长,中间为圆形贴壁细胞,外周梭形细胞较多,传代后梭形细胞首尾相连,呈"毛细血管"样排列.培养第4,7,10,14天贴壁细胞CD34,KDR,CD133均呈阳性表达,CD133阳性细胞第10天时开始减少.流式细胞仪检测结果显示,CD133/KDR双阳性细胞率逐渐升高,10 d时达峰值,随后下降.KDR阳性细胞率随培养时间的延长而逐渐升高.原代细胞生长曲线显示细胞在第3～6天处于指数生长期,贴壁细胞大量增殖,呈"集落"样生长.结论:采用密度梯度离心法可成功从SD大鼠骨髓中分离获得内皮祖细胞,加入M199培养液后能够贴壁增殖,并可以分化为内皮细胞.     

兔骨髓基质细胞在条件培养液中向成骨细胞转化的特征

目的:观察不同类型的培养液环境对骨髓基质细胞向成骨细胞转化的诱导作用。方法:实验于2004-04/08在哈尔滨医科大学附属一院实验中心完成。实验动物为日本大耳白兔。制备标准培养液和条件培养液,体外分离兔长骨骨髓基质细胞,标准培养液和条件培养液体外培养骨髓基质原代细胞,3d后半量换液,其后每两三天换液1次。当细胞融合80%,用25g/L胰蛋白酶消化,以1∶2传代培养。应用倒置相差显微镜逐日观察体外培养的骨髓基质细胞的形态,采用常规24孔培养板计数法测定第3代细胞在标准培养液及条件培养液培养条件下的细胞生长曲线。以5×107L-1细胞接种到96培养板中,培养24h后,更换标准培养液、条件培养液,继续培养至第5天及第10天,经处理,每孔加100μL碱性磷酸酶底物溶液,37℃孵育40min,每孔加1mol/L氢氧化钠50μL终止反应,在490nm波长测定各孔吸光度值,以U/L表示细胞碱性磷酸酶相对活性。将传代培养至第10天的标准培养液和条件培养液细胞分作2组,去除培养液,磷酸盐缓冲液pH7.3清洗,10g/L多聚甲醛固定1h,行常规VonKossa染色观察矿化结节形成。实验数据进行配对资料t检验。结果:①骨髓基质细胞在标准培养液中生长良好,细胞接种后1d少量细胞贴壁,呈圆形,2d可见贴壁细胞增多,3d有少量细胞呈纺锤形,6d后见细胞呈多种形态,且形成分散的集落,其间混有少量圆形透光度较好的细胞。1周后细胞集落迅速增多,且集落中的细胞明显增多,近12～14d集落融合成片,细胞排列有一定的方向性,呈旋涡状排列,表现为类成纤维样细胞集落生长。②条件培养液有较明显的增加骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性的作用,条件培养液组碱性磷酸酶活性在各时间点均显著高于标准培养液组(P<0.05),条件培养组液随培养时间延长其碱性磷酸酶活性显著增高(P<0.05),而标准培养液组碱性磷酸酶活性在各时间点无显著差异。③条件培养组VonKossa染色强阳性,细胞间连接处可见大量黑色沉积物,证实有大量矿化结节的存在。而在标准培养液组未见黑色沉积物,VonKossa染色阴性。结论:骨髓基质细胞在体外条件培养液中可明显增强其形成矿化组织的能力     

人脐带内皮细胞与平滑肌细胞的分离培养特照

目的：如何便捷有效地获取种子细胞是构建组织工程皮肤、角膜、血管等成功与否的关键，实验对人胎儿脐带内皮细胞和平滑肌细胞的分离、纯化、培养扩增技术进行探讨。方法：实验于2006—11在暨南大学医学院完成。①实验材料：剖宫产正常胎儿脐带由暨南大学第一临床学院提供，产妇均知情同意。②实验方法：配制培养液，A液为在M199培养液中加入20％胎牛血清、20mg，L肝素、10μg／L碱性成纤维细胞生长因子，B液为在M199培养基中加入10％胎牛血清、250mg／L G418。取脐带15-20cm，采用胶原酶“灌注消化法”获取脐带内皮细胞制成悬液，静置0．5h后利用成纤维细胞短时间内贴壁的特点，把尚未贴壁细胞吸出重新接种于含有A液的培养瓶，初步去除部分成纤维细胞，细胞贴壁24h后将培养液换为B液，继续培养3d，去除成纤维细胞，然后再用A液扩大培养。从消化完脐静脉内皮细胞的脐带中剥取脐动脉，刮除内皮细胞，将血管条剪成小块均匀贴于培养瓶底，培养瓶内加入含20％小牛血清的DMEM培养液2mL，缓慢竖直培养瓶，以培养液刚未浸没培养块为最佳，放入37℃、体积分数为0．05的CO2培养箱内干涸8h后，将培养瓶轻轻翻转，使植块刚浸入培养液中，绝对静置3d，以后每3d换液1次，待植块周围生长晕的细胞融合成片时，即可传代，传代后DMEM培养液的血清浓度由原来的20％改为5％，且在培养液中加入0．2L肝素。⑧实验评估：通过倒置相差显微镜观察细胞生长情况，分别以第Ⅷ因子、α-肌动蛋白免疫组织化学染色法鉴定内皮细胞和平滑肌细胞。结果：①内皮细胞的生长观察：接种24h后，镜下可见刚贴壁的细胞呈圆形，逐渐转变为多角形或梭形，胞间可见有成纤维细胞混杂，加入B液3d后成纤维细胞逐渐死亡。传代细胞呈“铺路石”样，细胞周围特别是近胞核处可见明显光晕，为典型的内皮细胞生长特点。②内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原的检测：胞浆丰富且有棕黄色颗粒，细胞核不着色，呈阳性反应。⑧平滑肌细胞的生长观察：镜下组织块贴壁后5～7d可见有少数细胞从植块边缘游出，第10-15天植块周围形成明显的细胞生长晕．细胞呈长梭形、带状或三角状，有1-4个细胞核，可见半透明颗粒，第20-25天细胞密集、平行排列，形成“峰谷样”结构，是平滑肌细胞的特征性生长表现。④平滑肌细胞特异性α-肌动蛋白单克隆抗体检测：胞浆内可见棕黄色细丝，为特异性α-平滑肌肌动蛋白，细胞核不着色。结论：以胎儿脐带作为种子细胞的来源，成功分离后通过调节培养液的成分，既能排除成纤维细胞的污染又可以令内皮细胞和平滑肌细胞快速增殖。     

人多发性骨髓瘤细胞系SKO-007 IL-6表达的研究

人多发性骨髓瘤(MM)细胞系SKO-007是新近建株于MM患者的骨髓瘤细胞,它是否自泌白细胞介素6(IL-6)尚未见报道。材料和方法1 细胞培养与样品收集将SKQ-007细胞(ATCC购置)悬浮于含10％灭活小牛血清(FCS)的RPMI 1640培养体系中,37℃、5％ CO_2条件下培养2～3天换液传代1次。试验前,收集细胞用无血清的RPMI 1640培养液洗涤两次,并饥饿4小时。再同法洗涤两次,收集末次洗涤液和1.5×10~7细胞作为培养0小时之样品。     

体外培养骨髓基质细胞增殖和分化的相互关系

目的:建立一种简单可靠的骨髓基质细胞向成骨细胞转化的体外培养方法,探讨骨髓基质干细胞增殖和分化的相互关系。方法:实验于2003-02/12在新疆医科大学第1附属医院包虫病临床研究所细胞室完成。将兔骨髓基质细胞悬液进行体外培养,传代培养后分组:①普通培养基组传代后仍使用普通培养基培养,每3天换液1次。②条件培养基组,分5种情况,在普通培养基中培养至第3,10,20代后即分别使用条件培养基(Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基中加入地塞米松10-7mmol/L,β-甘油磷酸钠10mmol/L,维生素C50mg/L)持续培养30d,每3天换液1次;传代后使用条件培养基持续培养30d,每3天换液1次;传代后使用条件培养基持续培养30d,每4天传代1次。形态学观察采用倒置显微镜;碱性磷酸酶染色采用偶氮偶联法;观察钙结节形成采用Vonkossa’s染色。结果:①各组细胞形态学观察结果:普通培养基组在形态上与条件培养基组细胞无明显差别。②各组细胞钙结节和碱性磷酸酶染色结果:普通培养基培养至第3,10,20代后用条件培养基及传代后用条件培养基(每3天换液)组细胞碱性磷酸酶阳性率达80%以上,表现为成骨细胞形态并形成钙结节,Vonkossa’s染色阳性;普通培养基组及传代后用条件培养基(每4天换液)组细胞的碱性磷酸酶染色为阴性,未能形成钙结节,Vonkossa’s染色阴性。结论:①贴壁筛选法是一种简单可靠的分离骨髓基质细胞的方法。②骨髓基质细胞的分化和增殖是两个对立的状态。     

β-巯基乙醇在大鼠骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化中的作用

目的:探讨骨髓基质细胞诱导分化为神经干细胞的更佳培养液组成。方法:实验于2005-10/2006-08在省级实验室北华大学医学院实验中心完成。①实验材料:体质量120～160g的Wistar大鼠,由北华大学动物中心提供。②实验方法:取120～160g大鼠3只,体外分离培养大鼠骨髓基质细胞。培养约14d,待原代细胞贴满培养瓶,呈成纤维细胞样生长,用0.25%胰蛋白酶消化原代细胞约3min,在倒置显微镜下见贴壁细胞基本收缩成类圆形后,加入含胎牛血清的DMEM培养液终止消化,并将细胞液吹打均匀,以1×107L-1接种于2个细胞培养瓶中进行1∶2传代扩增培养。在传代培养细胞培养液中加入神经细胞诱导剂,选取生长良好的2,3,4代细胞进行实验。取第5代培养细胞,以8×103/cm2接种于预铺有盖玻片3.5cm培养皿中制备细胞爬片,每孔加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液2mL,达80%融合时更换新鲜培养液,并在培养液中加入1mmol/Lβ-巯基乙醇,诱导24h,磷酸盐缓冲液洗涤,换成含1mmol/Lβ-巯基乙醇的无血清培养液,5h后更换为改良神经细胞培养液,并设立未加入含β-巯基乙醇培养液的为对照。利用免疫组织化学方法检测神经元特有巢蛋白。结果:①培养的骨髓基质细胞形态学变化:接种初期,细胞贴壁生长是以分散的、克隆集落方式增殖,细胞呈圆形漂浮于培养液中,培养10d后,细胞形态基本为纺锤形的成纤维细胞样,偶有宽大扁平的多边形细胞,细胞逐渐长出小突起,出现出芽现象,14～20d后,突起细胞增多,突起延长并相互连接成网,具有神经细胞形态特征。②免疫组织化学染色检测神经元特有巢蛋白:1周左右,细胞可表达巢蛋白阳性,细胞大而圆,呈棕褐色,经培养诱导分化2周后的长突起细胞,表达神经元特异性抗原巢蛋白阳性细胞互相成网状连接。实验组第4代90%细胞巢蛋白阳性,在荧光显微镜下细胞发黄绿荧光,对照组第1代细胞约30%细胞呈巢蛋白阳性,荧光弱。结论:在诱导培养液中加入β-巯基乙醇,可明显促进骨髓基质细胞的分化,并可获得神经干细胞。     

犬骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

背景:骨髓基质干细胞的多向分化性不利于向软骨细胞单一方向分化,植入体内后成骨系细胞分泌的骨形态发生蛋白作用于非定向分化的前体细胞,使其向成骨细胞分化,而已定向分化的细胞则不受骨形态发生蛋白的影响,形成相应的组织.目的:体外诱导犬骨髓基质干细胞定向分化为软骨细胞,探讨体外诱导成软骨的方法和条件.设计、时间及地点:单一样本观察,于2005-03/2006-01在中山大学组织工程实验室完成.材料:选取4个月龄雄性家犬1只,骨髓基质干细胞取自犬肋骨.方法:自犬肋骨取骨髓2.0～3.0mL行体外原代骨髓基质干细胞分离培养.8～11d细胞接近融合时,加入胰酶消化,用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM合成培养液终止消化,收集细胞悬液,离心后,用培养液悬浮细胞,按1:3接种传代.取第3代细胞培养扩增,换液时加入10μg/L碱性成纤维细胞生长因子2mL,换液2次后,再加入1mg/L转化生长因β1 2mL诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化.主要观察指标:行甲苯胺蓝、阿新蓝染色检测软骨基质的分泌,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.结果:骨髓基质干细胞体外行原代和传代培养至P4代生长良好,经碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因β1扩增诱导的细胞甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性,显示被诱导的骨髓基质干细胞具备软骨细胞特性.结论:应用碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因β1体外可以诱导犬骨髓基质干细胞分化为软骨细胞,诱导的软骨细胞可作为软骨组织工程较理想的种子细胞.     

首次换液时间对贴壁法培养骨髓间充质干细胞纯度及增殖的影响

目的:观察不同时间首次换液对贴壁法培养骨髓间充质干细胞形态和表面标志物表达的影响。方法:实验于2005-09/2006-12在湖南中医药大学内科实验室完成。实验材料:三四周龄昆明种小鼠由湖南中医药大学实验动物室提供(许可证号:医动字第20-002号)。实验方法:无菌条件下分离小鼠股骨,以低糖DMEM培养液冲出骨髓,1000r/min离心10min,去除脂肪和上清液,DMEM重悬,洗涤细胞,同样条件下离心,弃上清液,将获得的骨髓间充质干细胞用含体积分数为0.15胎牛血清、105U/L青霉素G、100mg/L链霉素的低糖DMEM完全培养基重悬沉淀,以1×108L-1接种于24孔板,置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养。第1组于24h全量换液,第2组于3d全量换液,第3组于5d全量换液。比较骨髓间充质干细胞在原代培养24h、3d、5d首次换液后细胞形态、生长曲线和表面标志物表达。结果:①骨髓间充质干细胞形态:原代培养24h换液,可见少量贴壁细胞,形态不规则。原代培养3d首次换液,可见较多贴壁细胞,并形成细胞团,细胞为椭圆形、短梭形。原代培养5d换液,可见明显集落形成,贴壁细胞量多,细胞呈梭形。②骨髓间充质干细胞生长曲线:原代培养24h首次换液,骨髓间充质干细胞生长较缓慢,对数生长期晚;原代培养3d首次换液,骨髓间充质干细胞增殖速度快,对数生长期早;原代培养5d首次换液,骨髓间充质干细胞前6d生长速度较快,6d后生长渐缓慢。③骨髓间充质干细胞表面抗原:三组间比较CD44、CD45阳性表达率差异均具有显著性意义[24h首次换液:(88.13±1.60)%,(26.25±2.60)%;3d首次换液:(85.21±1.80)%,(29.37±1.30)%;5d首次换液:(79.85±1.50)%,(36.54±1.20)%,P<0.01]。结论:不同时间首次换液对贴壁法骨髓间充质干细胞的生长有影响,单从细胞纯度来考虑,24h首次换液较为理想,从细胞生长情况和纯度综合考虑,3d首次换液较为理想。     

脐血内皮祖细胞的分离和培养

目的:研究从脐带血中分离内皮祖细胞的分离、培养及向内皮细胞方向诱导分化方法和条件。方法:从新鲜脐血中用密度梯度离心方法分离出单核细胞,在添加VEGF的M199培养液中培养,每隔3-4 d换一次液。培养16 d后,消化贴壁细胞,用DiI-ac-LDL及FITC-UEA-1对其进行免疫荧光及流式细胞仪分析。结果:培养3-4 d单核细胞开始贴壁,14 d左右开始出现索条状结构,免疫荧光鉴定显示贴壁细胞呈双荧光染色阳性,流式细胞仪分析显示70%贴壁细胞表达FITC-UEA-1, 85%贴壁细胞表达DiI-ac-LDL。结论:脐血中富含内皮祖细胞,在一定的培养条件下,可分化为内皮样细胞。     

大鼠胰腺间质细胞体外培养过程及其形态学特征

目的:对胰腺间质细胞进行原代及传代培养,观察其形态学的变化。以探索一种简单稳定的获取及培养胰腺间质细胞的方法。方法:用机械剪切加胰蛋白酶消化的方法制备SD大鼠胰腺单细胞悬液,取新生SD大鼠1只麻醉断髓处死,体积分数0.75的乙醇浸泡消毒,无菌条件下取出胰腺组织,去除红细胞,剪切,加入胰蛋白酶消化,消化终止后细胞筛过滤,收集滤过的细胞悬液离心,弃上清液,重复1次。收集获得的单个胰腺间质细胞。接种于含体积分数0.1的胎牛血清、0.05g/L的亚胺培南的DMEM/F-12(1∶1)培养基,培养48h后换液,弃上清及悬浮细胞,继续培养48h后,换用含1×10-5mol/L阿糖胞苷的完全培养基培养24h,再换正常培养基继续培养,在培养细胞达到80%～90%的细胞汇合时,按1∶3进行传代培养。测定细胞生长曲线及贴壁率,原代细胞及传代细胞用双硫腙染色,鉴定有无胰腺β细胞。结果:①原代细胞及传代细胞形态学观察:原代培养换液前,显微镜下可见细胞大小不等,悬浮,有较多细胞碎片。48h首次全量换液后,悬浮细胞减少,经3次换液可基本去除。加用阿糖胞苷培养24h,大量细胞相继死亡。至第10-14天,培养细胞明显增加,基本铺满瓶底,以星形、梭形为主,细胞呈放射状或漩涡状生长,部分区域呈灶状。传至第5代细胞出现老化。②细胞生长曲线:细胞从传代后第2天,数量即开始增加,第4天增加幅度最大,至第6天细胞数量最大,以后数量略有下降。传代培养对数增殖期为2-4d,对数增殖期结束后,第6天细胞生长缓慢,进入平台期。③细胞的贴壁率:传代细胞培养2h已有部分细胞贴壁;培养4h贴壁细胞接近50%;培养10h贴壁达79%;培养12h细胞全部贴壁,而且部分细胞开始分裂增殖,细胞形态与原代细胞基本相似。④胰腺β细胞的化学鉴定:对胰腺组织分离所得单个细胞、原代培养细胞及传代培养细胞分别用双硫腙染色。培养前细胞染色,可见少量腥红色细胞,随着培养时间延长腥红色细胞逐渐减少,在原代培养10～14d,腥红色细胞消失,传代培养细胞染色未见腥红色细胞。结论:细胞培养12h全部贴壁,传代培养对数增殖期为2-4d,第6天细胞进入平台期。原代培养胰腺间质细胞形态多样,主要呈梭形,少数呈三角形或星形,贴壁爬行生长,第1周增殖较慢,随后增殖加速,细胞团块多见,偶可见大的圆形细胞生长,核大,胞浆内颗粒多。传代培养,细胞能迅速贴壁生长,细胞形态逐渐均一,主要为梭形、三角形细胞,呈集落样生长,双硫腙染色阴性;但细胞培养至第5代,胞浆颗粒增多,细胞增殖减慢,大部分细胞逐渐老化死亡。     

用持续感染1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的HeLaT4~+细胞进行间接免疫荧光血清学试验的优点

作者研究了用持续感染1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的HeLaT4~+细胞在间接免疫荧光抗体测定(IFA)中的适应性,以探索用其作为HIV 血清学中IFA 证实试验病毒抗原的替代来源。HIV-1持续感染培养物的方法是,将未感染HeLaT4~+细胞悬液与/mlHIV-1感染H9细胞液(传代后72小时)混合并接种于25cm~2烧瓶。72小时后,除去培养液并用生长培养液洗涤细胞层除去H9细胞碎片。这时,细胞表现有合胞体形成的广泛细胞病变作用。向细胞添加新鲜生长培养液并再孵育。每4天换一次生长培养液共14天,使细胞建立起融     

自体树突状细胞活化的骨髓细胞对慢性粒细胞白血病骨髓的净化

为考察慢性粒细胞白血病(CML)患者自体树突状细胞(DCs)活化骨髓细胞、净化骨髓的作用,采用免疫磁珠从2例血液学缓解的CML骨髓单个核细胞(BMMNCs)分离DCs,另取BMMNCs置T-25塑料培养瓶建立Dexter培养体系,分为3份,第1份为对照,第2份加rhIL-2,第3份加自体DCs.每周取半量非贴壁细胞、计数、行CFU-GM检测,然后加等量新鲜培养基继续培养.当非贴壁细胞总数＜2×105时终止培养,收集贴壁细胞做CFU-GM集落形成试验并检测CD34和P210表达.取贴壁细胞形成的CFU-GM集落,抽提RNA,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测BCR/ABL的表达.结果发现,在DCs加入CML骨髓Dexter培养体系培养后1-2周,非贴壁细胞的CFU-GM产量明显下降,与rhIL-2的体系基本平行,同时体系中的P210阳性细胞显著减少.不过,培养3周后含DCs的体系CFU-GM产量下降减缓,而含rh-IL-2的体系CFU-GM产量持续下降.在含自体DCs的Dexter体系,贴壁细胞中CD34+细胞和P210+细胞比例最低,只是贴壁细胞产生的CFU-GM集落中,BCR/ABL(+)的集落比例与不合DCs的体系比较无明显差别.这些结果说明自体DCs加入CML骨髓Dexter培养体系能减少白血病的祖细胞,包括成熟的祖细胞和原始的祖细胞,自体DCs有可能用于CML骨髓的体外净化.     

脐血树突状细胞的体外培养及免疫学特征

目的　探讨脐血树突状细胞 (DC)的体外诱导及其免疫学特征。方法　无菌条件下常规采集脐血 ,采用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞 ,去除悬浮细胞后获得单核细胞。将获得的单核细胞分为两组 ,组 1:在含白介素 4(IL 4 )和粒细胞巨细胞集落刺激因子 (GM CSF)的DMEM液中培养。组 2 :在上述培养液中孵育 5天后 ,加入肿瘤坏死因子 (TNF α)。收集培养 7天的贴壁细胞 ,分别用流式细胞仪检测CD83、CD86 、CD54、CD1α和CD1 4等免疫因子。结果　①组 1培养 12～ 14天树突状细胞数含量约 2 0 %。组 2培养 7～ 10天即可见到明显树突状细胞达 30 %。②TNF α可明显增加干细胞早期增殖能力 ,两组相比P <0 0 5。③IL 4、GM CSF和TNF α可诱导脐血来源的单核细胞 (即DC前体细胞 )分化为成熟的DC ,两组均高表达DC特异性抗原CD83、CD86 、CD54、CD1α。结论　脐血中的DC前体细胞可在体外诱导成为功能性 (即成熟 )DC。GM CSF联合TNF α不仅可以促进细胞形态的生长 ,而且明显增加DC生成数量。故脐血有可能成为DC免疫治疗丰富的来源。