基因芯片技术对赖型钩端螺旋体溶血素基因体内诱导差异表达的研究

目的探讨经宿主体内环境诱导前后赖型钩端螺旋体溶血素致病基因表达的差异。方法以赖型钩端螺旋体56601株的染色体DNA为模板,PCR扩增出溶血素基因片段为探针,并通过VersArray Chipwriter系统构建基因芯片。提取感染宿主前后钩端螺旋体RNA,逆转录为cDNA,用随机引物PCR扩增,以HEX和CY5双色荧光标记并与基因芯片进行杂交,使用Genepix 4000B扫描仪扫描芯片,通过检测芯片上的荧光信号比值来研究钩端螺旋体溶血素基因在宿主体内的表达情况。结果成功构建赖型钩端螺旋体56601株溶血素基因芯片,芯片检测发现在宿主感染后钩体溶血素基因LA1029(Ratio=0.65)、LA1027(Ratio=0.53)具有明显上调表达(Ratio<0.67);LA3540(Ratio=1.88)、LA3937(Ratio=5.58)、LA1029(Ratio=3.00)在宿主肝脏中的表达比在血液中有明显增高(Ratio>1.5),而LA4004的表达在宿主肝脏中要明显低于血液中(Ratio=0.67);LA3937(Ratio=2.28)和LA1029(Ratio=2.20)在宿主肾脏中的表达要明显高于血液中(Ratio>1.5)。结论钩体溶血素基因的体内外表达和不同器官间的表达存在差异,这些差异表达的溶血素基因及产物在钩体病的致病中可能起重要的作用。     

致病性钩端螺旋体对豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的抑制作用

目的通过比较不同毒力钩端螺旋体对豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响,探讨固有免疫在钩端螺旋体病发病机制中的作用。方法用三种不同毒力的钩体（致病性问号钩端螺旋体赖型有毒株Lai株、赖型无毒株IPAV株以及非致病性双曲钩端螺旋体Patoc型Patoc Ⅰ株）分别感染体外培养的豚鼠腹腔巨噬细胞,并分别于感染后0.5、1．5、3和6h加入热灭活表皮葡萄球菌孵育30min,通过计算巨噬细胞对灭活表皮葡萄球菌的吞噬率和吞噬指数,检测钩体对巨噬细胞吞噬功能的影响;感染后3h透射电镜观察巨噬细胞对钧体的吞噬、降解和细胞超微结构的变化;     

致病性钩端螺旋体对豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的抑制作用

目的 通过比较不同毒力钩端螺旋体对豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响,探讨固有免疫在钩端螺旋体病发病机制中的作用.方法 用三种不同毒力的钩体(致病性问号钩端螺旋体赖型有毒株Lai株、赖型无毒株IPAV株以及非致病性双曲钩端螺旋体Patoc型PatocⅠ株)分别感染体外培养的豚鼠腹腔巨噬细胞,并分别于感染后0.5、1.5、3和6 h加入热灭活表皮葡萄球菌孵育30 min,通过计算巨噬细胞对灭活表皮葡萄球菌的吞噬率和吞噬指数,检测钩体对巨噬细胞吞噬功能的影响;感染后3 h透射电镜观察巨噬细胞对钩体的吞噬、降解和细胞超微结构的变化;用激光共聚焦显微镜观察细胞对钩体的吞噬和巨噬细胞细胞骨架的变化. 结果 3 h和6 h Lai株、IPAV株及PatocⅠ株感染组与对照组相比吞噬率和吞噬指数均明显降低(P＜0.05);巨噬细胞对三种不同毒力的钩体均有吞噬作用,但有毒株Lai株可以抵抗巨噬细胞的杀伤和降解,而无毒株IPAV和非致病株PatocⅠ株则无此功能. 结论 致病性钩体可以抵抗巨噬细胞的杀伤和降解,逃避固有免疫反应的清除作用,有利其在机体内播散.     

问号钩端螺旋体全基因组的更新注释

目的对问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株全基因组数据库中未注释的基因进行重新注释,并寻找可能的新致病基因.方法将钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株全基因组数据库中功能未知的编码序列(CDSs)在BLASTP/NCBI数据库中比较,初步预测基因功能,对可能的致病基因及其编码产物运用多种生物学软件进行深入分析.结果未知CDSs中有82个与NCBI数据库中的编码蛋白序列有很高的同源性,其中LA0063和LA3291编码金属蛋白酶,可能与致病有关.结论通过钩端螺旋体黄疸出血群赖株全基因组数据库中功能未知的CDSs进行定期比对,可以不断完善该数据库的功能注释,同时可以发现新的致病基因,有助于钩端螺旋体病致病机理的最终阐明.     

问号钩端螺旋体胶原酶体内和体外的活性研究

目的 通过检测致病性钩端螺旋体(钩体)胶原酶在体内、外的活性,探讨问号钩体黄疸出血群赖型赖株(赖株)假定的胶原酶(LA0872)在钩体病出血中的可能作用.方法 在大肠杆菌中克隆、表达重组赖株la0872,并行相关鉴定及蛋白酶学活性检测.比较不同毒力菌株赖株、赖株减毒株和双曲钩体三宝垄群montevalerio型Monte Valerio株钩体胶原酶的基因序列特异性及转录和酶活水平的差异.测定豚鼠和沙鼠赖株感染模型的血清胶原酶活性水平变化.结果 成功构建的重组质粒经酶切和测序鉴定显示位点连接正确,插入序列与GenBank公布的la0872序列完全一致,并证实其具有胶原酶活性;不同毒力菌株中的钩体胶原酶基因序列一致,转录和酶活水平均无显著性差异;豚鼠和沙鼠感染赖株后,宿主体内血清胶原酶活性水平与未感染赖株动物比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 首次表达和鉴定了有活性的钩体胶原酶,但其在钩体病出血中的作用尚待证实和探讨.     

致病性钩端螺旋体对豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的抑制作用

目的通过比较不同毒力钩端螺旋体对豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响,探讨固有免疫在钩端螺旋体病发病机制中的作用。方法用三种不同毒力的钩体（致病性问号钩端螺旋体赖型有毒株Lai株、赖型无毒株IPAV株以及非致病性双曲钩端螺旋体Patoc型PatocI株）分别感染体外培养的豚鼠腹腔巨噬细胞,并分别于感染后0．5、1．5、3和6h加入热灭活表皮葡萄球菌孵育30min,通过计算巨噬细胞对灭活表皮葡萄球菌的吞噬率和吞噬指数,检测钩体对巨噬细胞吞噬功能的影响;感染后3h透射电镜观察巨噬细胞对钩体的吞噬、降解和细胞超微结构的变化;用激光共聚焦显微镜观察细胞对钩体的吞噬和巨噬细胞细胞骨架的变化。结果3h和6h Lai株、IPAV株及Patoc Ⅰ株感染组与对照组相比吞噬率和吞噬指数均明显降低（P〈0．05）;巨噬细胞对三种不同毒力的钩体均有吞噬作用,但有毒株Lai株可以抵抗巨噬细胞的杀伤和降解,而无毒株IPAV和非致病株PatocⅠ株则无此功能。结论致病性钩体可以抵抗巨噬细胞的杀伤和降解,逃避固有免疫反应的清除作用,有利其在机体内播散。     

福建省中部地区鼠类钩端螺旋体感染调查

目的 了解福建省中部地区钩端螺旋体主要宿主动物鼠类的种类构成及鼠类钩端螺旋体感染情况,为钩端螺旋体病的防控提供科学依据.方法 2020年6月-2021年5月,在福建省中部地区的闽侯、长乐等五个县(市、区)现场捕鼠,经鼠种鉴定后采集肾脏组织,采用PCR方法进行钩端螺旋体病原检测,同时接种培养基开展病原分离培养,并通过16...     

赖型钩端螺旋体Loa22重组质粒的蛋白表达和对巨噬细胞的毒性作用

目的对赖型钩端螺旋体Loa22基因进行表达和功能研究。方法构建赖型钩端螺旋体Loa22成熟肽重组质粒,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测目标蛋白表达情况。经亲和层析获得目标蛋白并作用于小鼠巨噬细胞ANA-1,检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活力、四氮唑复合物(XTT)吸光度值和细胞凋亡率以评价其细胞毒性。结果成功构建Loa22成熟肽原核表达质粒,通过鉴定并纯化得到Loa22成熟肽,该蛋白使培养ANA-1细胞上清液中LDH活力升高,XTT吸光度值下降,细胞凋亡率增加。结论Loa22对ANA-1具有明显的毒性效性,该基因可能是致病钩体的一个重要毒力相关基因。     

赖型钩端螺旋体基因库的构建及致病性钩端螺旋体DNA同源序列的克隆

作者应用质粒载体pUC9构建了肺弥漫性出血型构端螺旋体(钩体)病的主要病原——赖型钩体的基因库,并从中筛选出与致病钩体DNA同源的重组质粒pCX7和pCX9。重组质粒pCX9可识别致病钩体017株DNA1.7kb片段、601株9.0kb片段及610株30.0kb片段,而不与非致病的双曲钩体Patoc I株和illini细螺旋体DNA杂交。本研究结果进一步表明:致病钩体与非致病钩体DNA的同源性很低;致病钩体间DNA同源性较高。     

豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬钩端螺旋体的机制研究

目的 研究豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬钩端螺旋体毒力株的机制,探讨天然免疫在钩端螺旋体病发病机制中的作用.方法 提取豚鼠腹腔巨噬细胞,感染1 h前分别加入细胞微丝阻断剂cytochalasin D、微管阻断剂colchicine和PI3K信号通路阻断剂LY294002,同时设立不含阻断剂的对照组,1 h后检测细胞活性.与致病性问号钩体赖型Lai株共同孵育3 h后,激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞吞噬钩体的形态学特征,流式细胞术检测各组吞噬率.结果 对照组巨噬细胞对钩体的吞噬率为(38.98±0.91)%;cytochalasin D组、colchicine组和LY294002组的吞噬率分别为(23.99±1.40)%、(40.81±0.91)%和(39.64±3.56)%;cytochalasin D组吞噬率明显低于对照组(P<0.05);colchicine组和LY294002组与对照组比较差异无统计学意义(均P>0.05).结论 微丝参与了豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬毒力钩体的过程,微管在吞噬过程中不起关键作用,微丝的变化不依赖PI3K信号通路.     

问号钩端螺旋体胶原酶体内和体外的活性研究

目的通过检测致病性钩端螺旋体（钩体）胶原酶在体内、外的活性,探讨问号钩体黄疸出血群赖型赖株（赖株）假定的胶原酶（LA0872）在钩体病出血中的可能作用。方法在大肠杆菌中克隆、表达重组赖株la0872,并行相关鉴定及蛋白酶学活性检测。比较不同毒力菌株赖株、赖株减毒株和双曲钩体三宝垄群montevalerio型Monte Valerio株钩体胶原酶的基因序列特异性及转录和酶活水平的差异。测定豚鼠和沙鼠赖株感染模型的血清胶原酶活性水平变化。结果成功构建的重组质粒经酶切和测序鉴定显示位点连接正确,插入序列与GenBank公布的la0872序列完全一致,并证实其具有胶原酶活性;不同毒力菌株中的钩体胶原酶基因序列一致,转录和酶活水平均无显著性差异;豚鼠和沙鼠感染赖株后,宿主体内血清胶原酶活性水平与未感染赖株动物比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论首次表达和鉴定了有活性的钩体胶原酶,但其在钩体病出血中的作用尚待证实和探讨。     

人参多糖对K562细胞基因表达谱的影响

目的 利用基因表达谱芯片研究人参多糖对体外培养的人红白血病K562细胞基因表达谱的影响。方法 人参多糖处理K562细胞48 h后,分别提取给药组和对照组K562细胞总RNA,将两组RNA纯化为mRNA,逆转录成cDNA,用2种不同的荧光染料Cy3和Cy5进行线性扩增标记,与Illumina全基因组表达谱基因芯片杂交,采用生物信息学方法分析人参多糖处理后K562细胞基因表达谱的改变。结果 共发现差异基因306个,其中上调基因220个,下调基因86个,并对其进行生物学功能分类。结论 诱导肿瘤细胞分化是多基因作用的综合结果,筛选的基因对研究肿瘤发生、发展与逆转分化,以及寻找潜在的抗肿瘤药物作用靶点可能有意义。     

豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬钩端螺旋体的机制研究

目的 研究豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬钩端螺旋体毒力株的机制,探讨天然免疫在钩端螺旋体病发病机制中的作用。方法 提取豚鼠腹腔巨噬细胞,感染1 h前分别加入细胞微丝阻断剂cytochalasin D、微管阻断剂colchicine和PI3K信号通路阻断剂LY294002,同时设立不含阻断剂的对照组,1 h后检测细胞活性。与致病性问号钩体赖型Lai株共同孵育3 h后,激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞吞噬钩体的形态学特征,流式细胞术检测各组吞噬率。结果 对照组巨噬细胞对钩体的吞噬率为（38.98±0.91）%;cytochalasin D组、colchicine组和LY294002组的吞噬率分别为（23.99±1.40）%、（40.81±0.91）%和（39.64±3.56）%;cytochalasin D组吞噬率明显低于对照组（P<0.05）;colchicine组和LY294002组与对照组比较差异无统计学意义（均P>0.05）。结论 微丝参与了豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬毒力钩体的过程,微管在吞噬过程中不起关键作用,微丝的变化不依赖PI3K信号通路。     

清肺消炎丸对豚鼠的镇咳平喘作用研究

目的：研究清肺消炎丸对豚鼠的镇咳平喘作用。方法：采用枸橼酸诱发豚鼠咳嗽模型,记录引咳后3 min内的咳嗽次数,观察清肺消炎丸的镇咳作用。采用豚鼠离体气管平滑肌收缩实验和组胺引喘的活体动物实验对清肺消炎丸的平喘作用进行评价。离体实验中测定药物对乙酰胆碱引起的气管平滑肌收缩的收缩曲线,计算收缩百分率;整体动物实验中测定给药后豚鼠的延喘时间用来表征药物平喘作用的强弱。结果：清肺消炎丸能有效减少豚鼠的咳嗽次数,显著延长咳嗽潜伏期;对豚鼠离体气管收缩的抑制效果较好;对组胺致喘豚鼠的哮喘潜伏期有明显的延长作用。结论：清肺消炎丸具有良好的镇咳、平喘药理活性,为药物的临床应用和进一步开发提供了依据。     

赖型钩体DNA重组质粒rpDJt及其表达蛋白P68对豚鼠的免疫？…

为了进一步鉴定赖型钩体ＤＮＡ重组质粒ｒｐＤＪｔ及其纯化表达蛋白质Ｐ６８例的免疫保护作用，采用随机、以盲和对照法对５０只豚鼠进行了３次和６个部位主动免疫接种，并于接种后３０天以强毒力、大剂量活钩体攻击。结果：Ｐ６８组存活率１００％（７／７）；ｒｐＤＪｔ组存活率７７％（１０／１３）；ｐＴ７－７组（无重组质粒）存活率２５％（３／１０）；全钩灭活疫苗组存活率９３％（１３／１４）。作者认为该质粒的表达蛋白质     

治咳川贝枇杷滴丸镇咳平喘作用研究

目的：研究治咳川贝枇杷滴丸对豚鼠的镇咳、平喘作用。方法：采用豚鼠离体气管平滑肌收缩实验和组胺引喘的活体动物实验对治咳川贝枇杷滴丸的平喘作用进行评价。在离体实验中测定药物对乙酰胆碱引起的气管平滑肌收缩的收缩曲线,计算收缩百分率;在整体动物实验中测定给药后豚鼠的延喘时间用来表征药物平喘作用的强弱。同时采用枸橼酸诱发豚鼠咳嗽模型,通过记录引咳后5 min内的咳嗽次数,观察治咳川贝枇杷滴丸的镇咳作用。结果：治咳川贝枇杷滴丸能有效减少豚鼠的咳嗽次数,显著延长咳嗽潜伏期;对豚鼠离体气管收缩的抑制效果较好;对组胺致喘豚鼠的哮喘潜伏期有明显的延长作用。结论：治咳川贝枇杷滴丸具有良好的镇咳、平喘药理活性,为药物的临床应用和进一步开发提供了依据。     

钩端螺旋体基因组学及蛋白组学研究进展

钩端螺旋体(简称钩体)可以引起严重的人兽共患病,是威胁人类健康的传染病之一.课题组率先开展了对中国主要致病流行株56601的全基因组测序工作,测序结果显示钩体有两条染色体,共编码4 727个基因,后经重新注释为3 718个基因.基于56601株的参考序列,对其减毒株IPAV的测序结果表明,除了有101个基因出现突变之外,IPAV株基因组的大小及基因结构组成与56601株相同.基于基因组序列,课题组设计并合成了钩体的基因组芯片,开展了比较基因组学及转录组学的研究.比较基因组学研究结果显示,钩体的核心基因有2 917个,变异基因有275个,并首次发现钩体基因组中存在2个基因岛.模拟体内外钩体生长的温度条件进行转录组学分析,共发现106个基因差异表达,分属9类不同的功能;对有毒株56601及减毒株IPAV进行转录组学分析,发现了差异上调表达的22 kb的类噬菌体片段.对体外培养的56601株进行蛋白组学分析,鉴定出2 540个蛋白,进一步对这些蛋白进行磷酸化、乙酰化及甲基化的修饰进行分析,发现了32个磷酸化位点、46个乙酰化位点和155个甲基化位点.通过分析发现,钩体蛋白的很多修饰方式类似于真核生物,提示钩体在进化上比较特殊.比较毒力株56601与减毒株IPAV的蛋白组异同,一致表达的蛋白1 627个,差异表达的蛋白402个.基于以上基因组学及蛋白组学研究,课题组进一步开展了对钩体相关功能基因的研究,这些研究均为揭示钩体的致病机制、开发钩体的疫苗及诊断试剂、最终防控钩体病奠定了基础.