人自噬相关基因LC3B真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建人自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3B,MAP1LC3B)真核表达栽体,并鉴定其生物学功能。方法:通过RT-PCR方法扩增得到人MAP1LC3B cDNA;应用基因重组技术构建pEGFP-N1-LC3B真核表达载体,通过酶切和测序进行鉴定;倒置荧光显微镜下观察EBBS诱导4 h后pEGFP-N1-LC3B表达载体转染的HepG2.2.15细胞质中GFP-LC3B分布的变化。结果:通过测序鉴定,pEGFP-N1-LC3B真核表达载体序列正确,编码框正确;转染后的HepG2.2.15细胞经EBBS诱导4 h后,倒置荧光显微镜检测发现GFP-LC3B由散在分布向点状分布改变。结论:成功构建了人自噬相关基因LC3B真核表达载体,为进一步研究自噬在乙型肝炎病毒中的作用机制奠定了基础。     

自噬相关基因LC3B真核表达载体构建及胃癌细胞自噬的观察

目的:构建人自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)真核表达载体,并鉴定其生物学功能.方法:通过RT-PCR方法扩增得到人LC3B cDNA,应用基因重组技术构建pEGFP-C1-LC3B真核表达载体,通过酶切和测序进行鉴定.将pEGFP-N1-LC3B表达载体转染胃癌细胞MKN1,倒置荧光显微镜观察饥饿诱导后细胞中EGFP-LC3B的表达及分布变化.结果:通过测序鉴定,pEGFP-N1-LC3B真核表达载体序列正确,编码框正确.转染后的MKN1细胞经饥饿诱导后,检测发现EGFP-LC3B由散在分布向点状分布改变,即生成细胞自噬体.结论:成功构建了人自噬相关基因LC3B真核表达载体,并证实饥饿诱导胃癌细胞自噬的发生,为进一步研究自噬在肿瘤中的作用机制奠定了基础.     

围生期甲状腺功能减退对新生仔鼠心肌细胞自噬的影响

目的探讨心肌细胞自噬在仔鼠围生期甲状腺功能减退（简称甲减）致心功能损害中的作用,并观察左旋甲状腺素（L-T4）替代治疗后自噬指标的改变。方法SD孕鼠自孕15d起每日予丙基硫氧嘧啶（PTU）50mg/d灌胃至仔鼠出生并持续整个哺乳期,制成围生期甲减模型,出生仔鼠为甲减组,其余孕鼠每日予0.9%氯化钠溶液灌胃,出生仔鼠为对照组,部分甲减仔鼠自出生当日起予以每日腹腔注射L-T42μg/100g,为治疗组,收集甲减组、治疗组及对照组（每组8只）出生7d龄仔鼠的心室肌组织,采用Westernblot法测定并比较心肌组织自噬相关蛋白LC3与cathepsinD的表达,同时测定并比较血清甲状腺激素水平及CK-MB、LDH与AST水平。结果甲减组仔鼠CK-MB、LDH及AST水平均高于对照组（均P＜0.01）,治疗组仔鼠3者水平均较甲减组下降（均P＜0.01）;甲减组仔鼠LC3II/LC3I及cathepsinD表达水平均高于对照组（均P＜0.01）,治疗组仔鼠2者的表达水平均较甲减组降低（均P＜0.01）。结论心肌细胞自噬在围生期甲减诱发新生仔鼠心功能损害中起重要作用。     

小鼠脑出血后自噬相关蛋白表达及NF-kB信号通路对其调节作用的研究

目的研究小鼠脑出血（ICH）后自噬是否被激活及NF-κB信号通路对ICH诱发的自噬相关蛋白表达的影响。方法正常昆明小鼠纹状体注射胶原酶Ⅳ建立脑出血模型,或于脑出血模型建立前5 min,侧脑室给药SN50（0.1μg/μl）或生理盐水1μl,随机分为脑出血组、SN50处理组和生理盐水处理组,同时设立空白对照组。每组分别于脑出血1 h,6 h,24 h,48 h,7 d后（5只/时间点）断头取脑,脑出血各组取出血区及周边脑组织进行免疫印记实验检测Beclin-1、Bcl-2、LC3蛋白表达水平或激活情况,SN50处理组和生理盐水处理组各时间点取出血区及周边脑组织进行免疫印记实验检测LC3蛋白激活情况。结果小鼠脑出血后出血区及出血周边脑组织Beclin-1蛋白表达上调、Bcl-2蛋白表达下调,以6～48 h时最为显著（P〈0.05）;Beclin-1/Bcl-2比值随时间变化逐渐增高,以6～48 h时最为显著（P〈0.05）;LC3被激活,随时间变化蛋白表达逐渐增加,48 h时达高峰,至7 d时仍较空白对照组有显著差异（P〈0.05）。脑出血后,SN50处理组LC3蛋白激活高于生理盐水处理组,以6～48 h时最为显著（P〈0.05）。结论脑出血后自噬被激活,这种激活的机制之一涉及到Beclin-1/Bcl-2比值的增加;NF-κB特异性抑制剂SN50促进了脑出血后自噬相关蛋白的上调表达。     

TGF-β1通过NF-κB上调成骨细胞自噬的作用

目的 探讨 TGF-β1、NF-κB通路与自噬间关系,为进一步了解牙齿萌出通道形成过程中骨动态平衡调节机制提供新的实验依据。方法 按照加入NF-κB通路阻断剂SN50和TGF-β1浓度不同,将成骨细胞分为以下12组:NC组:无SN50+无TGF-β1; KD1组:无SN50+TGF-β1(0.01ng/ml);KD2组:无SN50+TGF-β1(100ng/ml); KD3组:SN50(6.25μg/ml)无TGF-β1; KD4组:SN50 (6.25μg/ml)+TGF-β1(0.01ng/ml); KD5组:SN50 (6.25μg/ml)+TGF-β1(100ng/ml);KD6组:SN50 (12.25μg/ml)+无 TGF-β1; KD7组:SN50(12.25μg/ml)+TGF-β1 (0.01ng/ml); KD8组:SN50 (12.25μg/ml)+TGF-β1 (100ng/ml); KD9组:SN50 (25μg/ml)+无 TGF-β1; KD10组:SN50(25μg/ml)+TGF-β1(0.01ng/ml); KD11组:SN50 (25μg/ml)+TGF-β1 (100ng/ml)。单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine, MDC)法检测自噬小体形成,Simple Western assays法检测 LC3a蛋白表达。结果 NF-κB通路未被阻断时,TGF-β1可以上调成骨细胞自噬功能,但与浓度无显著相关性。浓度为25μg/ml SN50阻断NF-κB信号通路后成骨细胞自噬功能明显低于对照组,此时,再次加入TGF-β1不能上调成骨细胞自噬水平。结论 TGF-β1可能通过NF-κB影响成骨细胞的自噬功能,具体分子调控机制需进一步研究。     

米诺环素在小鼠视神经钳夹损伤后通过延迟自噬并上调NF-κB2 保护视网膜神经节细胞

目的 本研究目的在于观察米诺环素在小鼠视神经钳夹损伤模型中对视网膜神经节细胞的保护效应以及其作用机制。 方法 钳夹损伤成年雄鼠的左眼,再将小鼠随机分成米诺环素治疗组和生理盐水治疗组。视神经未损伤的小鼠作为正常对照。通过视网膜铺片及βⅢ-tubulin的免疫荧光染色来计数视网膜神经节细胞的密度,透射电子显微镜观察细胞的超微结构,Western-blot 和Real-time PCR 检测LC3-Ⅰ, LC3-Ⅱ, NF-κB1和NF-κB2的表达变化。 结果 在视神经钳夹损伤后早期（4 d和7 d）,米诺环素治疗组的视网膜神经节细胞密度明显比生理盐水治疗组要高,差异有统计学意义。电镜结果显示米诺环素可以阻止损伤后4 d视网膜神经节细胞细胞核和线粒体的损伤。在损伤后4 d和7 d,米诺环素治疗组LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化率明显比生理盐水组低,提示米诺环素可能抑制了细胞自噬。米诺环素在损伤后4 d上调了NF-κB2的基因表达。 结论 本研究说明米诺环素在小鼠视神经损伤后早期对视网膜神经节细胞有保护作用,并且这个神经保护作用可能是通过延迟自噬的进程和调节NF-κB2来实现的。     

外源性硫化氢对肝癌细胞系HepG2自噬的影响

目的探讨外源性硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)对肝癌细胞系Hep G2细胞自噬的影响及其机制。方法应用外源性H2S供体——硫氢化钠(sodium hydrosulfide,Na HS)处理Hep G2细胞,采用Western blotting方法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(microtubule-associated light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)表达变化,Real-time PCR方法检测自噬相关基因beclin1和atg5的mRNA表达浓度,免疫荧光方法观察Hep G2细胞自噬颗粒变化、凋亡相关蛋白M30及凋亡小体变化,Annexin V/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果瞬时转染绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)-LC3质粒后,发现Na HS处理组Hep G2细胞内GFP-LC3Ⅱ绿色荧光斑点明显增加,M30阳性细胞率[(8.37±1.03)%],与对照组[(2.14±0.69)%]比较差异有统计学意义(P<0.05);同时,高倍镜下观察结果显示,Na HS处理后细胞核异染色质明显增加,凋亡小体形成。Annexin V-FITC/PI双染结果显示Na HS处理组细胞凋亡率高于对照组[(16.32±0.28)%vs(0.67±0.09)%],差异有统计学意义(P<0.05)。Real-time PCR显示Na HS可增加Hep G2细胞beclin1和atg5 mRNA表达水平,LC3-Ⅱ表达明显增加。且自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)可降低Na HS所致的beclin1和atg5的mRNA表达。结论外源性硫化氢能够上调自噬相关基因beclin1和atg5表达,进而促进Hep G2细胞发生自噬,并诱导细胞凋亡。     

核转录因子-κB圈套策略对肝癌细胞HepG2凋亡的影响

目的:观察NF-κB圈套寡核苷酸(Decoy ODNs)对NF-κB活性的影响,进一步探讨其对人肝癌细胞HepG2凋亡的作用机制。方法:设计NF-κB圈套寡核苷酸,将FITC标记的NF-κB Decoy ODNs转染HepG2,共聚焦显微镜观察其核内定位,描记生长曲线;凝胶阻滞法(EMSA)检测转染前后NF-κB活性;再分别用流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡情况。Western blot检测HepG2细胞中Bcl-2和Fas的含量。结果:NF-κB Decoy ODNs转染HepG2细胞后定位于胞核,NF-κB活性明显下降,其显著抑制细胞生长,促进HepG2细胞凋亡;低活性NF-κB可以下调Bcl-2、增加Fas的表达水平。结论:NF-κB圈套寡核苷酸促进肝癌细胞HepG2凋亡的机制可能与其下调NF-κB的活性,使促凋亡蛋白Fas表达增加和降低抑凋蛋白Bcl-2表达有关。     

微管相关蛋白与自噬的研究进展

微管相关蛋白和微管蛋白共同控制微管的组装和稳定性,进而调控一些重要的生理过程,例如:调节细胞物质运输,维持细胞形态,细胞分裂分化,肿瘤的发生及自噬的发生.本综述将重点关注于微管相关蛋白与自噬之间的联系.     

PDTC对重度颅脑损伤后NF-κB表达的影响

目的：观察核转录因子-κB（NF-κB）在大鼠创伤性脑损伤（TBI）后脑组织损伤区的表达变化，同时探讨吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）对其表达的影响。方法：参照改良Feeney自由落体脑损伤装置制备大鼠重度脑损伤模型，将72只大鼠随机分为TBI组、PDTC干预组和假手术对照组，每组分别于伤后2h、12h、24h、48h断头，取出损伤区脑组织，检测各组的NF-κBmRNA表达水平。结果：TBI组NF-κB于伤后2h表达增强，12h表达明显增加，24h达到高峰，48h略有下降，与假手术对照组相比差异显著（P〈0．05）。PDTC干预组与TBI组相比，NF—κBmRNA表达明显下降，差异显著（P〈0．05）。结论：大鼠重度TBI后，NF—κB的活化及过度表达参与了继发性脑损伤过程，PDTC可以通过抑制NF—κB的表达，对TBI起到保护作用。     

肾上腺皮质肿瘤中 NF-κB 的表达及意义

目的 探讨NF-κB在肾上腺皮质肿瘤中的表达及其临床意义. 方法 用免疫组化法检测肾上腺疾病标本（肾上腺皮质癌15例,肾上腺皮质瘤30例,肾上腺皮质增生11例,正常肾上腺皮质组织7例）中NF-κB的表达. 结果 NF-кB在肾上腺皮质癌组中阳性表达为9/15例,其中2例（＋ ＋ ＋）,4例（＋ ＋）,3例（＋）,6例（-）;在肾上腺皮质瘤组中,NF-кB阳性表达8/30例,其中0例（＋ ＋ ＋）,2例（＋ ＋）,6例（＋）,22例（-）;增生组有2例阳性,均为（＋）;在正常组中未检测出阳性.在肾上腺皮质癌组中的表达明显高于在其他组中的表达,肾上腺皮质癌组与肾上腺皮质瘤组相比较,差异有统计学意义（P〈0.01）. 结论 NF-кB对肾上腺皮质癌的诊断具有重要意义.     

姜黄素通过抑制NF-κB的活化增加胃癌细胞的放疗敏感性

目的检测姜黄素对胃癌细胞的放疗增敏作用,并探讨其具体分子机制。方法MTr法检测姜黄素对胃癌细胞系增殖的影响。克隆形成实验检测姜黄素对放疗敏感性的影响。胃癌细胞系BGC-823经射线照射并利用姜黄素干预后,利用Westernblot技术检测细胞内p65、pSO、AKT和p-AKT的表达情况。结果姜黄素能够抑制胃癌细胞的增殖及细胞照射后的克隆形成能力。姜黄素能够抑制照射后胃癌细胞中的NF-κB亚基p65和p50的核内表达水平,降低细胞中AKT的磷酸化水平（P〈0．05）。结论NF-κB的活性增高和AKT信号通路的活化可能是导致胃癌细胞放疗敏感性降低的重要途径之一。而姜黄素能够通过抑制NF-κB的表达及AKT信号通路的活化增加胃癌细胞的放疗敏感性。     

氯化两面针碱对肝癌细胞Bel-7402自噬的影响

目的:探讨氯化两面针碱(NC)对肝癌Bel-7402细胞系自噬的影响.方法:选取肝癌Bel-7402细胞株,在透射电子显微镜下观察NC处理Bel-7402细胞24h后吞噬泡、自噬小体、自噬溶酶体等结构;Westernbloting检测微管相关蛋白轻链3(LC3)和P62蛋白表达水平的改变;采用CCK-8法检测不同浓度N...     

多种细胞自噬调节剂对自噬标记物LC3II及p62表达的影响

利用Western杂交检测自噬标记物LC3II和p62的表达是评价细胞自噬活性的常用方法。为了比较作用于不同靶点的细胞自噬调节剂对LC3II和p62表达的影响,分别利用以mTOR依赖或非依赖方式活化细胞自噬的雷帕霉素或海藻糖、抑制自噬起始的3-甲基腺嘌呤、抑制自噬小体与溶酶体融合的巴弗洛霉素A1以及抑制溶酶体酶活性的E64d和pepstatin A处理HEK293细胞,通过Western杂交检测LC3II和p62的表达。结果显示,雷帕霉素增强LC3I向LC3II转化,促进p62降解,而海藻糖仅引起LC3II表达的上调;阻断细胞自噬过程各个阶段均导致LC3II和p62堆积,并呈现出剂量和时间依赖性。这些结果提示尽管LC3II和p62均为自噬标记物,但不同的调节剂对其表达的调控存在差异。     

低剂量阿司匹林诱导产生的自噬减弱其对人肝癌HepG2细胞系的抑制作用

目的 研究一定浓度的阿司匹林对人肝癌HepG2细胞系的增殖抑制作用及产生抑制作用可能的原因.方法 采用MTT法和平板克隆实验研究阿司匹林对人肝癌HepG2细胞增殖活力的影响.吖啶橙荧光染色法观察阿司匹林对人肝癌HepG2细胞内自噬小体的影响.Western blot法检测腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在人肝癌HepG2细胞中的表达.结果 10 mmol/L浓度的阿司匹林能抑制人肝癌HepG2细胞的增殖活力,但增加HepG2细胞中自噬小体的数量,增加AMPK表达,降低 mTOR的表达,且和40 μm自噬抑制剂氯喹(CQ)联合使用时,CQ能够增强10 mmol/L浓度阿司匹林对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用.结论 联合自噬抑制剂CQ减弱浓度为10 mmol/L的阿司匹林诱导产生的自噬从而明显增强其抗HepG2作用.     

氧固醇结合蛋白OSBP L3调节胃癌细胞的自噬和迁移

目的 关于氧固醇结合蛋白OSBPL3在自噬中的作用以及对胃癌迁移的影响鲜有报道.文章旨在探索氧固醇结合蛋白OSBPL3对胃癌细胞自噬和迁移的影响.方法 使用GST-LC3沉淀实验和质谱分析检测LC3的结合蛋白;GST-pulldown实验和免疫共沉淀实验验证OSBPL3与LC3的相互作用;构建OSBPL3过表达胃癌细胞...     

自身免疫调节因子促进THP-1细胞的自噬性凋亡

目的 探讨自身免疫调节因子(AIRE)对THP-1单核细胞凋亡的影响及其可能的分子机制.方法 将THP-1细胞以佛波醇酯(PMA)诱导分化后,进行瞬时转染.免疫荧光和Western blot法检测转染效率.通过Annexin Ⅴ-FITC、PI双染色法和流式细胞仪检测过表达AIRE的THP-1细胞凋亡率.通过间接免疫荧光染色和Western blot检测自噬蛋白LC3B的表达.结果 PMA诱导后,THP-1细胞贴壁生长,形态多样,胞质内可见空泡、吞噬细胞碎片等典型成熟分化形态.转染48 h后,THP-1细胞的AIRE蛋白呈现明显高表达.对比空载体转染和阴性对照,过表达AIRE使THP-1细胞的凋亡率上升;同时,Western blot显示LC3B-Ⅱ的蛋白水平也较空载体转染组增高,且间接免疫荧光染色提示单个细胞的阳性LC3B-Ⅱ斑点数目较空载体转染组明显增加(P＜0.05).结论 AIRE可能通过上调THP-1细胞的自噬促进其凋亡.