RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究

目的 以乙型肝炎病毒(HBV)核心区为靶位，构建表达小干扰RNA(siRNA)的质粒载体pSilencer3．1-Hlhygro，体外观察siRNA抗HBV的效果。方法 以HepG2 2．2．15细胞为靶细胞，利用脂质体Metafectene与表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-Hlhygro共转染，用定量聚合酶链反应检测细胞上清液中DNA，用逆转录聚合酶链反应检测HBV C-mRNA。结果 成功构建了表达siRNA的转录质粒载体，两条siRNA均可抑制HBV的复制，而且与siRNA浓度成正相关。结论 靶向HBV核心区的siRNA能抑制HBV的复制。     

长片段RNA抑制HepG2.2.15细胞中HBV基因的表达和复制

目的 评估长的反义RNA干扰片段在培养细胞株中对HBV复制的抑制效应.方法将HBV基因组S区的全部核苷酸序列插入至pTARGETTM载体中,并将重组载体转染入HepG2.2.15细胞中.用酶联免疫吸附法检测HBsAg与HBeAg水平,用荧光定量PCR法检测HBVDNA水平.对数据采用多个独立样本Kruskal-Wallis检验与两两比较的Mann-Whitney U检验.结果 经过处理后,HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg表达量(A值)在HBS2组(携带长片段反义RNA)为0.621±0.027,在HBS4组(携带正义RNA)为3.399±0.018,对照组为2.232±0.187;HBeAg表达量(A值)在HBS2组、HBS4组和对照组分别为0.749±0.019、1.548±0.025和1.570±0.044; HBV DNA水平(×104拷贝/ml)在HBS2组、HBS4组、对照组分别为1.597±0.082、3.381±0.297和3.610±0.063.与对照组相比,HBS2组HBsAg、HBeAg和HBV DNA表达量均降低,统计量Z值均为-2.309,P值均＜0.05; HBS4组HBsAg表达量增高(Z=-2.309,P＜0.05),而HBeAg和HBV DNA表达量无明显差异,统计量Z值分别为-0.866、-1.155,P值均＞0.05.结论 长片段反义RNA能抑制HBV基因的表达和病毒复制.

Abstract：

Objective To evaluate the inhibitory effects of long antisense RNA on HBV replication in HepG2.2.15 cells. Methods The coding region of HBV S gene was cloned into pTARGET vector in sense and antisense orientations and the recombinant plasmids were transfected into HepG2.2.15 cells which were divided into HBS2 (antisense RNA) group, HBS4 (sense RNA) group and control group. HBsAg and HBeAg in the culture supernant were detected by ELISA. The HBV DNA in the supernant was quantified by real-time PCR. Results After treatment, the levels of HBsAg in HepG2.2.15 cell supernatants of three groups were 0.621 ± 0.027, 3.399 ± 0.018 and 2.232 ± 0.187 respectively; the levels of HBeAg were 0.749 ± 0.019,1.548 ± 0.025 and 1.570 ± 0.044 respectively and the levels of HBV DNA were 1.597 ± 0.082, 3.381 ± 0.297 and 3.610 ± 0.063 respectively. The expressions of HBsAg and HBeAg and the HBV DNA level in HBS2 group were remarkably reduced as compared to the control (Z = -2.309, P ＜ 0.05); whereas the sense plasmid transfection (HBS4) did not affect HBeAg (Z= -0.866) and HBV DNA (Z = -1.155) levels in the culture supernant but slightly increased the HBsAg level (Z = -2.309). Conclusion Antisense RNA might be a useful tool to repress HBV replication.     

表达HBsAg特异性siRNA的重组腺相关病毒载体的构建

目的构建表达针对HBsAg小发卡RNA(shRNA)的重组腺相关病毒载体,以观察该病毒在体外对HBsAg和HBeAg的抑制作用。方法将表达针对HBsAg的shRNA定向克隆到pAAV/U6-hrGFP质粒中,获得重组表达质粒(pAAV-shHBs-hrGFP);采用磷酸钙转染法将该质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper共同转染AAV293细胞,进行rAAV-shHBs-hrGFP重组病毒包装。收获病毒感染HepG2.215细胞;采用ELISA法检测HBsAg和HBeAg水平。结果酶切鉴定、测序结果表明,pAAV-shHBs-hrGFP载体成功构建。包装收获的rAAV-shHBs-hrGFP病毒液可以感染HepG2.215细胞,并且可以抑制HBsAg和HBeAg的表达。结论制备的rAAV-shHBs-hrGFP病毒载体能够抑制HBV在体外的抗原表达。     

针对HBV—P基因的RNA干扰抑制乙型肝炎病毒的研究

目的构建针对乙型肝炎病毒P基因编码区、能在体内转录产生发夹状小干扰RNA（siRNA）的表达载体psiHBV／p,观察RNA干扰对HBsAg、HBeAg及乙型肝炎病毒DNA复制的抑制作用。方法针对HBV—P基因区特异序列,构建siRNA的表达载体psiHBV／p。采用脂质体介导方法将其与1．3倍HBV真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞。分别于转染后24小时、48小时、72小时用ELISA法对HepG2细胞培养上清液进行HBsAg、HBeAg的检测;于转染后72小时通过FQ-PCR法分析RNA干扰作用对HBVDNA的抑制效果。结果成功构建了针对HBV—P基因区的siRNA的真核表达重组体psiHBV／p,并发现它能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌,转染后第二天抑制率达高峰,分别为84％、65％。FQ—PCR结果也证实了转染72小时后,随psiHBV／p比例的升高,其对HBV DNA的抑制作用也随之增加。结论成功构建的psiHBV／p,它能在体内持续转录产生针对P基因转录体的发夹状siRNA;在细胞水平上,体内转录产生的、针对乙型肝炎病毒P基因区特异序列的siRNA对共转染的重组载体pHBV1．3有显著和特异的抑制作用。     

1.3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的 构建1.3倍全基因乙型肝炎病毒(HBV)真核细胞表达载体,观察其在HepG2细胞中的表达。方法 从pGEM—HBV载体上将约4.1kb的1.3倍HBV全基因克隆至真核表达载体pCDNA3.1的Hind Ⅲ位点,将构建的pHBV经Lipofectamine2000导入肝癌细胞系HepG2细胞中。分别在转染后24、48、72h测定HepG2上清液乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)的表达,细胞内HBsAg、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)免疫组织化学染色,Southern、northern杂交鉴定HBV的复制与表达。结果成功构建了1.3倍HBV全基因真核表达载体,转染后24、48、72h细胞上清液中HBsAg分别为5.36±0.25,13.42±1.24,7.52±0.43;HBeAg分别为9.16±0.32,22.75±1.49,15.96±1.03。免疫荧光结果显示转染后24 h细胞内HBsAg表达最强,主要呈胞浆内弥漫性分布,HBcAg为核浆型分布,以浆型为主。Southern、northern杂交均证实细胞内存在各种病毒复制中间体和特异的病毒复制转录物。结论 该表达载体可介导高水平病毒复制,其转染细胞可望成为一种新型的HBV 体外感染模型。     

地塞米松、环磷酰胺和他克莫司三种免疫抑制剂影响HBV复制的体外研究

目的探讨地塞米松(DEX)、环磷酰胺(CYP)和他克莫司(FK506)在体外对HBV蛋白合成、DNA复制的影响。方法将不同浓度的DEX、CYP和FK506作用于HepG2.2.15细胞系,通过MTT实验确定药物安全浓度范围,通过检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg水平,以及细胞内HBV DNA水平来评价HBV的表达和复制情况。结果DEX、CYP和FK506的药物安全浓度范围分别为0~500、0~1000和0~10μg/mL。与培养基对照处理相比,FK506处理后HBsAg、HBeAg分泌及HBV DNA复制变化差异无统计学意义;CYP处理增加HBsAg分泌,与对照相比差异有统计学意义(P0.05);但HBeAg分泌及HBV DNA复制变化差异无统计学意义;DEX作用减少HBsAg和HBeAg的分泌,与对照相比差异有统计学意义(P0.05);但是细胞内HBV DNA复制水平差异无统计学意义(P0.05)。结论在药物安全浓度范围内,FK506对HepG2.2.15细胞HBV DNA复制无直接抑制或促进作用。CYP处理后增加HepG2.2.15细胞HBsAg表达,但HBeAg表达及HBV DNA复制变化差异无促进作用;DEX处理抑制HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达,但对HBV DNA复制无抑制作用。     

RNA干扰对乙型肝炎病毒复制的体外影响

目的:通过一种能够在细胞内表达短发卡RNA的逆转录病毒载体来研究RNA干扰对乙型肝炎病毒复制的影响.方法:首先针对HBV基因组Pol基因RT区寻找RNAi的靶位,并设计相对应的寡核苷酸链.然后再将一对碱基配对寡核苷酸链退火后连接入载体形成重组的质粒,并进行鉴定.在Huh-7细胞中,将通过鉴定的干扰质粒与HBV复制型质粒pHBV3.8共转染,分别应用ELISA方法来检测HBV相关的抗原,应用Northern印迹检测HBV RNA,以及应用实时荧光定量PCR和Southern印迹检测HBV核心颗粒DNA.结果:研究通过计算机方法协助寻找了3条RNAi靶位,并且构建了相应的基于逆转录病毒载体的RNA干扰质粒154i、312i和734i.结果发现312i对pHBV3.8表达有明显的抑制,HBsAg和HBeAg分别为阴性对照组的39%和41%,差异均有显著性(P=0.001,P=0.000).定量荧光PCR结果显示312i组核心颗粒DNA水平显著低于阴性对照组(21.3%±1.1%vs 100.0%±10.6%,P=0.0046).Southern blot和Northern blot结果均显示,312i组病毒复制及mRNA转录水平最低(10.5%,12.0%).结论:在HBV基因组RT区找到了一个可用于RNAi的靶位,并且构建了相对应的干扰质粒,此质粒可成功地抑制HBV复制型质粒在细胞中的复制和表达.     

乙型肝炎病毒X蛋白及其截短体与损伤DNA结合蛋白1在HBV复制中的作用

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)及其两个截短体(HBx1 ～ 101、HBx43～ 154)与损伤DNA结合蛋白(DDB)1在HBV复制中的作用.方法 用质粒瞬时转染HepG2细胞,72 h后分别提取细胞总蛋白质和总RNA,通过Western blot分析验证DDB1蛋白表达,逆转录实时定量PCR在基因的mRNA水平观察HBx蛋白及其截短体对DDB1蛋白表达的影响.提取转染72 h后细胞胞质DNA,收集细胞的培养上清液,通过实时定量PCR及酶联免疫吸附试验检测各组细胞胞质HBV DNA复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平,从而观察HBx蛋白及其两个截短体与DDB1对HBV复制的影响.对数据进行单因素方差分析及t检验.结果 在有HBV复制的HepG2细胞中,缺失HBx转染组细胞中DDB1蛋白在mRNA水平明显下降(相对表达水平为野生型转染组的52.74％±8.95％,t=9.143,P＜0.05),胞质DNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平也明显下降(相对表达水平分别为野生型转染组的55.49％±1.19％、48.05％±2.90％、46.22％±2.20％,P值均＜0.05).共转染HBx N-端截短体HBx43～54后细胞中DDB1蛋白mRNA水平恢复到野生型水平,且能使缺失HBx蛋白的HepG2细胞中胞质HBV DNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg的表达恢复到野生型水平.但共转染HBx C-端截短体HBx1 ～ 101的细胞中DDB1蛋白在mRNA水平较野生组明显下降(相对表达水平为野生型转染组的59.95％±9.09％,t=7.629,P＜0.05),且不能使转染缺失HBx蛋白的HepG2细胞中胞质HBVDNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg的表达恢复到野生型水平(相对表达水平分别为野生型转染组的62.53％±0.67％、63.13％±2.14％、55.40％±0.99％,P值均＜0.05).并且各转染组DDB1蛋白mRNA水平变化与胞质HBV DNA复制和培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平是一致的.结论 C-端53个氨基酸及DDB1蛋白对于HBV野生型水平的复制是需要的,而N-端42个氨基酸对于HBV复制水平无明显影响.C-端53个氨基酸对HBV复制的影响作用可能是通过影响DDB1蛋白水平实现的.     

APOBEC3F剪接亚型与全长APOBEC3F、APOBEC3G对乙肝病毒作用的比较

目的比较APOBEC3F剪接亚型3F79与完整APOBEC3F以及APOBEC3G对HepG2.2.15细胞中HBV DNA复制及HBsAg、HBeAg抗原分泌的影响。方法用PCR合成法扩增人APOBEC3F剪接亚型3F79,构建真核表达载体pEGFPC1-3F79和原核表达质粒pET28a-3F79,将pEGFPC1-3F79与含有全长APOBEC3F和APOBEC3G的质粒Pflag-APOBEC3F、PC-APOBEC3G-HA转染入HepG2.2.15中,检测转染后细胞上清中HBV DNA以及HBsAg和HBeAg的水平。结果构建的重组载体经酶切和PCR鉴定,表明3F79基因正确地插入。将pEGFPC1-3F79与Pflag-APOBEC3F、PC-APOBEC3G-HA转染HepG2.2.15细胞后,pEGFPC1-3F79对细胞中HBV的复制及HBsAg和HBeAg的分泌无明显的抑制作用(P0.05),而转染含有完整APOBEC3F和APOBEC3G质粒的HepG2.2.15细胞与对照组相比,HBsAg、HBeAg、HBV DNA含量明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。结论 3F79不能像完整APOBEC3F和APOBEC3G一样抑制HepG2.2.15细胞中HBV DNA复制以及抗原的分泌。     

靶向HBX基因小干扰RNA抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究

目的探讨HBX特异性RNA小干扰抑制乙型肝炎病毒复制的作用。方法用脂质体转染法将干扰质粒pSilencer3.1-shHBX和通用阴性对照质粒分别转染HepG2.2.15细胞,并设立未转染的空白对照组。分别于转染后24、487、2 h收集细胞培养上清液和细胞总蛋白,Western blot检测HBx蛋白表达情况,ELISA检测3组细胞上清中HBsAg和HBeAg表达情况。结果 Western blot检测显示,干扰质粒转染组HBx蛋白表达量逐渐降低,各时间点的表达量与空白对照组和通用阴性对照组比较差异均有统计学意义(P0.01);ELISA检测显示,各时间点干扰质粒转染组细胞培养液上清中HBsAg和HBeAg的表达均下调,表达量与空白对照组和通用阴性对照组比较差异均具有统计学意义(P0.01)。结论 HBX特异性小干扰RNA可抑制HBV复制,为siRNA作为抗乙肝病毒感染制剂提供了实验依据。     

重型病毒性肝炎患者病原学及预后的研究

对９４例重型病毒性肝炎进行了病毒标志的研究，并分析了几种影响重型肝炎预后的因素。结果发现：单纯ＨＢｖ感染４２例（４４．７％）；混合感染共５０例（５３．２％），其中ＨＢＶ与ＨＣＶｌ９例（２０．２％）．ＨＢＶ与ＮＤＶ１３例（１３．８％），ＨＢＶ与ＨＣＶ、ＨＤＶＩ０例（１０．６％）ＨＡＶ与ＫＢＶ３例（３．２％），ＨＡＶ与ＨＢＵ、ＨＣＶ３例（３．２％）ＨＡＶ与ＨＢｖ、ＨＤＶＩ例（１．１％）．ＮＡＶ与ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ１例（１．１％）；病毒标志均阴性者２例（２．１％）。ＨＢＶ、ＨＣＶ和ＨＤＶ混合感染者病情重，病死率高。血清总胆红素越高，凝血酶原活性越低，其病死率越高；有并发症者的预后差，而ＡＭＰ升高者的预后较好；重肝的预后可能与年龄、性别无关。     

Seroprevalence of Hepatitis Viruses B, C, D and HIV Infection Among Hemodialysis Patients in Kerman Province, South-East Iran

Background

The prevalence of hepatitis viruses in hemodialysis patients has been reported to be much greater than in the general population. Attention to local data, effectively guides health planners so that they can control infections and prevent nosocomial transmissions.

Objectives

This cross sectional study was carried out to determine the prevalence of hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV), and hepatitis D (HDV) viruses, as well as the human immunodeficiency virus (HIV) in dialysis centers in the Kerman Province, in the southeast of Iran.

Patients and Methods

All hemodialysis patients (n = 228) in 7 centers were enrolled in the study. Hepatitis B surface antigens (HBsAg), HCV antibodies (Ab), HDV Ab and HIV Ab were measured using specific enzyme linked immunoassay kits (ULTRA kit, bioMérieux, France) and confirmed by a qualitative PCR assay.

Results

The studied group was comprised of 92 (40.4%) females and 136 (59.6%) males. The mean age of the patients was 51 ± 9.5 years and the duration of hemodialysis was 39.7 ± 7.9 months. Positive HBsAg was found in 7% of cases, HCV Ab in 7%, and patients with both viruses were detected in 1.7% cases. HIV Ab and HDV Ab were negative in all cases. Out of the other risk factors, frequency of blood transfusions was significantly correlated with positive HCV Ab (P < 0.008).

Conclusions

Prevalence of HBV and HCV in hemodialysis patients was moderate to low in the Kerman Province, as in other parts of the country. Strict adherence to protective measures could lead to even lower rates.     

TTV单独及重叠HBV感染的临床研究

目的：了解输血传播病毒（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｔｉａｎｓｍｉｔｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ，ＴＴＶ）单独及重叠乙肝病毒（ＨＢＶ）感染的临床特征，探讨其致病性。方法：用套式聚合酶链反应检测血清中ＴＴＶ ＤＮＡ，用ＥＬＩＳＡ法和／或ＰＣＲ法对其他肝炎病毒标志物进行血清学检测。结果：肝病患者ＴＴＶ ＤＮＡ总的阳性率为２１．９％（１０７／４８９）。从临床分型来看，ＴＴＶ单独感染者以急性肝炎（ＡＨ）为多见，占７５％     

采用原位杂交法检测肝组织中的TT病毒

目的：检测肝组织中ＴＴ病毒。并探讨其致病性。方法：采用对称和不对称ＰＣＲ法,以地高辛素分别标记ＴＴＶ双链和单链探针,原位杂交法检测５６例肝组织。结果：５１例非甲￣非庚型肝炎肝组织中ＴＴＶ总检出率２７．５％（１４／５１）;５例非肝炎肝组织杂交阴性。ＴＴＶ ＤＮＡ主要见于肝细胞核内,在急性、慢性及重型肝炎组织中均有检出。双链探针杂交结果与单链探针检测病毒基因链的结果一致,２／６例组织ＴＴＶ基因链与互补链同时存在,结论：ＴＴＶ是导致肝炎的一种新病原,并且在肝脏内有复制。     

丁型肝炎患者肝组织HDAg和HBsAg/HBcAg的免疫组化检测

目的 探讨HDAg和HBsAg/HBcAg在丁型肝炎患者肝组织中表达及关系。方法 应用免疫组化双重染色,检测79例丁型肝炎患者肝组织HDAg、HBsAg和HBcAg表达,以52例乙型肝炎作对照。结果 丁型肝炎HBsAg、HBcAg检出率(81％、71％)较乙型肝炎(94％、92％)低(P<0.05或0.01)。HDAg以肝细胞核表达为主,HBsAg以肝细胞浆表达为主,HDAg和HBsAg表达强度及阳性细胞分布呈一致性,且均与肝组织的炎症活动和病理损害程度相关(P<0.01)。HBcAg以肝细胞核表达为主,阳性细胞主要呈单个细胞或点状分布,且HBcAg阳性细胞明显少于HDAg阳性细胞。结论 HDV感染会抑制HBV病毒抗原(HBcAg)表达;HDV致病机制中既有HDV的直接细胞毒性作用,也有HBV和HDV的协同作用。     

病毒性心肌炎细胞感染模型的建立及实验研究

目的：建立病毒性心肌炎细胞感染模型。方法：以柯萨奇B1病毒感染原代培养的乳鼠心肌细胞，镜下观察心肌细胞搏动次数、细胞病变、测定DNA含量及MTT活细胞染色。结果：采用差速贴壁法获得的活心肌细胞数〉90％（台盼蓝染色），心肌细胞多核、多形性特征明显（HE染色）；感染CVB324小时后，心肌搏动频率紊乱，感染48小时至一周后心肌搏动次数明显减少（P〈0．01），随后肌丝断裂，细胞圆缩、脱落，细胞病变程度与MTT染色OD值呈明显负相关。细胞周期分析显示细胞受阻于G1期，有凋亡峰出现。结论：乳鼠心肌细胞原代培养及CVB3感染方法的建立，可作为研究病毒性心肌炎药物筛选和治疗的重要体外模型。     

HBsAg阴性慢性HBV感染：S基因a表位未发现变异

聚合酶链反应可检出ＨＢｓＡｇ（一）的乙型肝炎病毒感染，流行率在健康人群为１．９％、２．０％、３．４％，献血员中２．８％，在输血后急性丙型肝炎中合并３４．０％，在急性起病的“非甲非乙”病毒性肝炎中４７．２％，在慢性活动性“非甲非乙”肝炎中６６．７％，在重型乙型肝炎中３８．７％，在ＨＢｓＡｇ（一）原发性肝癌中８３．３％。对１１例各类病人扩增其血清中ＨＢＶＤＮＡ／Ｓ基因，对编码ａ表位的区段序列分析，未发现变异。     

Low Prevalence of Hepatitis C Virus Infection Among HIV-Positive Patients: Data From a Large-Scale Cohort Study in Istanbul,Turkey

Background:

Rate of coinfection with human immunodeficiency virus (HIV) and hepatitis C virus (HCV) varies in different countries. This may be attributable to common transmission routes as well as social, economic, and cultural factors.

Objectives:

The purpose of this study was to investigate the prevalence and risk factors of HCV infection among HIV-positive patients in Istanbul, Turkey.

Patients and Methods:

Since January 2006 to November 2013, 949 HIV-positive patients that were enrolled in this study by ACTHIV-IST (Action Against HIV in Istanbul) Study Group, which consists of five centers to follow up HIV-positive patients in Istanbul. Epidemiologic and clinical data were collected retrospectively from medical records and were transferred to an HIV database system.

Results:

Among 949 patients, 84% were men and the mean age was 37.92 ± 11.54 years (range, 17-79). The most frequent route of transmission was heterosexual intercourse (48.8%), followed by men having sex with men (30.5%). Only nine patients (0.9%) had history of injection drug use (IDU). The prevalence of HIV/HCV coinfection was 0.9% (9:949). The IDU rate was 44.4% (4:9) in patients with HIV/HCV coinfection (three of them were not Turkish citizens), whereas this rate was only 0.6% (5:881) in patients with only HIV infection (P < 0.01). Genotypes 1b, 2a/2c, and 3 were determined in five, one, and two patients, respectively. Genotype could not be determined in one patient. History of residence in a foreign country (P < 0.01) and imprisonment (P < 0.01) were also considered as risk factors in terms of HIV/HCV coinfection.

Conclusions:

Prevalence of HIV/HCV coinfection is considerably low in Turkey. The extremely rare prevalence of IDU might have a role in this low prevalence.