抗人肾癌G250单克隆抗体的制备及其功能鉴定

目的 大量制备、纯化抗人G250单克隆抗体(G250-MeAb),并鉴定其与G250合成多肽及细胞天然抗原的结合特异性.方法 将抗人G250杂交瘤细胞接种BALB/C小鼠腹腔,大量制备G250-McAb.采用正辛酸-硫酸铵沉淀法获得粗制抗体,然后经蛋白A亲和层析柱纯化抗体.采用荧光激活细胞分类术及免疫组织化学法鉴定G250-McAb与抗原结合特异性.结果 成功制备抗人G250-MeAb,腹水经纯化后,获得了高纯度抗人G250单克隆抗体,蛋白浓度达4.78 g/L.荧光激活细胞分类术及免疫组织化学结果 显示G250-McAb与G250表达阳性的Ketr-3细胞特异性结合,而不与G250表达阴性的ACHN细胞结合.结论 成功制备并纯化G250-McAb,为进一步开展G250-McAb介导的肾癌诊断、治疗奠定了基础.     

肾癌肿瘤相关抗原G250及G250蛋白多糖(PG)区基因的克隆、表达及鉴定

目的 探讨肾癌肿瘤相关抗原G250及G250蛋白多糖(PG)区基因的克隆,蛋白表达及鉴定.方法 从肾癌细胞786-0中提取mRNA,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出G250及G250 PC,区cDNA.将获得的cDNA片段插入pET28a(+)表达载体,构建重组质粒pET-28a(+).G250/pET-28a(+)-G250 PG,转化DH5α大肠杆菌.通过PCR鉴定筛选出正确的重组子,并用其转化BL21 Codon Plus菌.采用IPTG诱导工程菌进行诱导表达,SDS-PAGE及Westernblot鉴定.结果 克隆的基因经测序证实,G250/G250 PG区序列正确.构建重组质粒pET-28a(+).G250/pET-28a(+)-G250 PG,并在原核系统中表达G250/G250 PC重组蛋白,目的 蛋白均具有较好的抗原性和特异性.结论 成功完成G250/G250 Pc区基因克隆及表达,为在G250/G250PG蛋白纯化基础上进行抗体制备和G250功能研究提供了实验依据.     

腺病毒介导G250基因转染树突状细胞激活免疫效应细胞治疗肾癌的实验研究

目的 探讨以腺病毒(Ad)载体介导肾癌相关抗原G250基因转染制备树突状细胞(DC)瘤苗.体外诱导自体T淋巴细胞特异性抗肾癌免疫效应. 方法 自健康人外周血中提取单核细胞,将贴壁细胞分为3组(Ad-G250基因转染组、G250蛋白致敏组、未致敏组),用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和诱导活化;3组DC细胞中分别加入自体T淋巴细胞,获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL).RT-PCR检测G250在DC细胞内的转录情况;流式细胞仪检测DC表面标志分子和G250抗原蛋白的表达情况;四甲基偶氮唑盐法检测3组CTL对肾癌细胞株786-0和肺癌细胞株A549的杀伤活性. 结果 Ad-G250高效转染DC,G250阳性细胞率为(52.2±1.5)%,G250蛋白在DC:内成功表达:基因转染组DC中成功扩增出G250产物;Ad-G250转染的DC表面标志CD_(80)、CD_(83)、CD_(86)、CD_(1a)、HLA-DR表达高于其他2组.差异均有统计学意义(P<0.05).Ad-G250基因转染组、G250蛋白致敏组、未致敏组诱导的3组CTL对786-0靶细胞杀伤活性分别为(83.4±2.8)%、(79.6±2.4)%、(77.3±2.1)%,组间比较差异有统计学意义(F=69.172,P=0.000);3组CTL对A549靶细胞杀伤活性差异无统计学意义(F=0.373,P=0.693). 结论 以Ad为载体介导抗原基因转染DC,并诱导特异的CTL,技术上可行,所诱导的CTL杀伤活性强,有望成为一种肿瘤免疫治疗方法.     

表达肾癌G250基因和hGM-CSF基因HEK293细胞系的建立

目的 建立稳定表达肾癌G250基因与基因佐剂hGM-CSF基因编码蛋白的的HEK293细胞系。方法 通过脂质体转染的方法,将表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的双顺反子pIG250-GM真核表达质粒导入HEK293细胞中;经持续G418压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系;用免疫组化、ELISA和Western Blot方法,检测目的蛋白在HEK293细胞中的表达。结果 经600 μg/mL的G418压力筛选后,获得了抗性细胞克隆;免疫组织化学方法检测到表达G250的阳性细胞;ELISA方法检测到pIG250-GM转染组细胞培养上清中hGM-CSF的表达与空载体对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;Western Blotting方法检测到G250蛋白的表达,分子量约54Ku,与预期大小相符。结论 成功建立可稳定表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的HEK293细胞系,为研究防治肾癌疫苗的免疫应答机制提供了实验基础。     

同源盒基因IRX1的启动子克隆及其在人胃黏膜细胞中的启动活性分析

目的 克隆同源盒基因IRX1的核心启动子序列,并探讨其转录调控机制.方法 通过生物信息学预测IRX1基因启动子范围：利用PCR方法扩增并构建含有IRX1基因启动子不同片段的真核报告基因质粒,瞬时转染GES-1胃黏膜细胞,通过检测不同片段的荧光素酶报告质粒活性,判断不同片段的启动子活性.结果 生物信息学预测IRX1基因启动子位于转录起始点上游700 bp范围内.通过PCR技术扩增获得IRX1基因5＇侧翼区8个截短片段报告基因质粒,其活性由大到小依次为p-416＞p-584＞p-715＞p-350＞p-687＞p-320＞p-188＞p-92 除p-92与p-188片段外,其余各片段与PGL3-basic空载体的差异均有统计学意义（均P＜0.05）,其中以p-416片段活性最强,片段p-320与片段p-188之间出现较大活性落差.结论 IRX1基因上游序列启动子以p-416转录活性最高,核心启动子位于-320～-188区间,该区间具有Sp1、TFⅡD等转录因子结合序列,是下一步转录调控机制研究的重要位点.     

肾癌相关蛋白G250mRNA在肾细胞癌中表达的研究

目的探讨肾癌相关蛋白G250 mRNA在肾细胞癌(RCC)中的表达及其临床意义.方法采用RT-PCR方法检测7例正常肾组织和33例RCC组织中G250 mRNA的表达.33例RCC中透明细胞癌28例,非透明细胞癌5例;T1 8例、T2 13例、T3 12例;G1 11例、G2 15例、G37例. 结果33例RCC组织中G250 mRNA表达阳性28例(84.8%),7例正常组织G250表达均为阴性,2组间差异有统计学意义(P＜0.01).肾透明细胞癌组织G250 mRNA表达率高于非透明细胞癌[96.4%(27/28)和20.0%(1/5),P＜0.05].T1、T2、T3 RCC G250 mRNA表达量分别为0.32±0.21、0.41±0.16、0.38±0.14,表达量与临床分期无相关性(P＞0.05).G1、G2、G3 RCC G250 mRNA表达量分别为0.48±0.32、0.23±0.16、0.11±0.11,表达量与病理分级呈负相关(P＜0.05).结论G250mRNA表达与RCC恶性程度有相关性,有望成为RCC诊断及预后判断的指标.     

细胞间粘附分子在正常肾和肾癌组织中的表达及其临床意义

为探讨细胞间粘附分子１（ＩＣＡＭ１）在正常肾组织中的表达方式和肾癌组织中表达的意义以及与组织中浸润性白细胞的关系，应用抗ＩＣＡＭ１单克隆抗体配合微波炉抗原修复法对４３例肾癌和非癌肾组织进行免疫组化研究；应用抗淋巴细胞毒（ＬＣＡ）单克隆抗体免疫组化染色分析组织中浸润性白细胞的分布。结果：ＩＣＡＭ１在正常肾小球和肾小管组织中为低表达，有炎症时表达增强；肾癌组织表达的阳性率为７６．７％（３３／４３例）；表达强度与肿瘤级别呈正相关（α＝０．３，Ｐ＝０．２４）；肿瘤组织中浸润性白细胞数量的增加伴有ＩＣＡＭ１表达增强的趋势。以上结果提示ＩＣＡＭ１表达是肾癌的恶性表型之一，也是肾癌导致宿主免疫反应的原因之一。     

CAIX/MN/G250 mRNA在肾癌根治术前后表达的检测

目的探讨肾癌相关蛋白CAIX／MN／G250mRNA在肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）手术前后的表达水平及临床意义。方法应用RT—PCR技术检测57例RCC患者癌组织及术前外周血中CAIX／MN／G250mRNA的表达情况,并选择15例癌旁肾组织、15例正常肾组织及40例健康人外周血作对照,对术前外周血CAIX／MN／G250mRNA阳性RCC患者术后随访4周,并对其外周血CAIX／MN／G250mRNA水平进行半定量检测。结果57例RCC患者,其CAIX／MN／G250mRNA阳性率在外周血中为59．6％（34／57）,癌组织中为78．9％（45／57）,显著高于对照组（P〈0．01）。在肾透明细胞癌患者的外周血及癌组织中,CAIX／MN／G250mRNA的阳性率分别为76．2％（32／42）和95．2％（40／42）,均显著高于相应对照组（P〈0．01）。RCC患者外周血及癌组织中CAIX／MN／G250mRNA阳性率均随临床分期的增加而增加（P〈0．01）。34例外周血阳性患者CAIX／MN／G250mRNA水平术前2h、术后7、14、21和28d分别为0．54&#177;0．13、0．56&#177;0．15、0．34&#177;0．13、0．29&#177;0．18和0．22&#177;0．11。RCC患者外周血CAIX／MN／G250mRNA水平在肾癌根治术后随时间的推移呈下降趋势（P均〈0．05）。结论使用RT—PCR技术检测CAIX／MN／G250mRNA对肾癌尤其是透明细胞癌有较好的特异性和敏感性。外周血CAIX／MN／G250mRNA检测可作为肾癌微转移的检测指标用于RCC的诊断、疗效评价及预后判断。     

肾癌肿瘤相关抗原G250/MN/CAⅨ基因的克隆、表达及鉴定

目的报道G250/MN/CAⅨ基因的克隆,蛋白表达及鉴定。方法从肾癌组织中提取总RNA,采用RTPCR法扩增G250/MN/CAⅨ全长cDNA,将获得的cDNA片段插入pET22b(+)表达载体,转化BL21大肠杆菌中,以IPTG诱导进行蛋白表达,SDSPAGE凝胶电泳观察结果,实验验证。结果克隆的G250/MN/CAⅨ基因经测序证实序列正确,构建重组质粒pET22b(+)/G250并在原核系统中表达G250/MN/CAⅨ重组蛋白,该蛋白具有较好的抗原性和特异性。结论成功完成G250基因克隆,为在G250蛋白纯化基础上进行抗体制备和G250功能研究提供了实验依据。     

Ki-67启动子的克隆及其转录活性

目的 克隆肿瘤特异Ki-67启动子,观察其在人肿瘤细胞中的转录活性.方法 提取肾癌Ketr-3细胞基因组总DNA作为模板,聚合酶链反应(PCR)获取1.6 kb的Ki-67启动子DNA片段.克隆到pGL3-Basic载体构建双荧光素酶检测质粒pGLB-Ki-67.将pGLB-Ki-67转染4种人肿瘤细胞及人脐静脉内皮Huvec细胞,使用双荧光素酶检测系统鉴定启动子活性及肿瘤特异性.结果 电泳与测序结果 显示克隆出的Ki-67启动子片段序列与Genbank中记录一致,pGLB-Ki-67质粒构建成功.其启动子活性在Hela、BIU-87、Ketr-3、A549 4种人肿瘤细胞内分别达到SV40 promoter/enhancer活性的21.0%、31.1%、23.9%和7.2%;在Huvec细胞内仅为0.5%.结论 克隆出I(5-67基因启动子(-820～+771),并证明其具有良好转录活性.     

肾癌G250启动子及肿瘤细胞p53突变双重调控的表达Ki67-siRNA的增殖腺病毒的构建

目的 构建一种受肾癌G250启动子及肿瘤细胞p53突变双重调控的表达Ki67基因小干扰RNA(Ki67-E1B 55kDsiRNA)的新型增殖腺病毒.方法 将含有H1启动子的Ki67-siRNA表达框插入E1B 55kD缺失增殖腺病毒载体pZD55中,构建pZD55-Ki67质粒.用G250启动子取代pZD55-Ki67的E1A启动子,构建双调控增殖腺病毒载体pZD-G250-Ki67.将pZD-G250-Ki67与腺病毒右臂质粒pBHGE3共转染293细胞,9～12 d后出现病毒空斑.提取重组腺病毒的DNA、聚合酶链反应(PCR)鉴定正确者即为条件增殖腺病毒ZD-G250-Ki67.鉴定、扩增、纯化、测病毒滴度.结果 成功构建G250启动子调控E1B 55kD蛋白编码基因缺失的表达Ki67-siRNA的双调控增殖型腺病毒ZD-G250-Ki67.病毒滴度为2×10~(11)PFU/ml.结论 成功构建的ZD-G250-Ki67为利用Ki67-siRNA靶向肾癌治疗奠定基础.     

间隙连接蛋白43在肾细胞癌中的表达及意义

目的:探讨间隙连接蛋白Cx43在肾细胞癌(RCC)中的表达及其与RCC生物学行为之间的关系.方法:应用S-P免疫组织化学法检测Cx43蛋白在41例RCC,12例癌旁肾组织及10例正常肾组织中的表达情况.结果:Cx43阳性染色主要定位在细胞膜和细胞质上.Cx43蛋白在RCC中的阳性表达率明显低于在癌旁肾及正常肾组织的水平(P＜ 0.01);在透明细胞癌、颗粒细胞癌、梭形细胞癌中,其阳性表达率比较差异无统计学意义(P＞ 0.05);随着临床分期的增高,其阳性率明显下降(P＜ 0.05),并与RCC转移呈负相关(Spearman 等级相关系数r=- 0.483, P＜ 0.01);与肿瘤大小无明显关系(P＞ 0.05).结论:Cx43对RCC发生和转移有明显抑制作用,其表达减弱或消失可能与RCC的发生和发展密切相关.     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体单克隆抗体对人肾癌细胞的毒性作用

目的　探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体 (TRAIL R)的单克隆抗体对肾癌细胞的毒性作用和机制。方法　在人肾癌细胞系ACHN和Caki 1中 ,应用四甲基偶氮唑盐 (MTT)方法分析细胞毒效应 ,应用流式细胞术检测相关凋亡诱导配体受体 (TRAIL R)的表达 ,应用荧光染色和AnnexinV标记检测细胞凋亡的发生 ,应用比色法分析多种Caspase活性在凋亡过程中的变化。结果　抗TRAIL R2单克隆抗体 (ETR2 )对人肾癌细胞系ACHN和Caki 1都具有明显的细胞毒性 (P <0 .0 1) ,而抗TRAIL R1单克隆抗体 (ETR1)的细胞毒性不显著 (P >0 .0 5 )。TRAIL R2在两种细胞表面均高表达 (ACHN :97.9% ,Caki 1:98.7% ) ,TRAIL R1表达微弱 (ACHN :7.6% ,Caki 1:7.5 4% )。ETR2通过诱导细胞凋亡发挥细胞毒作用 ,Caspase 8, 9, 6和 3活性在凋亡过程中明显增高 (P <0 .0 1)。结论　TRAIL R2的单克隆抗体在体外可诱导肾癌细胞发生凋亡 ,其细胞毒性与TRAIL R2的表达有关 ,在凋亡过程中内源性与外源性凋亡通路均被激活。     

Current pathology keys of renal cell carcinoma

Context

Renal cell carcinoma (RCC) in adults comprises a heterogeneous group of tumours with variable clinical outcomes that range from indolent to overtly malignant. The application of molecular genetic techniques to the study of renal neoplasms has resulted in an improved classification of these entities and a better understanding of the biologic mechanisms responsible for tumour development and progression. The current 2004 World Health Organisation classification of adult renal epithelial neoplasms has expanded rapidly with new categories recently incorporated.

Objective

To review and evaluate the evidence implicating pathologic features and classification of RCC in adults as a tool to approach patients’ prognosis and modulate current therapy.

Evidence acquisition

Members of Committee 3: Pathology, under the auspices of the International Consultation on Urological Diseases and the European Association of Urology (ICUD-EAU) International Consultation on Kidney Cancer, performed a systematic review using PubMed. Participating pathologists discussed pathologic categories and diagnostic features of RCC in adults.

Evidence synthesis

We reviewed and discussed articles and the personal experiences of participating uropathologists.

Conclusions

The conclusions reached by the ICUD-EAU 2010 International Consultation on Kidney Cancer emphasise the appropriate pathologic diagnosis of RCC in adults as a tool to approach patients’ prognosis and modulate current therapy. Further emphasis should be placed on defining risk groups of RCC and diagnostic features of unusual tumours such as familial RCC, translocation RCC, and tubular mucinous and spindle cell carcinoma. A number of recently described entities and morphologic variants of classical categories deserves recognition because they can be important in differential diagnosis and therapy.     

Synchronous ipsilateral conventional renal cell and transitional cell carcinoma

Simultaneous occurrence of renal cell carcinoma (RCC) and transitional cell carcinoma (TCC) in the same kidney is unusual. We report a 61-year-old man with ipsilateral synchronous renal adenocarcinoma and renal pelvic TCC. He was referred to our department for gross hematuria and right flank pain. CT and MRI studies revealed a 57 × 50 mm irregular and infiltrative upper right kidney mass with necrotic components. A right radical nephrectomy was done. Pathological diagnosis was a high grade tumor originating from just beneath the intact urothelium of renal pelvis and infiltrating through the parenchyma showing solid and occasional tubular growth patterns. A second tumor in close proximity to the first was reported as well differentiated RCC. This is a rare case of combined renal malignancies.     

细胞因子对肾癌特异抗原G250表达的影响

目的 研究细胞因子对肾癌细胞特异性抗原G250表达的影响。方法 单独或联合应用不同浓度的白细胞介素（IL）-2、干扰素（IFN）-α、IFN-γ刺激肾癌786-0细胞系，刺激24、48、96h后，运用免疫组织化学、Western blot和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测G250抗原在肾癌786旬细胞上的表达。结果 IL-2、IFN-α、IFN-γ均能上调786-0细胞G250抗原表达，以IFN-γ作用最强，上调作用具有浓度及时间依赖性。细胞因子联用能明显增强G250抗原表达的上调作用。结论 IL-2、IFN-α、IFN-γ能上调肾癌786-0细胞G250抗原表达，联合应用效果更大。提示细胞因子联合以G250抗原为靶点的免疫治疗有望成为晚期肾癌新的治疗途径。     

三氧化二砷抑制肾癌细胞系786-0增殖及诱导凋亡的研究

目的探讨三氧化二砷(As2O3)对人肾癌细胞系786-0的增殖抑制和诱导凋亡的作用及可能机制。方法采用细胞增殖检测、形态学观察、琼脂糖凝胶电泳和肿瘤克隆形成等方法观察As2O3对786-0细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用,以免疫组织化学和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术等探讨As2O3的作用机制。结果2μmol/L以上浓度As2O3可显著抑制786-0细胞的增殖、降低细胞核分裂指数并出现凋亡的形态学改变和DNA片段化,经2.0μmol/LAs2O3处理72h后,其抑制786-0细胞增殖率为69.13%(P<0.01),使其核分裂指数由6.00降低至1.80(P<0.01),肿瘤细胞克隆形成抑制率达到100.00%。As2O3使786-0细胞内bcl-2、PCNA和Ki-67基因表达降低(P<0.01),其作用随药物浓度升高和时间延长而增加。结论As2O3对786-0细胞具有显著的增殖抑制作用,并具有浓度和时间依赖性特点,可能通过下调其PCNA和Ki-67基因表达抑制增殖,抑制bcl-2基因的表达诱导细胞凋亡。     

保留肾单位手术治疗肾癌(附46例报告)

目的:探讨保留肾单位手术治疗肾癌的安全性和疗效。方法:对1993年2月～2006年10月共46例采用保留肾单位手术的肾癌患者的临床资料进行回顾性分析,其中双侧肾癌4例,孤立肾癌3例,对侧肾有病变或潜在功能受损的肾癌25例,对侧肾正常的肾癌14例。结果:46例患者术前均未发现转移灶。术后组织病理学结果示肾透明细胞癌36例,颗粒细胞癌6例,混合性细胞癌4例。术后42例(91%)获随访,随访时间6～160个月,平均随访65个月。5、10年生存率分别为94%、86%。3例术后出现局部复发和远处转移。结论:保留肾单位手术治疗肾癌安全有效,手术指征可扩展至对侧肾脏正常的患者。