人bcl-xl转基因小鼠外源基因的复制及其传代稳定性

背景：近年的研究表明。在脑缺血再灌注损伤机制中，bcl-xl基因可能起着抗神经细胞凋亡的脑保护作用。 目的：观察转bcl-xl基因小鼠外源基因的复制及传代稳定性问题。 设计：以基因为观察对象。 单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院神经科和湖北省农科院畜牧兽医研究所。 材料：实验于1999-10／2001-04在华中科技大学同济医学院附属同济医院完成。选取昆明种小鼠4只。 方法：通过显微注射法建立转人bcl-xl基因小鼠，将PCR及Southem-blot检测整合阳性的小鼠与正常鼠交配并传代，然后检测子代小鼠外源基因的表达情况。作Southern-blot检测，结果证实第10，13，5，6号小鼠为整合阳性小鼠。以4只整合阳性小鼠作为首建者，分别与正常的昆明白小鼠交配繁殖传代，所生子代记为F1代，各系列的Fl～F4代均采用阳性转基因小鼠与正常的昆明白小鼠交配繁殖传代方法，保持其杂合子形式。主要观察指标：检测外源基因的复制和传代的稳定性。 结果：10号小鼠传代过程中外源基因PCR检测阳性率保持稳定，符合盂德尔遗传规律，表明外源基因能够稳定遗传。6号小鼠PCR阳性率呈轻微下降趋势，但仍能够保持相对稳定遗传。13号和5号小鼠PCR阳性率均呈明显的下降趋势，表明这2只小鼠存在外源基因遗传丢失现象。 结论：应用基因组DNA做目的基因，可获得能够稳定遗传的转基因鼠系。     

APP/PSl双转基因阿尔海默病小鼠的繁殖及基因型鉴定

目的:繁殖和基因鉴定APP/PS1双转基因阿尔海默病(AD)小鼠。方法:将雄性纯合子APP/PS1双转基因AD小鼠与阴性纯合子(野生型)雌鼠进行交配。PCR鉴定APP/PS1双转基因AD传代小鼠的基因表型。结果:50只APP/PS1双转基因AD传代小鼠基因组DNA中31只小鼠基因组DNA扩增出300 bp的APP条带和600 b P的PS1条带。APP/PS1双转基因AD小鼠的饲养和繁殖获得成功,获得了较多的成功转入APP/PS1基因的纯合子小鼠。结论:正确饲养繁殖及利用PCR对AD模型鼠的繁殖小鼠进行基因鉴定,是有效获得APP/PS1双转基因纯合子小鼠的有效途径,为临床更好的研究认知障碍提供有效的AD动物模型。     

阿尔茨海默病APPswe/PS1dE9双转基因小鼠对挥发性吸入麻醉药药物敏感性的变化

目的:研究阿尔茨海默病APPswe/PS1dE9双转基因小鼠对挥发性吸入麻醉药药物敏感性的变化.方法:C57BL/6J雌鼠与C3H/HeJ雄鼠交配得到F1代.再将F1代与3月龄的APPswe/PSldE9双转基因小鼠交配得到F2代.F2代小鼠提取鼠尾DNA,PCR扩增目的基因并鉴定.选8月龄F2代同窝小鼠根据是否含APP和PSI基因分为转基因组和野生对照组,用夹尾法分别测定两组异氟醚、七氟醚和地氟醚3种挥发性吸入麻醉剂的最低肺泡有效浓度(MAC值).结果:繁育F2代小鼠12只,其中转基因组7只,野生对照组5只.转基因组小鼠3种挥发性吸入麻醉剂MAC值分别为异氟醚1.129 ±0.160,七氟醚1.900±0.153,地氟醚5.614±0.363,均较野生对照组低,但是无统计学差异(P>0.05).结论:APP/PSI双转基因对8月龄小鼠异氟醚、七氟醚、地氟醚3种挥发性吸入麻醉剂的MAC值无明显影响.     

阿尔茨海默病APPswe/PS1ΔE9双转基因小鼠脑区中老年斑的分布

目的:观察老年斑在不同月龄的APPswe/PS1ΔE9双转基因小鼠脑区中的分布。方法:将雄性的杂合子小鼠与C57BL/6J雌鼠交配,所生的小鼠提取鼠尾DNA,PCR扩增目的基因。取鉴定为阳性的2.5、4.5、8月龄的杂和子小鼠各3只,进行Thioflavine S和Aβ免疫组织化学染色,观察老年斑的沉积。结果:共生产小鼠F1代39只,鉴定为阳性的有17只,阳性率为43.6%。组织学染色发现2.5月龄小鼠的脑区未见老年斑沉积,而4.5月龄及8月龄小鼠的皮质及海马可见老年斑沉积,并且随着月龄的增加,老年斑的数目增多,面积增大。结论:APP-swe/PS1ΔE9双转基因小鼠在4月龄时已有老年斑的沉积,为研究AD提供了很好的载体。     

阿尔茨海默病APPswe/PS1△E9双转基因小鼠脑区中老年斑的分布

目的:观察老年斑在不同月龄的APPswe/PS1△E9双转基因小鼠脑区中的分布.方法:将雄性的杂合子小鼠与C57BL/6J雌鼠交配,所生的小鼠提取鼠尾DNA,PCR扩增目的基因.取鉴定为阳性的2.5、4.5、8月龄的杂和子小鼠各3只,进行Thioflavine S和Aβ免疫组织化学染色,观察老年斑的沉积.结果:共生产小鼠F1代39只,鉴定为阳性的有17只,阳性率为43.6%.组织学染色发现2.5月龄小鼠的脑区未见老年斑沉积,而4.5月龄及8月龄小鼠的皮质及海马可见老年斑沉积,并且随着月龄的增加,老年斑的数目增多,面积增大.结论:APP-swe/PS1△E9双转基因小鼠在4月龄时已有老年斑的沉积,为研究AD提供了很好的载体.     

AML1-ETO转基因小鼠的建立及初步表型分析

目的:建立AM L1-ETO融合基因转基因小鼠,在整体动物水平研究AM L1-ETO融合蛋白在白血病发病中所起的作用。方法:构建hCG/AM L1-ETO转基因质粒,通过显微注射将该质粒转入小鼠受精卵中,植入假孕母鼠输卵管,获得G0代转基因小鼠;用聚合酶链反应(PCR)方法检测融合基因的整合情况,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测融合基因的表达情况和组织表达谱。结果:PCR法共检出10只G0代转基因阳性小鼠,其中8个系均产下F1代小鼠,由此建立了8个AM L1-ETO转基因小鼠系。RT-PCR法证实AM L1-ETO融合基因在22系中稳定表达,但血常规、肝脏、脾脏等组织未见异常变化;对该系小鼠的组织表达谱检测表明,融合基因在肝脏、脾脏、心脏和肌肉组织存在不同程度的表达,但在脑组织中不表达。结论:AM L1-ETO融合基因能在转基因小鼠的骨髓等组织中表达,但尚不足以引发白血病,推测其他致病基因在小鼠白血病的发生中也起一定作用。     

突变Myc基因骨髓特异性转基因小鼠肿瘤模型的建立及鉴定

目的 研究通过外源Myc基因转染造血细胞,实现骨髓特异性转基因并形成淋巴瘤的潜能.方法 造血细胞转染野生型与突变型Myc基因.移植入经~(60)Coγ射线照射的C57BL/6小鼠,观察小鼠形成肿瘤时间以及小鼠自然死亡时间,免疫组织化学染色法检测肿瘤类型;流式细胞术检测外源Myc基因在小鼠骨髓MNC中的表达;骨髓造血细胞、肝、脾、肿瘤组织行Myc免疫印迹法检测Myc在体内的表达情况.结果 Mye基因转基因后形成B细胞淋巴瘤,流式细胞术检测发现外源Myc基因可在造血细胞表达,突变型Myc基因阳性率高于野生型Myc基因,Myc基因转染骨髓造血细胞后,骨髓、肿瘤组织有较高表达,肝、肾组织则无表达.结论 外源Myc基因特异转染造血细胞可形成组织特异性转基因;突变型Myc基冈致瘤性高于野生型Myc基因.     

钙蛋白酶抑制蛋白基因过表达Balb/C小鼠的繁育及鉴定

目的:建立钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,CAST)基因过表达Balb/C小鼠的培育方法,并探讨碱性裂解液提取基因组DNA在子代鼠基因型鉴定中的价值。方法:将雄性C57BL/6-CAST~(+/-)转基因小鼠与雌性Balb/C野生型小鼠杂交,将雄性CAST~(+/-)杂合子代小鼠与雌性Balb/C野生型子代小鼠杂交,连续杂交至消除C57BL/6小鼠遗传背景。取子代小鼠鼠尾组织,采用碱性裂解液提取基因组DNA,PCR法扩增CAST基因片段,琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。采用柯萨奇B3病毒(CVB3)感染Balb/C-CAST~(-/-)小鼠以建立急性病毒性心肌炎小鼠模型。结果:C57BL/6-CAST~(+/-)转基因小鼠与雌性Balb/C野生型小鼠连续杂交10代可消除C57BL/6小鼠遗传背景。采用碱性裂解液提取的基因组DNA数量、纯度能够满足后续实验需要,且产物大小与目的片段一致。成功建立Balb/C-CAST~(-/-)基因型小鼠急性病毒性心肌炎模型。结论:成功建立Balb/CCAST基因过表达小鼠,为后续研究奠定了基础;碱性裂解液提取基因组DNA简便、高效,值得推广。     

精子载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在转基因小鼠体内的表达

利用精子载体技术通过人工授精观察人凝血因子Ⅷ基因在转基因小鼠体内的表达，将含有人FⅧBD（B-domain deleted)cDNA的质粒pRC/RSV-hFⅧBDl转染至小鼠精子，通过人工授精使母鼠受孕，新生小鼠出生后第4周，应用PCR筛查hFⅧBDcDNA阳性转基因幼鼠，取转有人FⅧBDcDNA幼鼠的血液检测血浆中的人FⅧ抗原和抗体，分别用Northern印迹和Western印迹检测脾，肝，肺和肾组织中人FⅧBDcDNA的转录和表达。结果发现，人工授精后20只受体母鼠7只受孕，共产下11只仔鼠，存活9只，PCR筛检出3只转有人FⅧBDcDNA的阳性鼠，3只阳性鼠血浆中的人FⅧ抗原量分别为8.65ng/ml,7.84ng/ml和8.44ng/ml，人FⅧ的抗体均为阴性。Northern印迹和Western印迹检测显示3只F1代阳性幼鼠的脾，肝，肺和肾组织中均有人FⅧBDcDNA的转录和表达。结论提示，利用精子载体法可以制备转有人凝血因子Ⅷ基因的转基因小鼠，并表达人FⅧ蛋白，这为用精子载体技术生产转基因动物并将之作为生物反应器生产人凝血因子Ⅷ提供了实验依据。     

武汉地区缺血修饰白蛋白参考区间的建立

目的建立武汉地区缺血修饰白蛋白(IMA)的参考区间。方法 1016名健康体检者来自武汉大学医学院附属湖北省人民医院、华中科技大学同济医学院附属同济医院、华中科技大学同济医学院附属梨园医院和武汉市第一医院。测定所有体检者的IMA、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血清白蛋白(Alb)、血清葡萄糖(Glu)、肌酐(Cr)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)和心电图(ECG),排除Alb、ALT、Glu、Cr、TG、TC和ECG异常者后,计算并删除IMA的离群值,统计剩余的911名健康体检者的IMA检测结果。按性别、年龄分组计算参考区间。结果男性、女性IMA水平间差异无统计学意义,<30岁人群的IMA参考区间为≥67.0 U/mL,≥30岁人群的IMA参考区间为≥64.4 U/mL,参考区间的差异是由Alb浓度的差异导致的。结论 IMA参考区间的规范建立对IMA检测结果解释及临床应用有重要价值。     

武汉地区缺血修饰白蛋白参考区间的建立

目的建立武汉地区缺血修饰白蛋白（IMA）的参考区间。方法 1016名健康体检者来自武汉大学医学院附属湖北省人民医院、华中科技大学同济医学院附属同济医院、华中科技大学同济医学院附属梨园医院和武汉市第一医院。测定所有体检者的IMA、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、血清白蛋白（Alb）、血清葡萄糖（Glu）、肌酐（Cr）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）和心电图（ECG）,排除Alb、ALT、Glu、Cr、TG、TC和ECG异常者后,计算并删除IMA的离群值,统计剩余的911名健康体检者的IMA检测结果。按性别、年龄分组计算参考区间。结果男性、女性IMA水平间差异无统计学意义,〈30岁人群的IMA参考区间为≥67.0 U/mL,≥30岁人群的IMA参考区间为≥64.4 U/mL,参考区间的差异是由Alb浓度的差异导致的。结论 IMA参考区间的规范建立对IMA检测结果解释及临床应用有重要价值。     

胶质细胞源性营养因子及内皮素B受体基因共转染小鼠神经干细胞

背景:胶质细胞源性神经营养因子与内皮素B受体基因的缺失将导致肠神经系统发育异常.神经干细胞移植不仅可以从解剖和功能上修复神经系统,还可以作为基因转染的载体.目的:拟将携带胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因的重组腺病毒转染至小鼠神经干细胞,并观察目的基因的表达.设计:细胞-基因学观察.材料:新生昆明小鼠由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供.jetPEI转染试剂为PolyPlus公司产品;携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子、内皮素B受体基因共表达腺病毒由本室孙念峰博士和张景辉博士构建并惠赠.方法:无菌条件下取新生小鼠脑组织,制备单细胞悬液.取携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因共表达腺病毒,溶解于NaCI中制备JetPEI/DNA复合体.用DMEM/F12完全培养基调整次代神经干细胞密度为5×10~8L~(-1),向24孔板中每孔加入400 μL细胞悬液、100 μL、JetPEI/DNA复合体,置37℃、体积分数为5%的CO_2培养箱中,分别于转染24,48,72 h后收集神经干细胞.主要观察指标:采用荧光显微镜、流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR检测目的基因在神经干细胞内的表达.结果:转染24 h后即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达,转染24,48,72 h后绿色荧光蛋白阳性率分别为15.36%,24.67%,25.73%.各转染时间点神经干细胞均表达胶质细胞源性神经营养因子及内皮素B受体基因,转染24 h条带亮度较低,72 h时外源基因表达水平最高.结论:运用jetPEI试剂成功将目的基因转染至小鼠神经干细胞内,且胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因在靶细胞中得到有效转录和表达.     

机器人辅助立体定向硬通道血肿穿刺系统操作性能评价

目的:评价机器人辅助立体定向系统在脑出血硬通道血肿抽吸术中的操作性能。方法:采用机器人辅助立体定向系统对7只实验性脑出血猪进行硬通道血肿抽吸术,评价其操作性能。结果:该定向系统有较高的安全性、实用性,各操作之间连接顺畅,操作难易程度适中,配准时间较短。结论:该立体定向系统操作性能优良,自动化程度尚需提高。     

工频电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2和转化生长因子β1 mRNA表达的刺激

背景:研究证实电磁场刺激能够促进多种骨生长因子的合成与分泌,而某些生长因子具有诱导骨髓间充质干细胞定向分化成骨的作用。目的:分析工频电磁场对体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2和转化生长因子β1mRNA表达的影响。设计:单一样本、区组设计,观察对比动物实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科。材料:实验于2005-02/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨外科实验室完成。①选取清洁级昆明种小鼠20只,作为实验用骨髓间充质干细胞的来源。②电磁场发生器由武汉市海军工程大学研制,能生成场强为0～100mT的连续可调的50Hz正弦波电磁场。③引物均由北京赛百胜生物工程公司合成。方法:①小鼠以颈椎脱臼法处死,取双侧股骨和胫骨,体外分离培养骨髓间充质干细胞,取第2代细胞用于实验。②不同强度电磁场刺激实验:设立阴性对照组、阳性对照组、电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组,每组均取5瓶第2代细胞。阴性对照组、阳性对照组均不给予电磁场刺激,但阳性对照组于传代时加入含成骨性诱导剂(含10-8mol/L地塞米松,10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,50mg/LVitaminC)的培养基;电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组在细胞贴壁后分别于0.4,0.8,1.6mT场强中进行电磁场刺激,每天均连续刺激1h,5d后进行指标检测。③相同场强不同作用时间电磁场刺激实验:设立阴性对照组、电磁场1.6mT刺激15,30,60min组,每组均取5瓶第2代细胞。阴性对照组不进行电磁场刺激;电磁场1.6mT刺激15,30,60min组在1.6mT场强条件下每天分别给予15,30,60min的连续电磁场刺激,5d后进行指标检测。④RT-PCR技术检测各组细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达。主要观察指标:①不同强度电磁场刺激对小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA表达的影响。②相同场强不同作用时间电磁场刺激小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA表达的影响。结果:①电磁场刺激5d后,与阴性对照组比较,阳性对照组及电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1mRNA的表达均明显增强(P均<0.01);且电磁场1.6mT刺激组骨形态发生蛋白2mRNA的表达达到最大值(57.74±0.23)%,电磁场0.4mT刺激组转化生长因子β1mRNA的表达达到最大值(126.20±0.21)%。②电磁场刺激5d后,与阴性对照组比较,电磁场1.6mT刺激15,30,60min组骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达均明显增强(P均<0.01);且电磁场1.6mT刺激60min组两种因子mRNA的表达分别达到最大值(28.06±0.11)%和(75.20±0.16)%。结论:适当强度及作用时间的工频电磁场刺激,能够明显促进体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达。     

单启动子双表达载体pIRES-p14ARF-p53的构建及对骨肉瘤细胞增殖的抑制

背景：以往的研究表明，ADp14ARF转染p53阳性的肿瘤细胞系，可以发现明显的细胞增殖受阻现象。而转染p53阴性的肿瘤细胞系，尽管也可见肿瘤细胞增殖受阻，但在程度上明显轻于前者。同时转染p14ARF和p53两种基因，既增强p53表达又加强p53积累，能否更易促进肿瘤细胞凋亡？目的：利用基因工程技术构建双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53，并观察其对骨肉瘤细胞增殖生长的抑制作用。设计：随机对照观察。单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科。材料：实验于2005—01／2006—10于华中科技大学同济医学院基础医学院免疫教研室公共实验平台完成。人骨肉瘤MG-63细胞有华中科技大学同济医学院免疫教研室细胞室提供。含p53全长基因序列的质粒pIRES-p53和pIRES载体均购自武汉晶赛生物公司。方法：利用基因工程技术，将从培养的正常人肝细胞系L02细胞中扩增出的p14cDNA（0．5kb）亚克隆至pIRES载体中，通过PCR、限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pIRES-p14ARF-p53。通过脂质体介导转染入骨肉瘤MG-63细胞中，并筛选出阳性克隆，将细胞分为3组：空白对照组（MG-63细胞），空载体对照组（稳定转染pIRES-neo细胞），p14ARF-p53组（稳定转染pIRES-p14ARF-p53细胞）。①采用流式细胞仪测定转染前后瘤细胞DNA含量和细胞周期。②逆转录PCR（RT-PCR）和Westem bolt对稳定转染后的瘤细胞p53、p14ARF蛋白的表达进行定性和半定量检测。③采用噻唑蓝比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。主要观察指标：①骨肉瘤细胞DNA含量和细胞周期。②瘤细胞p53、p14ARF蛋白的表达。③细胞增殖情况。结果：成功构建出双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53。①骨肉瘤细胞DNA含量和细胞周期：流式细胞仪检测发现转染后的瘤细胞多停滞于G1期。②蛋白表达检测结果：RT-PCR与Western blot检测证实p14ARF、p53基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达。③细胞生长情况：转染MG-63后24，48，72，96h瘤细胞生长抑制率分别为33．43％、69．37％、66．19％、75．26％，与空载体对照组差异显著（P〈0．01）。结论：野生型p53和p14ARF可协同抑制骨肉瘤细胞的增殖促进瘤细胞的凋亡。     

骨折愈合过程中生长因子表达与中药阿胶复方的干预效应

背景:阿胶强骨口服液可有效治疗骨折,但其具体的药理学机制仍有待研究。在骨折愈合中,血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子2是促进血管内生以及骨的合成代谢的重要耦联因子。目的:观察阿胶强骨口服液对SD大鼠胫骨骨折愈合过程中骨痂中血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子2表达的影响,探讨阿胶强骨口服液治疗骨折的疗效机制。设计:完全随机对照实验。单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院骨伤科研究室。材料:选用90只雌性3月龄SD大鼠,体质量(368±40)g,阿胶强骨口服液(主要成分为阿胶,新疆华世丹药业股份有限公司生产);阳性对照药接骨七厘片(主要成分为当归、乳香、没药、大黄、血竭、骨碎补、自然铜,珠海金沙(湖南)制药有限公司生产)。方法:实验于2005-07/12在华中科技大学同济医学院中西结合骨代谢实验室(省级实验室)完成,采用三点弯曲方法造成大鼠右胫骨中段闭合性骨折后,采用完全随机法分为3组:阿胶强骨口服液组(n=30):按人鼠表面积比率换算等效计量法计算后,每只每次给予阿胶强骨口服液2mL灌胃给药,2次/d;接骨七厘片组(n=30):用蒸馏水配制成225g/L灌胃,2次/d;生理盐水组(n=30):给予同等容量,同等频率的生理盐水灌胃。分别在实验第4,7,14,21,28天采用免疫组织化学方法检测大鼠右胫骨骨痂区血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子2表达的变化,计算平均吸光度值及阳性细胞数(5个视野细胞)。主要观察指标:各组大鼠右胫骨骨痂区血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子2表达(平均吸光度值及阳性细胞数)。结果:纳入大鼠90只均进入结果分析。①血管内皮生长因子表达检测结果:实验开始后4,7,14d,阿胶强骨口服液组大鼠及接骨七厘片组平均吸光度值均高于生理盐水组(P<0.05～0.01),阳性细胞数变化幅度与平均吸光度值一致。②成纤维细胞生长因子2表达检测结果:实验开始后4,7d,阿胶强骨口服液组及骨七厘片组成纤维细胞生长因子2平均吸光度值,均高于生理盐水组(P<0.05～0.01),阳性细胞数变化幅度与平均吸光度值一致。结论:阿胶强骨口服液在骨愈合早中期可通过调节血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子2的表达,促进前成骨细胞和成软骨细胞的有丝分裂、血管内生以及骨的合成代谢达到促骨折愈合的作用。     

小鼠局灶性脑缺血再灌注模型的稳定性与可重复性

背景目前,转基因小鼠越来越多地在脑血管病研究中应用,小鼠的脑缺血再灌注模型是进行该项研究的一种重要模型,因此对该小鼠模型的稳定性和可重复性研究也变得非常必要. 目的建立重复性强,稳定性好的小鼠大脑中动脉脑缺血模型,为以后对转基因小鼠的研究做好技术准备. 设计采用配对两组比较的研究方法. 地点和材料实验在华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所进行,选用 BALB/c和昆明白两种小鼠(均购自同济医科大学动物房) , 5～ 0及 6～ 0两种规格的尼龙丝线,在不同条件下进行试验. 干预选择 BALB/c和昆明白两种小鼠进行栓塞试验,观察小鼠品系、体质量、线栓规格及术后温度对梗死结果的影响. 主要观察指标小鼠的梗死体积及神经功能评分. 结果昆明白小鼠的平均梗死体积为 (12± 4)mm3, BALB/c小鼠的平均梗死体积为 (22± 3 )mm3,两者比较差异有显著性意义( t=16.425,P< 0.01). BALB/c小鼠的神经功能评分与昆明白小鼠比较差异有显著性意义( t=2.005,P< 0.05). 17～ 22 g小鼠匹配 6～ 0的线栓组较 30～ 35 g 的小鼠匹配 6～ 0线栓组梗死体积所占百分比较大( t=14.070 , P< 0.01),神经功能评分也高于后者( t=3.714, P< 0.05). 结论小鼠品系、小鼠体质量与线栓规格是否匹配、术后温度是否保持恒定均影响小鼠线栓模型的稳定性.必须严格控制上述各种因素以建立稳定的小鼠局灶性脑缺血模型,为脑科学研究提供可靠的技术支持.     

神经营养素3基因转染神经干细胞及其表达

背景:应用包括神经营养素3的神经营养因子促进周围神经再生是当今周围神经再生研究的热点之一,但是临床应用上缺乏安全、有效的给药途径.基因转染技术为神经营养因子的临床应用提供了新的思路和途径.目的:用神经营养素3基因修饰神经干细胞,并观察在转染后的神经干细胞内的表达情况.设计:完全随机试验.单位:广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科和华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科.材料:实验选用健康SD大鼠3只,鼠龄4个月,雌雄不拘,由华中科技大学同济医学院动物房提供.用于转染神经干细胞的重组腺病毒表达载体由华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室构建,浓度为0.15 g/L.方法:实验于2002-12/2004-03在华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室和同济医院中心实验室完成.采用阳离子脂质体介入法,将含绿色荧光蛋白(GFP)基因的组组质粒pAd-神经营养素3转染原代培养的神经干细胞,转染72 h后采用荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白在神经干细胞上的表达,测定转染率.采用免疫细胞化学染色法和反转录-聚合酶链反应检测转染72 h,1,5周后神经营养素3基因在神经干细胞中的表达和转录情况.主要观察指标:神经营养素3基因在转染后的神经干细胞内的表达情况.结果:①重组质粒pAd-神经营养素3转染神经干细胞:转染72h绿色荧光蛋白在部分神经干细胞上有表达,转染率为40%.5周后仍可见绿色荧光蛋白的表达.②神经营养素3基因在神经干细胞中的转录与表达:转染72 h,1,5周后神经干细胞中均有神经营养素3 mRNA的转录,转染5周后仍有神经营养素3 mRNA的表达.结论:神经营养素3基因以阳离子脂质体为载体,通过腺病毒的介导,可有效的转染培养的神经干细胞并长期表达.