肾移植后诱导活化高表达CD25的CD4~+ CD25~(high)调节性T细胞的表型特点与免疫调节功能

目的 探讨肾移植受者活化并表达不同强度CD25的CD4细胞的表型特征和功能特点.方法依据CD25的表达水平,应用流式细胞仪将9例行初次亲属活体肾移植受者的外周血CD4~+ T细胞分为CD25~-、CD25高表达(CD25~(high))和CD25低表达(CD25~(low))3群,并比较3群细胞叉头翼状螺旋转录因子(FoxP3)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)表达强度.经免疫磁珠法和CD4~+ CD25~+调节性T细胞分选试剂盒分选得到受者外周血CD4~+ CD25~-、CD4~+ CD25~(high) T细胞,分别作为反应细胞,以Co~(60)γ射线照射灭活的供者外周血单个核细胞(PBMC)作为刺激细胞,建立体外单向混合淋巴细胞培养系统.采用半定量RT-PCR检测系统中IL-2 mRNA的表达.结果 在肾移植术后受者3群细胞中,FoxP3的表达以CD4~+ CD25~(high)细胞最高(93.7%±3.58%),其次是CD4~+CD25~(high)细胞(16.4%±6.8%),CD4~+ CD25~-细胞最低(1.8%±1.1%),三者间差异均有统计学意义(P<0.01);CTLA-4表达以CD4~- CD25~(high)细胞最高(80.8%±7.9%),其次是CD4~- CD25~(low)细胞(22.9%±6.5%),CD4~- CD25~-细胞最低(4.1%±2.4%),三者间差异均有统计学意义(P<0.01).在混合淋巴细胞培养中,CD4~- CD25~(high)细胞受移植抗原刺激后不表达IL-2 mRNA;按照1:2比例加入CD4~- CD25~(high)细胞后,CD4~-细胞表达的IL-2 mRNA平均被抑制了60%.结论 肾移植受者所有活化T细胞的表面均有CD25表达,高表达CD25的细胞群具有调节性T细胞的表型特点,为CD4~+ CD25~(high)曲调节性T细胞.     

HLA-G~+调节性T细胞在肾移植受者外周血中的比例及其功能研究

目的 确定人类白细胞抗原-G(HLA-G)区别于CD4~+ CD25~+ FoxP3~+ 调节性T细胞的细胞表型特征,观察HLA-G~+ T细胞在混合淋巴细胞培养中的免疫调节作用及其在移植免疫调节中的活性和意义.方法采用流式细胞术检测肾移植受者外周血CD4~+ HLA-G~+ GD8~+ HLA-G~+ T淋巴细胞的含量,分选HLA-G~+ T淋巴细胞,分析细胞表型,采用RT-PCR检测调节性T细胞的特异性标志FoxP3在HLA-G~+ T淋巴细胞的表达情况,以淋巴细胞分离液分离的PBMC、CD4~+ CD25~(high)、CD4~+ CD25~-细胞作为对照.取5对活体肾移植供受者的淋巴细胞进行混合培养,分别加入流式细胞术分选纯化后的HLA-G~+ 、HLA-G~- T淋巴细胞,对照组只加入供、受者淋巴细胞,MTT法观察细胞增殖和抑制情况.结果 肾移植受者外周血CD4~+ HLA-G~+ 、CD8~+HLA-G~+ T淋巴细胞表达率分别为1.95%±0.34%、3.13%±0.56%.流式细胞术分选HLA-G~+ T淋巴细胞后纯度可达55.0%～75.1%.RT-PCR 结果证明上述细胞CD25、FoxP3均为阴性表达.与HLA-G~- 组、对照组比较,混合淋巴培养3d后HLA-G~+ 组细胞增殖率明显受到抑制(P<0.05).结论 在肾移植受者外周血中存在CD4~+ HLA-G~+ 、CD8~+HLA-G~+ T淋巴细胞,这类细胞不同于CD4~+ CD25~+ FoxP3~+调节性T细胞,它们不表达CD25和FoxP3而表达免疫耐受分子HLA-G,在混合淋巴培养体系中,能显著抑制反应性细胞增殖,具有免疫调节功能.     

进行期寻常型银屑病患者外周血CD4＋CD25＋调节性T细胞分析

目的 检测进行期寻常型银屑病患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)的水平. 方法 选择进行期寻常型银屑病住院患者56例和健康者16例,取外周抗凝全血,采用流式细胞术方法,检测外周血CD4+CD25+ Treg的水平,并统计和分析其特点和意义. 结果进行期寻常型银屑病患者外周血CD4+CD25+ Treg占CD4+淋巴细胞的比例为(2.65±0.73)%,健康对照组为(6.11±0.93)%.两组比较差异有统计学意义(P﹤0.001). 结论 CD4+CD25+ Treg水平降低可能与寻常型银屑病免疫学发病机制有关.     

Nrp1~+T细胞对淋巴细胞增殖的调节作用以及对同种异体移植物的影响

目的 探讨表达神经纤毛蛋白质1(Nrp1)的T细胞(Nrp~+ T细胞)对体内外反应性淋巴细胞增殖的调节作用以及对同种异体移植物的影响.方法采用流式细胞术分选近交系C57BL/6j小鼠脾脏中的Nrp1~+ T细胞作为调节细胞,在刀豆蛋白A(Co-hA)的刺激下与标记了羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)的C57BL/6j小鼠脾脏单个核细胞等比例共培养5d,对比观察反应细胞的增殖情况.采用流式细胞术分选C57BL/6j小鼠脾脏的Nrp1~+T细胞、CD4~+ CD25~+ Treg细胞和CD4~+ CD25~- T细胞各1×10~6个,分别经尾静脉注入到以Balb/C小鼠作为供者,以C57BL/6j小鼠作为受者行皮肤移植的小鼠体内,另外建立供、受体均为C57BL/6j小鼠的同品系对照组(注入等体积的RPMI 1640培养基).对比观察各组移植皮肤的存活情况.结果 加入Nrp1~+ T细胞的实验组增殖指数为50.92%±2.30%,明显低于未加入调节性T细胞的对照组(90.31%±1.83%,P=0.0169).实验组移植皮肤存活时间注入Nrp1~+ T细胞者为20.66±1.1ld,注入Nrp1~- T细胞者为13.20±0.76d,注入CD4~+ CD25~+ Treg者为17.67±1.0d,均明显高于对照组(9.70±1.23d,P<0.01).结论 Nrp1作为一种新型的T细胞表面分子,在淋巴细胞增殖体系中起着重要作用;与注入CD4~+ CD25~+ Treg相比,注入Nrp1~+ T细胞可明显延长小鼠移植皮肤的存活时间.     

肝移植急性排异患者外周血Th17及调节性T细胞的特征及意义

目的 探讨肝移植术后急性排异患者外周血中Th17细胞、CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)的变化特征及临床意义.方法 2011年1-9月解放军302医院肝移植研究中心收治的肝移植术后患者25例,根据移植组织穿刺活检病理结果分为急性排异组(排异组,12例)和非排斥稳定组(稳定组,13例),另选取13名健康体检者作为对照.采用流式细胞分析法检测外周血中Th17、Treg细胞占CD4+T细胞的比例,观察Th17/Treg比值变化及其与肝脏损伤的关系.结果移植术后排异组外周血中Th17占CD4+T细胞的比例(3.50％±0.86％)明显高于稳定组(2.10％±0.52％)和对照组(1.79％±0.42％,P＜0.01),稳定组和对照组比较无统计学差异(P＞0.05).排异组和稳定组患者外周血中Treg占CD4+T细胞的比例(分别为0.90％±0.25％、1.51％±0.23％)明显低于对照组(2.57％±0.79％,P＜0.01),且排异组明显低于稳定组(P＜0.05).排异组Th17/Treg比值(4.20±1.69)明显高于稳定组(1.43±0.47)及对照组(0.75±0.28,P＜0.01),且稳定组明显高于对照组(P＜0.01).Th17/Treg比值与丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酸转氨酶(GGT)水平呈正相关(分别为r=0.5023,P=0.0105; r=0.4561,P=0.0219;r=0.4393,P=0.0280; r=0.5516,P=0.0043).结论 肝移植术后急性排异反应患者外周血中存在Th17/Treg失衡,且与肝脏损伤有一定关系.Th17/Treg失衡可能参与了肝移植术后急性排异反应的发生发展过程.     

CD4+CD25+CD127-调节性T细胞在Graves病中的变化及临床意义

目的 通过观察Graves病患者外周血中CD4+CD25+CD127-调节性T细胞(Treg)数量的变化,探讨Graves病发生的免疫学机制.方法 采用流式细胞术检测90例Graves病患者和50名正常人外周血中CD4+CD25+CD127-Treg的比例,同时测定甲状腺功能指标及甲状腺自身抗体水平.采用t检验进行组间比较,采用线性相关分析法分析CD4+CD25+CD127-Treg与甲状腺功能指标的关系.结果 90例Graves病患者与50名正常人外周血中CD4+CD25+CD127-Treg的比例分别为1.39％±1.09％和4.59％±1.14％,两者间差异有统计学意义(t=16.4,P＜0.01).CD4+CD25+CD127-Treg数量与促甲状腺激素受体抗体水平呈负相关(r=-0.24,P＜0.05),与总三碘甲状腺原氨酸、总甲状腺素、游离三碘甲状腺原氨酸、游离甲状腺素、甲状腺球蛋白抗体、甲状腺微粒体抗体水平呈负相关(r=-0.62、-0.65、-0.56、-0.71、-0.50、-0.15,P均＜0.01).结论 Graves病患者CD4+CD25+CD127-Treg 数量减少,且CD4+CD25+CD127-Treg数量与甲状腺功能指标及甲状腺自身抗体水平关系密切,提示CD4+CD25+CD127-Treg数量减少可能与Graves病的发病有关.CD4+CD25+CD127-可能是人CD4+T 细胞中Treg的特异性标志物.     

严重多发伤患者外周血CD4+CD25high调节性T细胞的变化及意义

目的 观察严重多发伤患者外周血CD4+CD25high调节性T细胞(Treg细胞)的变化及意义.方法 40例严重多发伤患者于伤后1,3,5,8 d流式细胞仪检测各组患者外周血CD4+CD25high调节性T细胞的比率的变化,ELASA法检测血清中IL-10、干扰素-γ(IFN-γ)浓度,并与健康组进行对比.结果 CD4+细胞在伤后1～8 d均明显低于健康组(P＜0.01),CD8+细胞在伤后5～8 d明显高于健康组(P＜0.05或P＜0.01).严重多发伤患者伤后5 d外周血中CD4+CD25highTreg细胞比率开始升高,与伤后1,3 d比较,差异有统计学意义(P＜0.01);伤后8 d仍持续升高,与伤后5 d比较,差异有统计学意义(P＜0.05).患者外周血IFN-γ浓度持续下降,而患者外周血IL-10浓度则持续上升.结论 Treg细胞比率在严重多发性创伤后明显升高,更重要的是,其在减少Th1类细胞因子分泌及抑制创伤免疫等方面发挥了重要的作用.     

调节性T细胞与器官移植免疫耐受的研究进展

CD4、CD25和叉头翼状螺旋转录因子(FoxP3)阳性(CD4~+ CD25~+FoxP3~+)的调节性T细胞(Treg)是具有免疫调节功能的T细胞亚群,在移植后诱导和维持免疫耐受方面发挥重要作用.在移植物发生排斥反应时,CD4~+ CD25~+ FoxP3~+ Treg的数量增加.因此可将其用于预测移植物的转归及判断移植受者的免疫状态.联合监测效应性T细胞(Teff)与Treg间的平衡有助于更好地判断移植受者的免疫状态.由于不同免疫抑制剂对CD4~+ CD25~+ FoxP3~+ Treg的影响不同,所以免疫抑制剂对诱导移植免疫耐受的潜在作用应引起重视.     

放射损伤对鼻咽癌外周血CD4+CD25high调节性T细胞的影响

目的通过分析放疗前后鼻咽癌(NPC)患者外周血CD4+CD25high调节T(Tr)细胞比例及其变化规律.初步探讨NPC患者免疫抑制机制和放疗对免疫抑制的影响,为有效提高NPC的治疗疗效提供参考.方法采用流式细胞术检测36例初治的鼻咽癌患者放疗前、放疗后和30例正常健康者(对照组)外周血中T细胞亚群及CD4+CD25high T细胞比例.结果放疗前鼻咽癌患者CD3+、CD4+、CD8+T细胞比例及CD4/CD8比值接近正常对照组(P＞0.05);而CD4+CD25high Tr细胞比例明显高于正常对照组[分别为(2.76±1.06)%,(2.06±0.98)%,P＜0.05];放疗结束时,与放疗前比较,外周血CD4+T细胞比例减低、但差异无统计学意义(P＞0.05);CD4+/CD8+比值减低(P＜0.05),而CD4+CD25high Tr细胞比例明显升高,差异有统计学意义[(4.88±1.02)%,P＜0.05].结论CD4+CD25high Tr细胞可能是鼻咽癌患者免疫抑制的重要原因之一,与鼻咽癌免疫逃逸有关.放疗后外周血CD4+CD25high Tr细胞比例比CD4+/CD8+比值更能敏感反映免疫功能状态,有可能成为鼻咽癌的更有效的免疫监测指标.     

动脉栓塞联合CIK细胞对中晚期肾癌患者免疫功能的影响

目的 分析肾动脉栓塞(transcatheter renal arterial embolization,TRAE)联合细胞因子诱导的杀伤细胞(cy-tokihe-induced killer cell,CIK cell)过继免疫治疗对中晚期肾癌患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory Tcell,Treg)细胞比例、细胞免疫功能的影响及临床意义.资料与方法 65例中晚期肾癌患者(均为TBAE术后,经影像学检查显示无远处转移),以入院先后顺序随机分为两组:TRAE联合CIK治疗30例为研究组,单纯TRAE治疗35例为对照组,研究组患者在TRAE术后1周静脉补充CIK细胞治疗.分别于治疗前1周、治疗后3个月取外周血,流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群及NK细胞比例变化;术后采用增强CT、MRI或PET-CT评价肿瘤坏死程度.结果 研究组与对照组客观有效率相比,差异无统计学意义(P>0.05).研究组Treg细胞比例由(5.75±1.85)%下降至(4.55±1.76)%,二者差异具有统计学意义(P<0.01);CD3+、CD4+、NK细胞比例及CD4+/CD8+分别由(52.24 ±12.56)%、(46.33 ±16.26)%、(17.72±6.89)%、1.25±0.66上升至(62.22±10.58)%(P<0.01)、(53.00±14.17)%(P<0.05)、(21.59±8.08)%(P<0.01)、1.57±0.70(P<0.01),CD8+由(43.95±13.78)%下降至(38.23±10.74)%(P<0.05).对照组治疗前后Treg细胞比例及CD8+比例略有下降,CD3+、CD4+、NK细胞比例及CD4+/CD8+略有增加,但差异无统计学意义(P>0.05).研究组中位生存期为18个月,明显高于对照组的12个月.二者差异具有统计学意义(P<0.05).相关性分析显示:治疗后Treg细胞比例下降程度与生存期呈正相关关系(P<0.01).结论 TRAE联合CIK细胞过继性免疫治疗中晚期肾癌能改善患者细胞免疫抑制状态,提高机体的抗肿瘤免疫效应,延长患者生存期.     

供体抗原特异性Treg细胞体外分选与鉴定

目的 构建大鼠肾移植受体源性CD4＋CD25＋Treg细胞体外分选、鉴定及供体抗原特异性诱导体系.方法 大鼠同种异体肾移植受体脾细胞同供肾组织体外混合培养以诱导供体抗原特异性表型 分选受体CD4＋CD25＋T细胞,鉴定CD4＋CD25＋ Treg细胞纯度 等量诱导后的Treg细胞加入供、受体大鼠脾细胞混合体系（测定组1）和第三系大鼠同受体大鼠脾细胞混合体系（测定组2）.以受体大鼠脾细胞悬液为阴性对照组,以供、受体大鼠脾细胞混合体系为阳性对照组,检测各组吸光度OD值,观察Treg细胞对两个测定组的抑制效率（IR）.结果 CD4＋CD25＋细胞的得率为4.13%,分离纯度为73.34%,CD4＋CD25＋ Treg细胞纯度为91.37%.测定组1、2的IR分别为85.4%及21.9% ,两者间有显著性差异（P〈0.05）.结论 体外分选获得高纯度受体源性Treg细胞,并成功诱导获得供体抗原的特异性表型,可满足细胞功能学及在体实验研究.     

固相酶联免疫斑点技术检测递增负荷过度训练大鼠细胞免疫机能变化研究

目的:建立大鼠脾脏淋巴细胞中Th1/Th2型淋巴细胞亚群表达的固相酶联免疫斑点(ELISPOT)技术检测方案,进一步比较Th1/Th2淋巴细胞和CD4+/CD8+在大鼠递增负荷过度训练过程中的改变,为筛选最佳免疫学评价指标提供参考。方法:雌性SD大鼠进行9周递增负荷跑台训练,分别在训练的第1周、第3周、第9周训练结束后的36小时,以及恢复1周后处死大鼠。采用不同种类刺激剂、不同刺激剂浓度刺激不同数量大鼠脾脏淋巴细胞,建立最佳ELISPOT检测方案。检测大鼠血红蛋白、睾酮、皮质酮,评估疲劳模型的建立,并对Th1/Th2型淋巴细胞亚群以及传统免疫学指标CD4+/CD8+进行动态观察。结果:建立最佳ELISPOT技术检测方案:PMA和Ionomycin联合刺激。刺激物浓度:检测γ干扰素(IFN-γ)时PMA浓度为2.5ng/ml,检测白细胞介素4(IL-4)时PMA浓度为10ng/ml;检测IFN-γ时Ionomycin浓度为0.05μg/ml,检测IL-4时Ionomycin浓度为0.2μg/ml。细胞浓度:3×104cells/孔(IFN-γ),60×104cells/孔(IL-4)。运动后36小时,运动组血红蛋白、睾酮、皮质酮均较对照组显著下降;经1周恢复后,和对照组相比无显著性差异。递增负荷运动第1周跑台训练后,运动组Th1型细胞因子IFN-γ与对照组相比显著升高;第3周跑台训练后,运动组和对照组相比显著下降;恢复1周后,运动组IFN-γ与对照组相比显著下降。递增负荷训练结束后的恢复期,运动组Th2型细胞因子IL-4较对照组升高了1.44倍(P<0.01)。CD4+/CD8+在整个训练期及恢复期均无显著性变化。结论:递增负荷过度训练过程中,与CD4+/CD8+相比,采用ELISPOT技术检测SD大鼠Th1/Th2淋巴细胞亚群的改变具有较高的灵敏性。     

受者同系骨髓间充质干细胞对心脏移植大鼠的免疫调节作用

目的 观察静脉注射受者同系骨髓间充质干细胞(MSC)对大鼠心脏移植免疫反应的影响.方法 以20只成年雄性Lewis大鼠作为心脏供体,20只成年雄性Wistar大鼠作为受体,将其随机分为2组,每组10只,行颈部心脏移植:对照组(A组)手术后24h,经尾静脉注射3ml 0.9％氯化钠注射液;MSC处理组(B组)手术后24h,经尾静脉注射2×106个MSC(悬浮于3ml 0.9％氯化钠注射液中).术后1周,每组随机取受体大鼠4只,检测静脉血及移植物CD4+、CD8+、CD4+CD25high、CD4+CD25highfoxp3+T细胞占总淋巴细胞的比例,计算CD4+/CD8+比值.其余6只大鼠用于继续观察移植物存活时间.结果 A组大鼠移植心脏存活7.2±1.3d,B组大鼠移植心脏存活14.8±2.9d,两组间差异有统计学意义(P＜0.01).B组静脉血中CD4+/CD8+值、CD4+CD25highT细胞占总淋巴细胞的比例、CD4+CD25highFoxp3+T细胞占总淋巴细胞的比例(分别为1.18±0.07、2.51％±0.56％、2.05％±0.62％)均明显高于A组(分别为0.49±0.05、0.96％±0.19％、0.82％±0.09％),差异有统计学意义(P＜0.01).移植心脏中CD4+/CD8+值在两组间无统计学差异(P＞0.05);B组移植心脏中CD4+CD25highT细胞及CD4+CD25highFoxp3+T细胞占总淋巴细胞的比例(分别为2.74％±0.28％、2.54％±0.31％)均明显高于A组(分别为0.61％±0.06％、0.53％±0.06％),差异有统计学意义(P＜0.01).结论 静脉注射受者同系骨髓MSC可诱导大鼠心脏移植免疫耐受,延长移植心脏的存活时间.     

~(99)Tc~m-NOET门控心肌灌注SPECT评价冠心病的价值

目的 评价~(99)Tc~m-双(N-乙氧基,N-乙基-二硫代氨基甲酸酯)氮化锝(~(99)Tc~m-NOET)静息门控断层心肌灌注显像对冠心病患者的诊断价值.方法 疑诊为冠心病的45例患者注射925 MBq~(99)Tc~m-NOET后1h用SPECT行静息门控心肌灌注显像,获得舒张未期容积(EDV)、收缩未期容积(ESV)、左室射血分数(LVEF)等心功能参数和舒张末期容积灌注、局部射血分数、局部室壁活动和室壁增厚度4个靶心图.所有患者在1周内行冠状动脉造影,将冠状动脉狭窄≥50%定为病变血管.根据冠状动脉造影结果将其分为心肌梗死组、心肌缺血组和对照组三组.结果 ~(99)Tc~m-NOET静息门控SPECT诊断冠心病的灵敏度和特异度分别为68.42%和83.33%.心肌梗死组的心功能参数[EDV=(129.32±9.14)ml,ESV=(80.97±9.49)ml,LVEF=(40.15±3.28)%]与对照组[EDV=(80.91±3.12)ml,ESV=(30.12±1.79)ml,LVEF=(63.51±1.04)%]相比,统计学差异有显著性(EDV:F=22.103,ESV:F=32.277,LVEF:F=42.604,均为P＜0.01),心肌缺血组的心功能参数[(EDV=(70.83±3.46)ml,ESV=(25.13±2.85)ml,LVEF=(65.55±2.62)%]与对照组相比,统计学差异无显著性意义.心肌梗死组左室心肌共分为460个节段,其中209个节段局部灌注、局部射血分数、局部室壁活动和室壁增厚度4个靶心图均异常.局部灌注异常的节段共328个节段.伴有局部射血分数、局部室壁活动和室壁增厚度异常分别有250个、240个和276个节段.局部灌注异常的节段与局部射血分数、局部室壁活动和室壁增厚度异常的节段不完全匹配.结论 ~(99)Tc~m-NOET静息门控心肌灌注显像对冠心病的诊断有较大临床应用价值,所获得的整体心室功能参数在心肌梗死的评价中有优越性,但对心肌缺血的诊断价值不大.心肌梗死中存在有不少的局部灌注与心肌室壁功能异常节段的不匹配,对心肌存活的评价有帮助.