WN-γ基因修饰的骨髓基质细胞体外抗白血病作用的实验研究

目的研究重组人IFNγ腺病毒(Ad/hIFNγ)在CML病人骨髓基质细胞(BMSCs)中的转染效率、IFNγ表达,并进一步观察转染Ad/hIFNγ的骨髓基质细胞体外抗白血病细胞株K562增殖和诱导K562细胞凋亡的作用。方法以Ad/hIFNγ重组腺病毒按感染复数(MOI)为50转染CML病人骨髓基质细胞,RTPCR、ELISA及Westernblot分别检测转染Ad/hIFNγ的人骨髓基质细胞(BMSCs)中IFNγmRNA和IFNγ的表达;转染Ad/hIFNγ的骨髓基质细胞与K562细胞共培养,通过绘制K562细胞生长曲线分析其对K562细胞增殖的影响;并进一步通过流式细胞学分析其对K562细胞周期的影响和诱导凋亡的作用。结果RTPCR、Westernblot及ELISA方法都分别检测到转染Ad/hIFNγ的人骨髓基质细胞(BMSCs)中IFNγmRNA和IFNγ的表达;与对照组相比,转染Ad/hIFNγ的人骨髓基质细胞的实验组具有明显的抑制K562细胞增殖的作用(P=0.000),在细胞周期G1期的K562细胞比例明显增加,而S期K562细胞比例显著下降(P<0.01),并显著诱导K562细胞的凋亡(P<0.01)。结论Ad/hIFNγ转染人骨髓基质细胞后可获得IFNγ有效的表达,并在体外能有效地发挥抗白血病细胞作用。     

Ad/IFNγ转染的骨髓基质细胞的体内抗白血病作用

目的观察Ad/IFNγ转染的骨髓基质细胞在小鼠体内表达IFNγ的特征及规律,并观察其抗白血病作用。方法Ad/IFNγ(MOI=50,MOI感染复数)体外转染骨髓基质细胞,并通过RT-PCR,ELISA检测骨髓基质细胞表达IFNγ;将K562细胞成瘤的裸鼠随机分为3组,分别给予静脉回输Ad/IFNγ转染的骨髓基质细胞、Ad/LacZ转染的骨髓基质细胞以及未转染的骨髓基质细胞,每只裸鼠的回输量为2×106个细胞,以RT-PCR,ELISA检测IFNγ在裸鼠体内表达的规律并观察其抑瘤效应及生存期。结果RT-PCR,ELISA于体外均能检测到IFNγ的表达。体内研究发现,Ad/IFNγ-骨髓基质细胞组在体内检测到的IFNγ主要分布在肝、脾、骨髓和肿瘤中,但在血液中未能检测到IFNγ的表达。并且,Ad/IFNγ-骨髓基质细胞于体内有明显的抑瘤效应,并能够延长其生存期。结论骨髓基质细胞能够将外源性IFNγ基因携带至肝、脾、骨髓等造血组织,也能携带至肿瘤组织,基因修饰的骨髓基质细胞为我们提供了治疗白血病的新的前景。     

骨髓基质细胞体外成骨的实验研究

目的 研究骨髓基质细胞体外培养的成骨能力,为细胞移植修复骨缺损提供一条新途径。方法 取新西兰大白兔股骨大转子处骨髓,进行体外培养,纯化,10－14天后进行转代。培养后的细胞经倒置显微镜,透射地镜,钙染色,碱性磷酸酶染色等方法进行观察。结果 培养纯化后的细胞呈梭形,多角形,电镜显示具有分泌功能旺盛的结构,碱性磷酸酶染色强阳性,培养3－4周后,能形成钙结节。细胞在体外能多次传代,维持成骨表型。结论 骨髓基质细胞在体外培养纯化后,骨与成骨细胞相似的形态结构和生物学特性,能形成钙化的骨样组织。     

促血小板生成素基因转染小鼠骨髓基质细胞体外表达的实验研究

目的探讨促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)基因修饰的小鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)体外表达TPO的变化特点。方法以脂质体介导法将TPO cDNA真核表达质粒转染BMSCs,RT-PCR方法检测TPO mRNA的表达,免疫组化法及Western blot测定TPO蛋白的表达。结果转染TPO基因的BMSCs其TPO mRNA及TPO蛋白表达量明显高于空载体组(P<0.01)及未转染组(P<0.01)。结论阳离子脂质体能有效介导TPO cDNA真核表达质粒转染BMSCs,且转染后BMSCs中TPO mRNA及TPO蛋白的表达显著上调。     

骨髓基质细胞体外三维培养的研究

目的:建立骨髓基质细胞(BMSC)体外三维培养的方法,并观察其细胞生长形态及生物学特征。方法:制备鼠尾胶原,对BMSC进行三维培养,共聚焦显微镜观察细胞形态,MTT、ALP钙钴、苏丹Ⅲ染色观察BMSC增殖及分化。结果:三维培养的BMSC早期呈现集落生长特点,后逐渐向不同的形态转变,与二维培养相比,细胞增殖峰值提前,且向成骨及脂肪细胞分化能力增强。结论:BMSC在体外三维培养模式下生长良好,能够继续保持其自我更新能力及分化潜能。     

扇贝多肽促进骨髓基质细胞体外增殖作用的研究

目的 研究扇贝多肽（polypeptides form chlamys farreri，PCF）促进骨髓基质细胞（Bone marrow stem cells，BMSCs）修复的机制和体外培养作用的最适浓度。方法 将成年兔骨髓基质细胞分离纯化后培养24h后分成4组，扇贝多肽组（按用药浓度分3组：0．01mg／L组为B组，0.1mg／L为C组，1mg／L为D组）和正常组为A组，采用相差显微镜观察，每日计数测定BMSCs的增殖曲线，24h、72h后用流式细胞仪测定S期的比例。结果 0．01mg／L浓度对BMSCs的增殖作用不明显，C组和D组在24h和72h后处于S期的BMSCs明显增多。10d后药物组细胞计数明显高于对照组。其中C组和D组和对照组的倍增时间分别为6．2、4，9、8．4d。两者相比，差异有显著性（P〈0．01）。结论 扇贝多肽能显著地促进BMSCs的增殖从而促进神经损伤的修复。     

骨髓基质细胞体外成骨能力的实验研究

目的 研究骨髓基质细胞(BMSc)的体外成骨能力，为骨组织工程研究提供细胞来源。方法 采用密度梯度离心法将兔BMSc自小量骨髓中分离培养，并观察第2代BMSc在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠诱导条件下的生长及成骨分化情况。结果 BMSc呈成纤维细胞样表现，增殖能力强，在诱导条件下碱性酸酶活性明显增高，并出现矿化结节。结论 BMSc体外增殖能力强，成骨能力肯定。地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠可促进BMSc向成骨细胞分化。     

大鼠骨髓基质细胞体外增殖分化的实验方法研究

目的:研究大鼠骨髓基质细胞(MSC)在体外增殖分化为神经元样细胞的条件,为MSC的移植提供实验参考。方法:用DMEM冲洗SD大鼠四肢骨的骨髓腔,通过密度梯度离心获得有核细胞后接种于DMEM/10%胎牛血清培养液中,观察在培养液中加入神经生长因子后对MSC的增殖、分化及存活的影响,并以β-巯基乙醇(β-ME)作对照观察MSC分化及分化后的存活情况。结果:在DMEM/10%胎牛血清培养液中加入神经生长因子后MSC增殖速度加快,培养7~9 d后有神经元样细胞形成,表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)为(52±9.2)%,神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)为(15±7)%,细胞分化后继续培养仍可存活7 d以上。而用β-ME诱导MSC,6 h后表达NSE为(71.0±8.8)%,GFAP阴性,分化细胞24 h后逐渐死亡。结论:MSC在DMEM/10%胎牛血清培养液中加入神经生长因子后增殖速度加快,可以分化为神经元样细胞,分化细胞存活时间延长。     

骨髓基质细胞体外诱导成神经细胞的实验研究

目的：探讨骨髓基质细胞(BMSCs)体外诱导分化成神经细胞的可能性。方法：以成人BMSCs为实验对象，用碱性成纤维生长因子促进细胞增殖，胶质细胞神经营养因子(GDNF)等作诱导剂，观察诱导前后BMSCs的变化。结果：用GDNF等诱导24h后大量的BMSCs出现了巢蛋白抗体的表达，诱导72h后，BMSCs向多角形或不规则形转变，并可见突起生成，甚至形成类似网络状结构；诱导72h即有神经元特异性烯醇化酶的表达，并出现微管相关蛋白22、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。结论：成人BMSCs在体外条件下，经GDNF等诱导可分化成神经细胞。     

大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化的研究

目的:探索骨髓基质细胞体外定向诱导分化为神经细胞的可能性。方法:取大鼠的骨髓基质细胞在体外培养,用免疫组化方法检测正常脊髓提取液和脑源性神经生长因子诱导分化,观察诱导后细胞的形态。结果:骨髓基质细胞在体外培养呈梭形。诱导后细胞呈神经元样细胞改变。神经元烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白染色阳性。结论:骨髓基质细胞可在体外诱导分化。     

以骨髓基质细胞为靶细胞的基因治疗在血液系统的应用

骨髓细胞主要由造血细胞及基质细胞组成。过去认为骨髓基质细胞（bone marrow stroma cells,BMSCs）由问充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）及其分化的间质细胞构成。MSCs属于多能性干细胞,具有自我更新和多向分化特性,可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、成纤维细胞。2001年Reyes等通过免疫磁珠法从骨髓单个核细胞层获得更原始、多向分化能力更强的黏附层干细胞,即：多潜能成体祖细胞（multipotent adult progenitor cell,MAPC）。MAPCs在不同的微环境条件诱导下可分化为间充质干细胞、内皮细胞、肺泡上皮细胞、肠上皮细胞、肝细胞、神经细胞甚至造血细胞,其所分化的细胞起源于内胚层、中胚层、外胚层细胞系。因此,BMSCs包含有MSCs及MAPCs。BMSCs具有很强的可塑性、可调控性,在某些信号的影响下,锚定一类组织,并分化成该组织细胞,其细胞分化类型受其所处的组织微环境的影响,而且骨髓中成熟细胞能够反向分化。此外,它易于体外培养扩增,易于多种外源基因的转染和表达,回输体内后可定位于骨髓并长期存活,且在骨髓中能很好地表达目的基因,既可充分发挥造血调控作用,又不改变自身和造血干细胞的生物学特性,故被视为多种组织细胞移植的替代来源及细胞治疗、基因治疗的理想靶细胞。结合基因工程技术,BMSCs可在体内外分泌不同蛋白,有望治愈某些蛋白质分泌不足的缺陷性疾病如遗传病,以及骨、软骨、骨髓基质系统疾病甚至某些恶性血液病。     

急性白血病骨髓基质对残留白血病形成作用的实验研究

微小残留病是缓解后白血病复发的根源 ,极大地制约了白血病的最终疗效。本研究采用Ｄｅｘｔｅｒ型骨髓培养体系形成骨髓基质细胞贴壁层 ,接种ＨＬ 6 0细胞共培养 ,用去甲氧基柔红霉素 (ＩＤＡ)处理后 ,动态观察白血病骨髓基质细胞体外生长特点 ,检测基质细胞Ｆｎ、ＶＣＡＭ 1及培养上清中ＩＬ 6、ＴＮＦ α表达水平 ,探讨急性白血病骨髓基质对残留白血病形成的作用机制。研究发现 :(1)急性白血病骨髓基质细胞生长延迟 ,贴壁时间、集落形成时间和融合时间均明显晚于正常骨髓基质组 (Ｐ<0 .0 5 ) ;ＣＦＵ Ｆ计数和ＶＣＡＭ 1表达水平均明显低…     

正常人骨髓基质祖细胞体外传代培养的实验研究

研究正常人骨髓基质祖细胞在体外传代培养过程中的功能变化,方法：采用体外液体单层和半固体培养法。结果：Ｆ１传代细胞对骨髓红系祖细胞集落形成单位和粒系祖细胞集落形成单位支持能力最显著,Ｆ２代对有核细胞粘附能力最显著。     

姜黄素抑制IFN-γ对HaCaT细胞促增殖作用的实验研究

[目的]研究姜黄素抑制IFN-γ促人角质形成细胞株HaCaT细胞增殖的机制,为临床上姜黄素治疗银屑病奠定基础.[方法]MTT(噻唑蓝)法检测不同浓度姜黄素(0、1、5、10、20、50、100 mol·L-1)和不同浓度IFN-γ(0、1、5、10、25、50、100m ol·L-1)对HaCaT细胞增殖的影响,以及姜黄素(20mol·L-1)、Notch-1特异性抑制DAPT(5 mol·L-1)对IFN-γ(50ng·mL-1)促HaCaT细胞增殖作用的抑制情况;Western blot法检测观察20 mol·L-1的姜黄素、50ng·mL--IFN-γ作用下HaCaT细胞Hes1和Notch-1的蛋白表达情况.[结果]姜黄素浓度依赖性抑制HaCaT细胞增殖,而IFN-γ浓度依赖性促进HaCaT细胞增殖;20 mol· L-1姜黄素及5 mol· L-1DAPT明显抑制50ng·mL-1IFN-γ对HaCaT细胞的促增殖作用,20 mol·L-1姜黄素有效抑制50ng·mL-1 IFN-γ对HaCaT细胞Hes1和Notch-1蛋白的促表达作用.[结论]姜黄素有效的抑制HaCaT细胞增殖,同时可明显抑制IFN-γ时HaCaT细胞促增殖作用,Notch-1信号通路在其中可能发挥重要作用.     

大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为神经细胞的研究

①目的 探讨大鼠骨髓基质细胞体外向神经细胞分化的特性。②方法 大鼠的骨髓基质细胞传代培养4代后，以成纤维细胞生长因子（bFGF）及β-巯基乙醇预诱导24小时，再以β-琉基乙醇、二甲基亚砜和3-叔丁基4-羟基茴香醚联合进行正式诱导6小时。诱导后的细胞采用免疫组化法进行鉴定。③结果 诱导后大鼠骨髓基质细胞神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达率分别为84．13％和4．27％。④结论 G-巯基乙醇、二甲基亚砜和3-叔丁基4-羟基茴香醚可以促进大鼠骨髓基质细胞向神经元和神经胶质细胞分化。     

GDNF基因修饰的骨髓基质干细胞移植治疗大鼠脑出血

目的：探讨移植胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）基因修饰的骨髓基质干细胞（BMSCs）是否比单纯BMSCs移植对脑出血有更好的保护作用。方法：采用脑立体定位方法注射肝素和胶原酶制作脑出血模型,第3d分别移植BMSCs、GDNF/BMSCs以及生理盐水,分别在1w和2w处死大鼠,免疫组织化学染色观察脑源性神经营养因子和神经生长因子β在脑出血周边区的表达。结果：各时间点GDNF/BMSCs组的BDNF和NGF-β免疫阳性产物比BMSCs与生理盐水组显著增加。结论：GDNF基因修饰的BMSCs比BMSCs对大鼠脑出血有更好的保护作用。     

白血病骨髓基质抑制化疗药物诱导的白血病细胞凋亡

目的探索骨髓基质细胞增强白血病细胞抗凋亡、抗药特性的可能机制.方法应用Percoll分离骨髓单个核细胞体外培养骨髓基质细胞模拟骨髓微环境功能,与白血病细胞株Jurkat细胞体外共培养.0.5μmol/L DNR处理Jurkat细胞诱导凋亡,应用Annexin V/PI双标法流式细胞仪检测白血病细胞凋亡率.PI染色流式细胞仪检测细胞周期分布.结果0.1～2.0μmol/L浓度范围DNR作用一定时间后,Jurkat细胞发生的凋亡率随药物浓度的增加与作用时间的延长而升高.共培养后骨髓基质细胞抑制药物诱导的白血病细胞凋亡,与单独悬浮培养组比较白血病细胞凋亡率有显著降低(8.39±4.08)%比(16.02±1.00)%,P＜0.05.白血病骨髓基质对白血病细胞的屏蔽效应强于正常骨髓基质细胞(白血病细胞凋亡率分别是(5.73±1.78)%比(8.39±4.08)%,P＜0.05.DNR处理共培养组Jurkat细胞G0/G1期比例高于悬浮培养DNR处理组,而正常与白血病骨髓基质细胞屏蔽的白血病细胞G0/G1期阻滞现象无显著性差异(47.96±5.88)%比(39.25±3.04)%,P＞0.05.结论一定浓度的DNR在体外可诱导Jurkat细胞凋亡.骨髓基质细胞抑制化疗药物诱导的白血病细胞凋亡,提示骨髓微环境在骨髓白血病细胞获得耐药、抗凋亡特性以及残留白血病形成过程中起着重要促进作用.细胞周期分布实验结果显示骨髓微环境对白血病细胞的保护作用可能部分通过阻滞白血病细胞于G0/G1期实现.实验结果提示,白血病骨髓基质细胞对白血病细胞的屏蔽效应可能存在较细胞周期阻滞更复杂的机制.     

骨髓基质细胞上清对脐血造血细胞体外增殖的作用

目的:探讨骨髓基质细胞培养上清(SN)对人脐血造血细胞体外扩增的作用.方法:使用rIL-3,rIL-1β.rIL-6和SCF等细胞因子或SN或者两者联用长期培养人脐血造血细胞,进行细胞增殖和造血祖细胞集落测定.结果:脐血造血细胞培养至2周时,细胞总数在细胞因子组增加了134.5倍和SN组增加8.15倍,两者联用增加了171.3倍.培养至第6周时,细胞增加减少,以SN组最明显,为培养前的26.65倍,细胞因子组为54.15倍,两者联用仍有92.25倍.对脐血造血祖细胞增殖的影响,在扩增2周后,CFU产率细胞因子组和SN组比扩增前增殖了250%和217%,两者联用为279%.扩增至第3周,CFU产率下降,以前两组最明显,比扩增前分别增殖151%和145%,两者联用仍增殖了240%.结论:骨髓基质细胞培养上清可促进脐血造血细胞的增殖,但比细胞因子作用弱,两者联用时作用明显强于两者分别使用,提示骨髓基质细胞还可产生其它物质刺激造血细胞增殖并延长培养时间.     

IL-2与IFN-α联合激活的白血病缓解期骨髓对白血病细胞的净化作用

目的：体外研究白细胞介素Ⅱ(IL-2)和α-干扰素(IFN-α)联合激活对白血病缓解期骨髓自然杀伤细胞(NK)和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)活性的影响，以及对白血病细胞(K562细胞)的净化作用，并观察其对正常造血的影响。方法：标准4h^51Cr释放实验测定激活的白血病缓解期骨髓的细胞毒作用；集落培养法和逆转录多聚酶链反应检测激活的白血病缓解期骨髓对K562细胞的净化作用。结果：IL-2和INF-α单用虽均能增强白血病缓解期骨髓的NK活性和诱导LAK细胞的产生，但两者联合激活的白血病缓解期骨髓的NK和LAK活性，明显优于IL-2和IFN-α的单用(P＜0．05)。在体外净化实验中两种细胞因子均能激活白血病缓解期骨髓细胞对K562细胞的净化作用，但两种联合作用最强，且bcr／abl融合基因检测为两者联合组33．33％(4／12)，Rt-pcR法，而IL-2作用次之为66．67％(8／12)，最后是IFN-α为91．67％(11／12)。两种细胞因子中以IFN-α单用对CFU-GM的抑制有一定影响(P＜0．01)，而IL-2和两者联合对激活骨髓的CFU-GM无明显影响。结论：IL-2能激活白血病缓解期骨髓的NK细胞的活性和诱导LAK细胞的产生，IFN-α能增强IL-2激活白血病缓解期骨髓对白血病细胞的净化作用。