沉默孕激素膜受体1基因抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa增殖的研究

目的 通过siRNA抑制子宫内膜癌细胞株Ishikawa孕激素膜受体1(progesterone receptor membrane component-1,PGRMC1)表达,探讨抑制子宫内膜癌细胞增殖的作用.方法 应用Ambion公司siRNA设计工具设计以PGRMC1为靶标的siRNA并用该公司试剂盒化学合成.MTT法检测转染siRNA后细胞增殖抑制率,RT-PCR检测转染siRNA后PGRMC1基因mRNA水平变化,Western blot检测蛋白表达变化.流式细胞仪检测转染组与对照组细胞周期变化;Annexin V阳性细胞百分比,对比细胞凋亡率;双氢二氯荧光黄染色阳性率判定细胞内ROS水平.结果 si-PGRMC1可显著抑制该基因mRNA及蛋白的表达,使细胞增殖受抑,G2期细胞比例明显增加,凋亡细胞比率明显增加,细胞内ROS水平也随之升高.结论 PGRMC1参与了调控子宫内膜癌细胞增殖.     

沉默孕激素膜受体I基因抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa增殖的研究

目的 通过siRNA抑制子宫内膜癌细胞株Ishikawa孕激素膜受体1(progesterone receptor membrane component-1，PGRMC1)表达，抑制子宫内膜癌细胞增殖。方法 应用Ambion公司siRNA设计工具设计以PGRMC1为靶标的siRNA并用该公司试剂盒化学合成。MTT法检测转染siRNA后细胞增殖抑制率，RT-PCR检测转染siRNA后PGRMC1基因mRNA水平变化，WB检测蛋白表达变化。流式细胞仪检测转染组与对照组细胞周期变化；Annexin V阳性细胞百分比，对比细胞凋亡率；双氢二氯荧光黄染色阳性率判定细胞内ROS水平。结果 si－PGRMC1可显著抑制该基因mRNA及蛋白表达，使细胞增殖受抑，G2期细胞比例明显增加，凋亡细胞比率明显增加，细胞内ROS水平也随之升高。 结论 PGRMC1参与了调控子宫内膜癌细胞增殖。     

载脂蛋白E通过激活ERK/MMP9信号通路促进子宫内膜癌细胞的迁移

目的 研究载脂蛋白E(APOE)在子宫内膜癌转移中的具体作用及分子调控机制。方法 子宫内膜癌HEC-1B细胞常规培养,空白对照组siRNA以及APOE靶向的siRNA转染子宫内膜癌HEC-1B细胞,以及采用空载质粒和APOE过表达质粒转染子宫内膜癌HEC-1B细胞,分为空白对照组siCtrl、siAPOE组、空载质粒组、APOE过表达质粒组。利用划痕实验和Transwell实验检测子宫内膜癌细胞的迁移能力,通过MTT实验及流式细胞术验证APOE对子宫内膜癌细胞增殖能力的影响,使用Hoechst染色法检测干扰APOE后HEC-1B细胞的凋亡情况,采用qPCR、Western blotting观察ERK/MMP9信号通路的变化;通过免疫组化的方法分析APOE的表达与子宫内膜癌组织分化程度的相关性。结果 划痕实验和Transwell小室实验结果显示,与空白对照组相比,转染了siAPOE的HEC-1B细胞的迁移能力均明显下降（P<0.05）。与空载质粒组相比,过表达APOE能显著促进子宫内膜癌细胞HEC-1B的迁移能力（P<0.05）。MTT实验及流式细胞术结果显示APOE对细胞增...     

靶向干扰ARTN对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖能力的影响

目的:通过RNA干扰技术靶向抑制ARTN基因在子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达,探讨抑制ARTN基因对Ishikawa细胞增殖能力的影响.方法:体外培养子宫内膜癌Ishikawa细胞,以pGPU6/GFP/Neo为载体构建ARTN基因的短发夹RNA(pGPU6/GFP/Neo-ARTN shRNA)干扰质粒,利用脂质体法转染人子宫内膜癌Ishikawa细胞,荧光显微镜下观察转染效率,应用Western Blot法检测转染后细胞ARTN蛋白的表达情况,CCK法检测Ishikawa细胞的增殖活性.结果:pGPU6/GFP/Neo-ARTN shRNA干扰质粒成功转染Ishikawa细胞,转染效率为80％;转染后48h,干扰组Ishikawa细胞ARTN蛋白的表达水平明显低于阴性对照组和正常组(P<0.05);转染后48h、72h、96h,干扰组Ishikawa细胞的增殖活性明显低于阴性对照组和正常组(P<0.05).结论:靶向干扰ARTN基因可抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖能力.     

靶向沉默EphA8基因对人结肠腺癌细胞凋亡及细胞周期的影响

目的:通过转染siRNA片段,研究EphA8基因沉默后对结肠腺癌Ls174T细胞凋亡和细胞周期的影响。方法:设计合成三对靶向沉默EphA8基因表达的siRNA片段,通过Lipofectamine2000介导转染人结肠腺癌细胞Ls174T。采用实时荧光定量PCR技术和Western Blot检测EphA8基因沉默效率,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。结果:三对siRNA片段均能沉默结肠腺癌Ls174T细胞EphA8 mRNA的表达,siRNA3抑制效果最明显,抑制率为85.71%。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示:转染48 h后,Ls174T细胞实验组细胞凋亡率为33.29%;流式细胞术检测细胞周期结果显示:转染60 h后,结肠腺癌Ls174T细胞实验组S期细胞和G2期细胞比例显著降低。结论:本实验成功筛选出特异性靶向沉默EphA8基因的siRNA片段,并初步鉴定了EphA8基因的功能。     

Chk1基因在二烯丙基二硫诱导的乳腺癌细胞MCF-7凋亡中的作用

目的:探讨Chk1基因在二烯丙基二硫诱导的乳腺癌细胞MCF-7凋亡和细胞周期中的作用。方法:采用siRNA转染MCF-7细胞靶向干扰Chk1基因,采用Western blot检测Chk1蛋白表达;采用流式细胞术检测Chk1基因沉默对二烯丙基二硫诱导乳腺癌细胞凋亡及细胞周期的影响。结果:转染Chkl siRNA后,乳腺癌细胞MCF-7中Chkl蛋白表达水平降低,明显低于对照组(P<0.05)。FCM检测结果显示,转染Chkl siRNA后,G2/M期乳腺癌细胞数量有所降低(P<0.05),并且si-Chkl+DADS组G2/M期比率明显低于NC siRNA+DADS组(P<0.05)。Chk1基因沉默后,二烯丙基二硫诱导的细胞凋亡率由(14.7±1.0)%上升到(29.8±1.7)%。结论:siRNA抑制Chk1基因表达可明显消除G2/M期阻滞,并显著增强二烯丙基二硫诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡的敏感性。     

am68基因对子宫内膜癌细胞增殖的影响

目的 探讨Sam68基因对人子宫内膜癌细胞增殖的影响。方法建立Sam68 稳定干扰和过表达子宫内膜癌细胞株，Real-time PCR和Western blot验证干扰和过表达效率，MTT法、平板克隆法、软琼脂克隆形成实验、BrdU法检测沉默及过表达Sam68基因对子宫内膜癌细胞增殖活力的影响。结果利用逆转录病毒载体成功构建了 Sam68 RNAi/HEC-1A、Sam68 RNAi /RL952以及Sam68 pc DNA-3 /Ishikawa子宫内膜癌细胞模型。沉默Sam68基因可降低子宫内膜癌细胞增殖,抑制细胞的集落形成能力，而过表达则效果相反。结论利用RNAi靶向沉默Sam68基因可有效抑制人子宫内膜癌细胞的增殖，过表达则可促进增殖。Sam68在子宫内膜癌的发生发展中可能起到癌基因的作用。     

TET1在子宫内膜病变中的表达及其对癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的探讨不同类型子宫内膜病变中TET1的表达水平和干扰TET1蛋白表达对子宫内膜癌细胞系Hec-1a和Ishikawa细胞生物学行为的影响。方法免疫组织化学检测组织中TET1的表达;应用干扰TET1表达的siRNA转染Hec-1a和Ishikawa细胞,以仅加入转染试剂的细胞作为阴性对照;Western blotting检测转染效率;SRB法检测细胞增殖能力改变;Transwell侵袭试验检测细胞侵袭能力改变;划痕试验检测细胞迁移能力改变;流式细胞术检测细胞周期改变。结果子宫内膜组织中TET1的表达随病理类型进展而升高;干扰组TET1蛋白表达水平明显低于对照组;干扰TET1表达后子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭能力均受到不同程度抑制,同时出现G1/S期细胞周期阻滞。结论子宫内膜癌及子宫内膜增生性病变组织中TET1表达水平明显高于正常对照组织;干扰TET1表达后子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力下降,且出现G1/S期细胞周期阻滞,提示TET1在子宫内膜癌的增殖和转移过程中发挥重要作用。     

RNA干扰survivin对卵巢癌HO-8910PM细胞周期的影响

目的 探讨RNA干扰survivin基因对卵巢癌HO-8910PM细胞周期的影响.方法 实验分3个组：siR-NA组,采用脂质体法将靶向survivin siRNA荧光真核表达质粒载体pGPU6-GFP-survivin-shRNA转染卵巢癌HO-8910PM细胞;空白对照组,单纯细胞培养;阴性对照组,用表达与survivin序列无同源性的siRNA片段质粒pGPU6-GFP-NC转染细胞.于转染后48 h和72 h,用PI单染法流式细胞术检测各组HO-8910PM细胞周期的变化以及Western blot检测survivin蛋白的表达情况.结果 PI单染流式细胞仪检测细胞周期结果表明,与空白对照组和阴性对照组相比较,2个时间点siRNA组转染后的G0/G1期细胞比例明显增加,而G2/M期细胞比例均下降（P＜ 0.05）;Western blot结果证实,siRNA组的HO-8910PM细胞survivin蛋白的表达量明显下调.结论 导入survivin基因特异性的siRNA可导致卵巢癌HO-8910PM细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞增殖受阻,且细胞sur-vivin蛋白表达量下降.     

rAd-ODC/Ex3as对前列腺癌PC-3细胞抑制作用的研究

目的:探讨重组腺病毒rAd鄄ODC/Ex3as对前列腺癌细胞的体外抑制作用及对前列腺癌的作用机制。方法:利用报告基因GFP测定病毒感染效率,用WesternBlot检测rAd鄄ODC/Ex3as是否抑制鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因的表达,采用MTT法、Matrigeal侵袭实验观察rAd鄄ODC/Ex3as对前列腺癌细胞PC鄄3恶性表型的影响,并用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。结果:当MOI为50时,腺病毒感染PC鄄3细胞的效率约为70%,WesternBlot证实rAd鄄ODC/Ex3as可抑制ODC基因的表达。rAd鄄ODC/Ex3as以20MOI感染PC鄄3细胞可明显抑制其生长增殖和侵袭性穴P<0.01雪,流式细胞仪检测结果证实rAd鄄ODC/Ex3as可引起PC鄄3细胞G1期阻滞,但并未引起凋亡。结论:rAd鄄ODC/Ex3as在体外能有效地干扰ODC基因的表达,并可抑制前列腺癌细胞PC鄄3的生长与侵袭,诱导其发生G1期阻滞,有望成为治疗前列腺癌的基因药物。     

干扰组蛋白去甲基化酶基因表达对Ishikawa细胞增殖凋亡的影响

目的研究SiRNA干扰组蛋白去甲基化酶（JARID1A）基因表达对人子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖凋亡的影响。方法 Ishi-kawa细胞转染JARID1A特异性的SiRNA;将Ishikawa细胞分成sicon组、sicon＋e2组、siJARID1A组和siJARID1A＋e2组,RT-PCR检测四组细胞孕激素受体（progesterone receptor,PR）mRNA表达,Western Blot检测四组细胞PR蛋白,MTT法观察细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期。结果干扰JARID1A能显著上调PR表达,E2可进一步上调PR表达（P〈0.01）;E2能促进Ishikawa细胞增殖,转染SiRNA 48 h后细胞增殖受到抑制;转染SiRNA抑制细胞G1、G2/M期（P〈0.05）。结论 JARID1ASiRNA能有效抑制Ishikawa细胞增殖。     

茶多酚对成纤维细胞L929中鸟氨酸脱羧酶的抑制作用

目的:探讨茶多酚对成纤维细胞L929的增殖抑制作用及其作用机制。方法:体外培养小鼠成纤维细胞L929,加入茶多酚、二氟甲基鸟氨酸(DFMO)作用于细胞。用MTT法观察茶多酚对细胞增殖抑制作用,利用琼脂糖凝胶电泳和流式细胞技术检测细胞的调亡,RT鄄PCR技术检测鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因的表达。结果:20μmol/L的茶多酚即能明显抑制L929细胞的增殖,促进细胞的调亡,其半数有效浓度为200μmol/L。RT鄄PCR显示细胞中ODCmRNA表达明显下降(P<0.05)。200μmol/L的茶多酚的抑制效果与5mmol/L的DFMO的作用效果相似。二者共同作用于细胞时,对ODC的活性抑制作用更强,抑制效果更佳。结论:茶多酚能通过抑制细胞中ODC的表达来抑制细胞的增殖。     

二甲双胍在体外对人子宫内膜癌细胞增殖的影响

目的流行病学研究表明二甲双胍可以降低糖尿病患者患癌的风险性和癌症相关的死亡率,本实验进一步探讨二甲双胍在体外对人子宫内膜癌细胞增殖的影响及其可能的作用机制。方法二甲双胍干预人子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞不同时间后,采用MTT法检测其对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,Western blotting法检测ERα及PTEN的表达。结果二甲双胍显著抑制两种子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞的增殖。流式细胞术检测显示二甲双胍使子宫内膜癌细胞停滞在G0/G1期,并且可以诱导细胞的凋亡。Western blotting法检测显示二甲双胍能够促进子宫内膜癌细胞ERα的表达;Ishikawa细胞无PTEN蛋白的表达,HEC-1A细胞则高表达PTEN。结论二甲双胍能抑制子宫内膜癌细胞的生长,其作用机制可能与促进ERα的表达有关。     

Insulin in endometrial carcinoma chemotherapy: A beneficial addition and not a problem

The effects of insulin or insulin in combination with chemotherapeutic drugs on the proliferation and apoptosis of endometrial carcinoma cells were examined with an aim to determine the efficacy and safety of insulin in endometrial cancer therapy.Ishikawa and Hec-1A cells were treated with insulin and/or paclitaxel.Cell proliferation was assessed by MTT assay.Cell cycle and cell apoptosis were determined by flow cytometry (FCM).Survivin gene expression was detected by RT-PCR.Our results showed that in a certain range of working concentrations and action time, insulin could mildly augment cell proliferation and the percentage of S phase cells in endometrial cancer (Ishikawa/Hec-1A) cells.Insulin plus paclitaxel (combination group) could significantly inhibit cell proliferation (69.38%±2.32% vs 40.31%±4.52% with Ishikawa; 64.11%±6.33% vs 45.89%±3.27% with Hec-1A) and increase cell apoptosis compared with treatment with paclitaxel alone (paclitaxel group).Survivin gene expression was also significantly decreased in combination group as compared with paclitaxel group.We are led to conclude that insulin can mildly augment cell proliferation and present chemotherapy sensitivity in endometrial cancer cells.Insulin can be to used safely and efficiently in endometrial cancer therapy.     

STAT3小干扰RNA的构建及其对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的：构建以STAT3为靶基因的短发夹状小干扰RNA表达载体,并探讨STAT3小干扰RNA表达载体对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响。方法：以pGPU6／GFP／STAT3质粒为载体,构建STAT3的小干扰RNA表达载体,使用脂质体法转染人结肠癌HCT116细胞系,用M1Tr法检测空白对照组、小干扰RNA组、阴性对照组与脂质体对照组的增殖活性,48h后流式细胞仪分析4组细胞周期分布与凋亡的变化,并且通过RT—PCR和Westernblot检测结肠癌HCTll6细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平。结果：酶切鉴定和测序分析表明靶向STAT3的RNA干扰重组体构建成功;重组体转染HCT116后,STAT3的mRNA和蛋白水平较空载体转染组显著下降;小干扰RNA组与3对照组相比细胞增殖活性明显受到抑制（P〈0．01）;细胞生长明显减缓,G0／G1期细胞比例增加（P〈0．01）。结论：沉默STAT3基因可有效控制结肠癌细胞的增殖,使癌细胞阻滞于G0／G1期并诱导其凋亡,可望成为结肠癌治疗的新方法。     

靶向leptin基因的siRNA对大鼠肝星状细胞生物学特性的影响

目的 构建具有特异性瘦素（leptin）基因小于扰RNA（small interfering RNA，siRNA）功能的表达质粒，研究靶向leptin基因的siRNA对大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）中leptin表达及HSC生物学特性的影响。方法 以leptin为目的基因，以产生siRNA质粒载体psiRNA-hHlneo为表达模板，细胞内转录合成4对特异的siRNA和1对对照siRNA。构建能在真核细胞中表达的重组质粒leptinsi RNA，用酶切方法和测序法对重组体进行鉴定。应用脂质体介导重组质粒转染HSC。RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学法检测HSC的leptin表达情况，用MTT法检测细胞增殖，用流式细胞仪分析细胞凋亡。结果 酶切和序列测定表明，成功构建了leptinsiRNA表达质粒；外源重组质粒siRNA3和siRNA4能够抑制leptinm RNA和蛋白表达（均P〈0．01）；HSC增殖活性显著降低（P〈0．05），凋亡增加（P〈0．01）。与未转染组相比，consiRNA、siRNA1和siRNA2转染组没有显著改变（均P〉0．05）。结论 构建的leptinsi RNA表达载体可减少leptin的表达，抑制HSC增殖并诱导其凋亡。为肝纤维化基因治疗提供了新的靶点。     

siRNA阻抑Survivin基因表达对肝癌细胞周期影响的研究

目的采用RNA干扰（RNAi）技术抑制人肝癌HepG2细胞中Survivin基因表达,观察小分子干扰RNA（siRNA）对肝癌细胞周期的影响。方法构建人肝癌HepG2的survivin-siRNA,将其导入肝癌细胞系后研究。HepG2细胞分为四组：siRNA干扰组、siRNA干扰对照组、未转染的对照组、空白载体组。作用48h后Western印迹检测基因沉默效果,MTT法测量细胞生长情况,流式细胞术分析siRNA对肝癌细胞增殖周期的影响。结果 Western印迹法显示干扰组survivin基因的表达受到明显抑制。MTT法显示经survivin基因干扰后的HepG2细胞相比对照组细胞吸光度A值较低;尤其是24、48小时降低更为明显（P〈0.05）。流式细胞术显示干扰组的G2/M细胞百分率相对干扰对照组显着增大（P〈0.05）。结论 siRNA转染能够抑制细胞survivin基因表达,使人肝癌细胞株HepG2细胞阻滞于G2/M期。     

Eg5基因在神经母细胞瘤细胞增殖和凋亡中的作用

目的探讨Eg5基因对神经母细胞瘤(NB)细胞增殖和凋亡的影响。方法取2株NB细胞株SHSY-5Y和NBL-S,分别转染针对Eg5基因的小干扰RNA(siRNA),分为细胞对照组(用等体积的水代替siRNA,只含有脂质体,未转染细胞)、siRNA对照组(转染siRNA对照)和siRNA干扰组(转染Eg5 siRNA),每组6孔,每孔1×10~6个细胞。使用实时定量聚合酶链式反应(real-time PCR)检测Eg5 mRNA表达水平的变化;使用5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)掺入实验和克隆形成实验检测下调Eg5表达对NB细胞增殖的影响;使用流式细胞术检测下调Eg5表达对NB细胞凋亡和细胞周期的影响。结果荧光定量PCR检测结果显示,siRNA干扰组Eg5 mRNA表达水平与细胞对照组和siRNA对照组相比显著减少,差异有统计学意义(P<0.05);EdU掺入实验和克隆形成结果表明,siRNA干扰组细胞中DNA的合成量和细胞克隆数量低于细胞对照和siRNA对照组,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞术检测结果显示,细胞对照组和siRNA对照组细胞的凋亡比率低于siRNA干扰组细胞的凋亡比率,差异有统计学意义(P<0.05);细胞周期的检测结果显示,细胞对照组和siRNA对照组细胞中G0/G1期所占比率<50%,而siRNA干扰组细胞中G0/G1期所占比率>70%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在NB细胞中使用siRNA下调Eg5表达,能够抑制NB细胞增殖,促进细胞凋亡。     

RNA干扰PDK-1对5-FU诱导结肠癌细胞凋亡的促进作用

目的探讨以丙酮酸脱氢酶激酶-1(pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1,PDK-1)为靶标的短发夹RNA(shRNA)与化疗药5-氟尿嘧啶(5-FU)联合应用对人结肠癌LS174T细胞的促凋亡作用。方法针对PDK-1序列设计3段干扰序列及1个阴性对照,分别构建pGenesil.1-PDK-1重组质粒表达载体及pGenesil.1-NC阴性对照载体,利用脂质体分别将质粒转染入LS174T,并用G418对细胞进行药物筛选,并通过Real-time PCR和Western blot检测有干扰序列的有效性。MTT实验检测5-FU对干扰组和对照组细胞生长、增殖的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 Real-time PCR和Western blot证实3个干扰组均抑制PDK-1表达,其中最大敲减效率超过70%。MTT实验结果显示,经5-FU同样处理48 h后,PDK-1干扰的LS174T细胞生长抑制率较对照组显著增高(P<0.05);流式细胞仪结果显示,干扰组细胞凋亡率较对照组增高(P<0.05)。结论 PDK-1 shRNA能特异性下调LS174T细胞中PDK-1的表达,PDK-1干扰联合5-FU可促进结肠癌细胞化疗诱导凋亡。     

蛋白酶体抑制剂MG132对人子宫内膜癌HEC-1B和Ishikawa细胞增殖、凋亡和周期的影响

【摘要】 目的 了解蛋白酶体抑制剂三肽基乙醛（Z-Leu-Leu-Leu-cho, MG132）抗人子宫内膜癌HEC-1B和Ishikawa细胞的活性,研究MG132治疗人子宫内膜癌的潜在应用价值。方法 用不同浓度的MG132(0,0.2,0.5,1.0 μmol/L)处理HEC-1B和Ishikawa细胞24 h、48 h,采用MTT法检测MG132对HEC-1B和Ishikawa细胞增殖的影响;应用流式细胞术分别检测0.5 μmol/L MG132处理24 h后两种细胞的凋亡率和细胞周期分布。结果 MG132能抑制HEC-1B和Ishikawa细胞增殖,在本研究浓度范围内MG132浓度增高对两种细胞的抑制作用增强（P<0.01）,48 h抑制作用强于24 h(P<0.01),Ishikawa细胞对MG132的敏感程度大于HEC-1B细胞。MG132处理HEC-1B和Ishikawa细胞后凋亡率均增加（P=0.000）,细胞周期分析显示HEC-1B细胞G2期细胞比例增加（P<0.05）,Ishikawa细胞G1和G2细胞比例增加（P<0.05）。结论 蛋白酶体抑制剂MG132对HEC-1B和Ishikawa细胞有增殖抑制、诱导凋亡和阻滞细胞周期的作用。MG132可能成为潜在的子宫内膜癌化疗药物。