当归ISSR-PCR反应体系的建立优化及引物筛选

目的建立并优化当归的ISSR-PCR反应体系,并进行引物筛选。方法以当归基因组DNA为模板,通过单因素实验研究了ISSR反应体系中主要成分(Taq DNA聚合酶、d NTP、模板、引物)以及热循环参数(退火温度、退火时间、变性时间、延伸时间、循环数)对扩增结果的影响。结果找出了各自的最适条件,建立了适合当归ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在20μl反应体系中,内含10×Taq Buffer(含1.5 mmol·L-1Mg Cl2)、1.25U Taq DNA聚合酶、250μmol·L-1d NTP、40 ng模板、0.25μmol·L-1引物。扩增程序为94℃预变性5 min,然后进行35个循环:94℃变性30 s,(根据引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸150 s,循环结束后72℃延伸7 min,-4℃保存。结论以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出17条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。该研究为当归药材DNA鉴定、种质资源研究以及优良品种选育奠定了基础。     

华细辛AFLP反应体系的建立和优化

目的 建立优化的华细辛Asarum sieboldii AFLP反应体系,为华细辛遗传多样性的研究提供技术支持.方法 以华细辛叶片为材料,对基因组DNA提取、酶切连接、PCR扩增等操作过程中各关键因素进行分析,筛选最适条件,建立完善的AFLP反应体系.结果 建立了优化的华细辛AFLP分析体系:在基因组DNA提取时,提取液中添加巯基乙醇、样品温浴时间为30 min;Trul Ⅰ和PstⅠ的酶切时间分别为3 h;在扩增反应中,Mg2+终浓度为1.5 mmol/L、Taq DNA聚合酶用量为0.2 μL.结论 本反应体系可获得良好的AFLP分析结果,可用于华细辛遗传多样性研究.     

麻花秦艽ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的:建立麻花秦艽的简单重复序列区间-聚合酶链反应(ISSR-PCR)最佳反应体系,为该药材的种质鉴定及遗传多样性等研究提供参考。方法:运用单因素试验和正交试验优选麻花秦艽的ISSR-PCR反应体系中DNA模板用量,Mg2+浓度,dNTPs浓度,TaqDNA聚合酶用量和引物浓度等参数,确定麻花秦艽每条引物的最佳退火温度。结果:ISSR-PCR最佳反应体系(20μL)为模板DNA1μL(36mg·L-1),10×PCR缓冲液(含Mg2+)1.75μL(20mmol·L-1),dNTPs0.8μL(10mmol·L-1),Taq酶0.1μL(0.5%)及引物0.6μL(10mmol·L-1);筛选出12条多态性高、扩增稳定的ISSR引物,UBC-809引物的最佳退火温度55.5℃。扩增出的7条带中多态性带为6条,多态性位点比率85.71%。结论:建立的麻花秦艽ISSR-PCR反应体系稳定可靠,位于500bp处的条带为非多态性条带,可作为该种属的特征性条带。     

三叶木通MSAP反应体系的优化及引物筛选

目的研究三叶木通表观遗传多样性,建立并优化三叶木通甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplifiedpolymorphism,MSAP)反应体系。方法以三叶木通叶片为材料,利用正交试验建立三叶木通MSAP的预扩增和选择性扩增的最佳反应体系。结果建立的MSAP最佳反应体系为酶切反应:HpaII/MspI 10 U,EcoR I 10 U;预扩增反应:总体积20μL,连接产物2μL,E00、HM00各125 ng,dNTPs 0.312 5 mmol/L,Mg2+1.875 mmol/L,Taq DNA聚合酶2 U;选择性扩增反应:总体积20μL,稀释200倍的预扩增产物5μL,引物E-ACT、HM-CAT各50 ng,dNTPs 0.250 mmol/L,Mg2+1.250mmol/L,Taq DNA酶1 U。利用优化的体系,最终从MSAP的80对引物中筛选出有效引物6对。结论建立的MSAP反应体系可用于后续三叶木通DNA甲基化的相关研究。     

薏苡SRAP反应体系的优化

目的 建立稳定可靠的SRAP分子标记反应体系,为进一步研究薏苡种质资源的分子鉴定提供依据。方法 采用改进的SDS法提取薏苡种子胚基因组DNA,并采用单因素试验分析Mg²⁺浓度、dNTP浓度、BSA浓度、模板DNA用量、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量等6个因素对薏苡相关序列扩增多态性(SRAP)扩增结果的影响。结果 建立了薏苡最适的SRAP反应体系：10 μL PCR反应体系中,含1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris·HCl,pH9.0,50 mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),1.5 mmol/L Mg²⁺,0.15 mmol/L dNTP,10 ng模板DNA,10 pmol引物,0.5 U Taq酶。结论 所建立的薏苡SRAP反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定等特点,为薏苡种质资源的分子鉴定提供了良好的基础。     

温郁金SRAP-PCR反应体系建立及条件优化

目的研究温郁金Curcuma wenyujin的SRAP-PCR扩增体系最适宜的条件。方法以提取纯化温郁金基因组DNA为模板,利用PCR扩增技术,对SRAP反应中主要影响因素Mg2+浓度、d NTP浓度、模板DNA质量浓度、引物浓度、Taq聚合酶浓度进行优化。结果根据实验确定的最佳体系为25μL SRAP反应体系,其中Mg2+2.0 mmol/L,Taq聚合酶2.0 U,引物浓度1.6μmol/L,模板DNA 0.4 ng/μL,d NTP 2.0 mmol/L,10×PCR缓冲液2.5μL。结论通过扩增条件优化实验,扩增的产物条带清晰明亮、重复性好,确定的反应体系及反应程序适用于温郁金的SRAP分子标记,为今后温郁金的遗传多样性研究奠定了基础。     

高产绿原酸杜仲细胞悬浮培养体系优化研究

目的优化杜仲细胞悬浮培养及其产绿原酸的条件。方法研究基本培养基种类、激素质量浓度、碳源种类及质量浓度、pH值、接种量和摇床转速等因素对杜仲细胞生长和绿原酸产量的影响,建立了高产绿原酸的悬浮细胞培养体系。结果B5培养基+0.5 mg/L NAA+0.6 mg/L 6-BA、蔗糖30 g/L、初始pH 5.0~5.5、接种量20g.FW/L以及摇床转速110 r/min为杜仲细胞悬浮培养的适合条件。结论优化后的培养条件为杜仲细胞大规模悬浮培养生产天然活性成分奠定了基础。     

枸杞RAPD反应体系的建立与优化

目的探索枸杞RAPD反应体系并对其进行优化。方法在本实验室常用的RAPD反应体系的基础上,根据RAPD扩增效果确定枸杞基因组DNA的最佳RAPD反应体系。结果建立了适合枸杞的RAPD反应体系:20μl体系中含1×PCR buffer,50 ng模板,0.4μM 10碱基随机引物、1UTaqDNA聚合酶、2 mM Mg2 ,125μMdNTPs。结论枸杞的RAPD反应体系能够用于枸杞的RAPD分析。     

仙茅属植物SRAP-PCR反应体系的优化

分子植物育种2007,5(F11):191-195通过单因子和双因子实验对仙茅属植物SRAP-PCR反应体系中主要成分(Mg2+,dNTP、引物、模板和TaqDNA聚合酶)进行优化,并比较     

基于方差分析优化菊花ISSR-PCR反应体系

目的 对影响药用菊花ISSR-PCR扩增效果的一些因素进行优化,为进一步研究其遗传多样性奠定基础.方法 基于方差分析方法,利用正交试验从Taq酶、Mg~(2+)、dNTP和引物等4因素3水平对药用菊花反应体系进行优化.结果 药用菊花ISSR-PCR的最佳反应体系:在20μL的反应体系中,Taq酶1.00 U,Mg~(2+)2.00 mmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,引物0.50μmol/L.结论 Taq酶、Mg~(2+)、dNTP等对ISSR反应结果有极显著影响.所建立的药用菊花ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可用于药用菊花的遗传多样性研究.     

杜仲及盐杜仲饮片的均匀化分析

目的:通过筛选粉碎工艺得到均匀性最佳的杜仲及盐杜仲粉末,以期将其分别作为杜仲、盐杜仲饮片质量评价的标准对照品。方法:依据不同粉碎方式下杜仲、盐杜仲饮片粉末的显微观察和粒径分布,并参考已上市的杜仲对照药材粉末粒径分布,确定超微粉碎为杜仲、盐杜仲饮片的粉碎方式;近红外技术结合色彩色差计、有效成分的HPLC含量测定对杜仲、盐杜仲饮片的光谱差异、外观颜色、内在有效成分含量3个方面进行考察,以比较饮片的均匀性。结果:超微粉碎30 min所得杜仲、盐杜仲饮片粉末较细,流动性较好,其光谱整体偏差分别为0.002和0.001,总色值的RSD分别为0.5%和0.4%,松脂醇二葡萄糖苷含量的RSD均为2.3%。结论:超微粉碎30 min为杜仲、盐杜仲饮片的最佳粉碎工艺,为杜仲、盐杜仲饮片的均匀化技术规范制定提供参考依据。     

杜仲饮片HPCE指纹图谱的研究

目的:建立杜仲饮片HPCE指纹图谱分析方法,并对杜仲及其炮制品的指纹图谱进行比较。方法:采用高效毛细管电泳法进行色谱分离,以60 mmol/L硼砂-20 mmol/L磷酸二氢钠-10%甲醇(pH=10.0)为运行缓冲液,分离电压为20 kV,波长为210 nm,以松脂醇二葡萄糖苷为参照物,测定其指纹图谱,并作模糊聚类法分析和相似度评价。结果:初步建立了以10个共有峰为特征指纹信息的杜仲饮片HPCE指纹图谱;发现少数杜仲饮片的指纹图谱有一定差异,生品与其炮制品的指纹谱中共有峰相对峰面积差异显著。结论:该方法准确可靠,重现性好,可作为杜仲饮片内在质量评价的依据。     

杜仲民间代用品的原植物研究

据研究结果,用检索表的形式区别鉴定了杜仲民间代用品的原植物10科17属48种及与正品杜仲的区别。     

杜仲不同炮制品增强免疫作用比较

比较了杜仲及其不同炮制品增强免疫的作用,结果表明:杜仲炮制后作用明显增强,不同炮制品之间作用强度无明显差异。     

杜仲不同炮制品化学成分研究

根据2010年版《中国药典》制备生杜仲、盐杜仲、杜仲炭3个规格炮制品,按照2010年版《中国药典》标准对各炮制品进行各项指标检测,均符合药典要求。运用HPLC-DAD对生杜仲、盐杜仲、杜仲炭及杜仲叶中化学成分进行比较分析,结果显示:1杜仲皮主要含有木脂素类化合物松脂醇二葡萄糖及环烯醚萜类化合物京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸,而杜仲叶主要含有黄酮类化合物槲皮素和酚酸类化合物绿原酸;2杜仲皮中松脂醇二葡萄糖含量约是杜仲叶中含量的18倍,盐炙和炒炭后松脂醇二葡萄糖质量分数约分别下降30%,85%;3杜仲皮中京尼平、京尼平苷和京尼平甘酸含量约为杜仲叶中京尼平、京尼平苷和京尼平甘酸含量的3,23,28倍,盐炙后京尼平、京尼平苷和京尼平甘酸质量分数分别降低25%,40%,40%,炒炭后京尼平、京尼平苷和京尼平甘酸质量分数分别降低98%,70%,70%;4杜仲皮中咖啡酸含量约是杜仲叶中咖啡酸含量的3倍,盐炙后咖啡酸质量分数约下降50%,炒炭后咖啡酸质量分数下降约75%;杜仲皮中绿原酸含量约为杜仲叶中绿原酸含量的1/6,盐炙和炒炭后绿原酸质量分数分别下降40%,75%;杜仲皮中槲皮素含量仅为杜仲叶中1/40,盐炙和炒炭后槲皮素质量分数分别降低60%,50%。     

盐制对杜仲化学成分含量变化的影响

目的:研究盐制对杜仲化学成分的影响.方法:采用硅胶柱色谱及制备HPLC色谱对杜仲炮制前后含量增加的化学成分进行了提取分离,并通过波谱技术对其结构进行鉴定.又利用TLC和HPLC色谱法分析盐制对杜仲化学成分的影响.结果:以薄层色谱为指导,分离鉴定了杜仲盐制后含量增加的5个化学成分,分别为阿魏醛、松脂素、表松脂素、中脂素和(-)-medioresinol.结论:杜仲盐制后,环烯醚萜和木脂素糖苷类成分含量降低,有些木脂素苷元含量增加.     

杜仲指纹图谱中化学成分的归属研究

目的:对杜仲指纹图谱进行成分归属研究,为科学评价和有效控制其质量提供依据。方法:在相同的色谱条件下,以保留时间相近为原则,用对照品比对确认杜仲指纹图谱中的化学成分;采用HPLC-TOF/MS技术,通过负离子模式检测获得化合物精确分子量,结合化学成分数据库信息推测指纹图谱中的化学成分。结果:通过对照品比对确认了10个成分,利用HPLC-TOF/MS推测了14个成分。结论:该研究比较全面地阐明了杜仲的化学组成,使指纹图谱的特征性更强,为杜仲的鉴别与质量评定奠定了基础。     

正交试验探讨杜仲的炒制方法

目的：探讨杜仲的最佳炮制方法。方法：采用正交表设计试验,对杜仲不同规格饮片及不同的炮制方法进行试验比较。选择炒制法、温度、时间、饮片规格4个因素,每个因素各选择3个水平,以水溶性浸出物含量为质量指标进行实验比较。结果：杜仲饮片炒制时,ABCD对其质量的影响均具有显著性差异,以A因素影响最大,B因素影响较小,其炮制工艺的选择以A2B1C1D1的条件为宜。结论：杜仲的最佳炮制工艺为将其切制成3-4mm的宽丝,将砂温控制在130－140℃,采用埋烫法,炒制3－5min,取出凉之炒制工艺为佳。     

杜仲药材HPLC指纹图谱及其共有模式的建立

目的用高效液相色谱法建立杜仲药材的指纹图谱分析方法。方法采用Lichrospher C18(250mm×4.6mm,5μm)分析柱,甲醇-0.1%磷酸水为流动相,梯度洗脱,体积流量为1.0mL/min,检测波长为230nm,柱温30℃。结果共有11个共有峰,采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》,计算各被测样品的HPLC指纹图谱的整体相似度,10批被测样品的色谱指纹图谱的整体相似度在0.574~0.958,并得出了杜仲药材的对照指纹图谱。结论该指纹图谱方法简便、重现性好,可专属性地研究杜仲药材的指纹图谱,为有效地控制杜仲药材的内在质量提供了科学依据。     

杜仲药材有效成分与环境因子的灰色关联度分析

目的: 运用灰色关联度法分析影响杜仲皮和叶中4种有效成分含量产地差异性的主要环境因子. 方法: 利用HPLC同时测定10个产地10年生杜仲皮和叶中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷的含量,流动相分别为乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)梯度洗脱(0~25 min,5%~13%A;25~45 min,13%~15%A;45~80 min,15%~21%A),流动相乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)梯度洗脱(0~20 min,5%~12%A;20~35 min,12%~13%A;35~45 min,13%~19%A;45~65 min,19%~25%A),检测波长均为210 nm.检测杜仲生长地土壤的全氮、全磷、全钾、碱解氮、速效磷、速效钾、有机质及pH,获得土壤因子数据,运用灰色关联度法对4种有效成分与气候及土壤因子的相关性进行分析. 结果: 10个产地同一生长年限杜仲皮、叶中4种有效成分的含量存在较大差异.碱解氮、速效钾、有机质、年平均相对湿度、年平均最高气温对4种成分在杜仲不同组织中的影响较大. 结论: 杜仲不同组织部位中4种有效成分含量与环境因子的灰色关联度分析明确了主导环境因子,为合理施肥及环境调控来提高杜仲次生代谢产物的含量提供参考,为杜仲的适宜种植区选择及其道地性产生原因分析提供实验依据.