pIRES2-EGFP-hIL-10真核表达载体的构建及鉴定

目的构建带有报告基因EGFP的hIL-10真核表达载体。方法通过RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞中扩增出IL-10基因,构建IL—10基因和报告基因EGFP基因真核表达载体pIRES2-EGFP—hIL-10,经PCR、酶切、测序等方法进行鉴定,紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度。结果酶切、PCR及测序证实pIRES2-EGFP—hIL-10载体序列正确。结论成功构建真核表达载体pIRES2-EGFP—hIL-10,可为后续器官移植免疫耐受的研究奠定基础。     

新型基因佐剂SPreS2真核表达载体的构建及其瞬时表达

目的 构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2作为基因佐剂,用以增强或调节弓形虫DNA疫苗的体液及细胞免疫效果。方法 采用重叠延伸PCR技术,扩增乙肝病毒表面抗原S和PreS2基因,引入编码GSGSGS柔性多肽序列作为接头拼接S和PreS2基因,构建重组克隆载体pMD18T-SPreS2和重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,分别进行PCR、酶切和测序鉴定;脂质体法将重组载体pVAX1 SPreS2转染人成纤维细胞,建立体外真核细胞瞬时表达系统,SDS-PAGE和Western blot检测重组载体转染HFF细胞瞬时表达状况及其表达产物的免疫活性。结果 PCR、酶切、测序结果表明,重组克隆载体pMD18T SPreS2和重组真核表达载体pVAX1 SPreS2正确构建,融合基因SPreS2在真核细胞中可以瞬时表达,其表达产物具有一定的免疫活性。结论 成功构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,为增强或调节弓形虫DNA疫苗免疫效果提供一种新型基因佐剂。     

膜联蛋白V真核表达载体的构建

目的：构建人膜联蛋白V基因真核表达载体,探讨人膜联蛋白V的生理功能。方法：PCR方法扩增含EcoRI及BamHI酶切位点的膜联蛋白V基因序列,对真核表达载体pcDNA3．1(-)和膜联蛋白V基因扩增产物进行双酶切,用连接酶将二者连接并转化到大肠杆菌BL21,重组质粒经测序鉴定,称为pcDNA3．1(-)AxV。结果：酶切琼脂糖电泳分析pcDNA3．1(-)AxV中含有膜联蛋白V基因,序列分析表明与文献报道的序列完全一致。结论：成功地构建了人膜联蛋白V基因的真核表达载体,为研究其生理作用奠定了基础。     

真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-B7-2的构建

目的：构建含人B7-2基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-B7-2。方法：应用RT-PCR、巢式PCR方法从重症肌无力患者胸腺组织中扩增出人B7—2 cDNA基闪片段,经回收、纯化、酶切后,依次连接到质粒pGEM—T和pEGFP—C3上．结果与结论：酶切及测序证实成功构建了克隆载休pGEM—B7—2和真核绿色荧光表达载体pEGFP—C3—B7—2。     

人pcDNA3.1-TPX2真核表达载体的构建与表达

目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。     

人CMV／ARL-1真核表达载体的构建

目的 构建人CMV／ARL-1真核表达栽体，为进一步建立转ARL-1基因Hep-G2单克隆细胞系奠定基础。方法 采用限制性内切酶技术，酶切真核骨架质粒pBK／CMV及另一质粒pBK／ARL-1(内含ARL-1cDNA全长)，用TONA连结酶将目的基因连至骨架质粒上，酶切及序列分析的方法鉴定重组质粒。结果 经Eco RⅠ、NcoⅠ、UindⅢ酶切鉴定和序列分析，证明ARL-1基因已插入到pBK／CMV真核表达载体上。结论 成功地构建了CHV／ARL-1真核表达载体．     

人IL-18基因真核表达载体的构建

目的:通过克隆人的Interleukin-18基因,构建Interleukin-18基因的哺乳动物细胞真核表达载体。方法:把人基因组DNA通过PCR获得Interleukin-18,克隆载体pMD18-T/Interleukin-18,并将其转化到大肠杆菌里,最后进行重组真核表达载体pCDNA3.1/Interleukin-18的构建和鉴定。结果:以人总DNA为模板扩增出580 bp左右的特异性条带,测序结果与GeneBank测序结果相比,除两个碱基外,其余的完全一致,翻译成的氨基酸序列相同。对重组质粒pCDNA3.1/Interleukin-18进行双酶切鉴定并测序,结果也完全一致。结论:重组质粒pCDNA3.1/Interleukin-18由真核载体pCDNA3.1和Interleukin-18片段组成。且插入的Interleukin-18片段与已知序列完全相同。     

真核荧光蛋白表达载体 pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1的构建与表达

目的:构建表达B7.2和MAGE-1的绿色荧光共表达载体pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1,并在真核细胞中表达.方法:根据GenBank中的序列,对B7.2、MAGE-1各设计一对两端带有特定限制性酶切位点的引物,分别从乳腺组织、乳癌组织提取总RNA,进行RT-PCR后,将两扩增产物分别克隆在pGEM-T载体,经测序证实碱基序列无误后,双酶切pGEM-T载体,回收目的片段,将两目的片段亚克隆至真核绿色荧光蛋白共表达载体(pEGFP-C3)上,并转染真核细胞,观察其在真核细胞中表达.结果及结论:pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1真核表达载体经酶切及基因序列分析验证,PCR扩增片段与选择的目的片段序列相符,pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1真核表达载体构建成功.该表达载体转染EC9706细胞后,用免疫荧光显微镜观察和RT-PCR分析,该重组载体能够在真核细胞中广泛表达.     

大鼠EAAT3真核表达载体的构建及在Hella细胞中的表达

目的:克隆大鼠谷氨酸转运蛋白3(EAAT3)的cDNA,构建其真核表达载体并转染Hella细胞.方法:从大鼠的脑组织中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增EAAT3的基因编码区序列,将序列定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ). 经酶切及测序鉴定后用阳离子脂质体将其转染到Hella细胞中,通过免疫印迹法鉴定其表达.结果:经双酶切、测序鉴定证实EAAT3基因的真核表达载体构建成功.免疫印迹法证实EAAT3基因的表达.结论:成功克隆了EAAT3编码区序列,并构建了其真核表达载体,为以EAAT3为基础的中枢神经系统疾病的治疗奠定了基础.     

pEGFP-C2-GATA4真核表达载体的构建及在P19细胞中的表达

目的：构建小鼠GATA4基因融合绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP—C2-GATA4,并检验其在P19细胞中的瞬时表达．方法：以真核表达质粒pEFSA—GATA4为模板,PCR扩增得到小鼠GATA4基因片段,将目的片段亚克隆到pEG—FP—C2载体,卡那霉素筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切鉴定和测序鉴定．将重组质粒pEGFP—C2-GATA4以脂质体法瞬时转染P19细胞,用免疫细胞化学、共聚焦扫描显微镜、PCR、免疫印记法检测GATA4在P19细胞中的表达．结果：酶切、测序结果表明将基因片段GATA4正确插入pEGFP—C2载体,并可在P19细胞中检测到GATA4基因和GATA4-EGFP融合蛋白表达．结论：成功构建真核表达质粒pEGFP—C2-GATA4,并在P19细胞瞬时表达成功,为进一步研究GATA4在心脏发育中的作用奠定了基础．     

人组织激肽释放酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定人组织激肽释放酶基(h-TKK)基因真核表达质粒。方法 设计含pnI和BamH Ⅰ酶切住点的人组织激肤释放酶基因引物，采用PCR法从原核pBluescripe Ⅱ KSKK( )中扩增KKcDNA片段，亚克隆至padtrack-CMV真核表达裁体，转化感受态大肠杆菌DHl0B，酶切鉴定阳性重组子，并进行序列测定。结果经 PCR能扩增出738bp的片段，与预期片段大小相符，构建的重组体经酶切鉴定能切出插入片段，测序结果与预期序列完全一致。结论 成功构建了人组织激肽释放酶基因真核表达重组体pAdtrack-CMV KK。     

人乙酰肝素酶基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建人乙酰肝素酶基因（HPA）的真核表达载体pEGFP-N1/HPA,初步探讨其在人胚肾细胞293T中的表达情况.方法 以pOTB7/HPA质粒为模板,PCR扩增HPA基冈,经限制性内切酶酶切后,连接到pEGFP-N1载体上,并对重组表达载体pEGFP-N1/HPA进行酶切与测序鉴定.用脂质体lipefectmi...     

人CYB5R2基因真核表达载体的构建

目的构建人CYB5R2基因真核表达载体,并观察其在人鼻咽癌细胞HONE1中的表达。方法根据表达载体pCMV-Tag3A上的多克隆位点和CYB5R2基因CDS序列设计引物,应用RT-PCR从人睾丸cDNA中克隆出CYB5R2的CDS,并进行TA克隆。对经PER、双酶切和双向测序验证正确的质粒,进行CDS目的片段的回收,将其连接于pCMV-Tag3A载体的多克隆位点内构建真核载体,然后进行PCR、双酶切和双向测序验证。脂质体法转染鼻咽癌细胞HONE1细胞,荧光显微镜观察和RT—PCR验证该基因的表达。结果PCR、双酶切和双向测序结果显示pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体构建成功,荧光显微镜和RT—PER的结果显示该重组质粒在HONE1细胞中正确表达。结论成功构建了pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体,并在鼻咽癌细胞HONE1中表达,为进一步验证其抑癌作用及探索其抑癌机制做准备。     

增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记的原核表达栽体,并观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况.方法 据已知的EGFP基因序列,设计引物,并引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点.采用PCR技术从含有EGFP的质粒pEGFP-C1中克隆EGFP编码序列;将其亚克隆入表达载体pTWIN1,得到以EGFP为标记的原核表达载体pTWIN-EGFP.转化大肠杆菌ER2566菌株,IPTG诱导EGFP基因表达.结果 经过IPTG诱导后,细菌培养物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光.结论 成功构建了原核表达载体pTWIN-EGFP,为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础.     

重组人白介素27真核表达载体的构建

目的克隆人IL-27基因,构建其真核表达载体。方法从人外周血单核细胞诱导而成的树突状细胞中提取总RNA,采用RT-PCR克隆人IL-27亚基EBI3和p28基因,Xho I和EcoR I双酶切后插入真核表达质粒pcDNA3.1（-）,构建人IL-27真核表达载体pcDNA3.1-EBI3和pcDNA3.1-p28。结果双酶切及测序结果表明构建载体中的EBI3与p28序列与文献报道一致。结论重组人IL-27真核表达载体的构建成功,为表达出有活性的重组人IL-27奠定了基础。     

大鼠Ngn2基因真核表达质粒的构建

目的：构建大鼠Neurogenin2（Ngn2）基因的真核表达质粒。方法：从大鼠海马组织提取海马总mRNA ,RT-PCR获得Ngn2基因cDNA,构建重组质粒pSecTag2／HygroB-Ngn2, XhoⅠ和HindⅢ双酶切、测序鉴定重组质粒。结果：RT-PCR获得片断与预期结果相符,酶切鉴定、测序鉴定证实pSecTag2／HygroB-Ngn2重组质粒构建成功。结论：成功构建了大鼠Ngn2基因的真核表达质粒,并对该基因的真核表达产物进行鉴定,为下一步Ngn2基因对神经损伤修复作用的研究奠定基础。     

人骨形成蛋白2和人骨形成蛋白7成熟肽编码区基因克隆和真核表达载体的构建

目的克隆和构建人骨形成蛋白2(BMP-2)和人骨形成蛋白7(BMP-7)成熟肽真核表达载体。方法采用Trizol法从人骨肉瘤细胞中提取制备总RNA,利用RT-PCR、PCR转录、扩增BMP-2和BMP-7获得成熟肽基因,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建真核表达重组子pcDNA3.1(+)/BMP-2MP和pcDNA3.1(+)/BMP-7MP。结果总RNA提取液电泳可见在28S、18S和5S处出现明显的条带,PCR和酶切可在439bp和364bp出现条带,阳性克隆测序结果与Genebank中登录的序列一致。结论成功克隆出人BMP-2MP和BMP-7MP基因,成熟肽基因已与pcDNA3.1(+)连接,成功构建其真核表达重组子pcDNA3.1/BMP-2MP和pcDNA3.1/BMP-7MP,为进一步研究BMP-2、BMP-7的功能及其成熟肽基因在骨髓间充质细胞(hMSCs)中表达以及在骨组织工程中的应用研究奠定了基础。     

分泌型碱性磷酸酶示踪的TA克隆真核表达载体的构建

目的制备具有分泌型碱性磷酸酶示踪作用和真核表达功能的TA克隆载体。方法把CMV启动子区-TA克隆位点-BGH多聚腺苷酸区序列克隆到pSEAP2-control载体中,构建成具有真核表达功能并外分泌碱性磷酸酶（SEAP）的pcDNA5AP-前T载体。增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因克隆到pcDNA5AP-T载体上并进行EGFP表达分析和SEAP活性检测。结果 pcDNA5AP-EGFP以400ng/孔转染6孔板293T细胞,EGFP表达率达50%,SEAP活性比对照组高20倍。结论成功构建了具有真核表达功能并外分泌碱性磷酸酶的pcDNA5AP-T载体。     

Construction of recombinant plasmid pEGFP-C2-L539fs/47and its expression in HEK293 cells

Objective:To reconstruct pEGFP-C2-L539fs/47,a HERG nonsense mutant in eukaryotic expression plasmid,and observe the fusion protein expressed in HEK293 cells (human embryo kidney cells).Methods:After double digestion of pcDNA3-L539fs/47 and pEGFP-C2-HERG with sbf I and Eco91 I,the small product fragment,from pcDNA3-L539fs/47,was subcloned into the big fragment of pEGFP-C2-HERG under T4 ligase.pEGFP-C2-L539fs/47 was identified by agarose gel electrophoresis and sequencing.pcDNA3-L539fs/47 and pEGFP-C2-L539fs/47 were transiently transfected into HEK293 cells by Lipofect,respectively.The expression of fusion protein in HEK293 cells was detected through immunofluoresceoce,laser confocal imaging scanning in vivo,Western blot and PCR.Results:Mutation region cDNA fragment (about 1 kb) and target vector fragment (about 7.2 kb) were ligated after purification and gel recovery.Agarose gel electrophoresis and sequencing successfully demonstrated eukaryotic expression plasmid pEGFP-C2-L539fs/47,constructed approximately 8.2 kb,sequencing consistent with template geue.The transfection efficiency of recombinant plasmid by fluorescence microscopy was more than60％.Western blot analysis detected pcDNA3-L539fs/47 expression of the protein size 60 KD,the expression of pEGFP-C2 fusion protein size of approximately 90 KD.The L539fs/47 gene expression in HEK293 ceils was significant by PCR analysis.Confocal laser imaging showed that pEGFp-C2-L539fs/47 protein was successfully expressed in cytoplasm and cytomembrane of HEK293 cells.Conclusion:pEGFP-C2-L539fs/47 containing the HERG gene mutant was successfully constructed by double digestion method and expressed fusion protein in HEK293 cells,which laid a foundation for the further study on L539fs/47.