逆转录病毒载体转移HyTK基因联合应用Ganciclovir对瘢痕成纤维细胞的体外杀伤作用

逆转录病毒载体转移ＨｙＴＫ基因联合应用Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ对瘢痕成纤维细胞的体外杀伤作用柯正，伍志坚，吴小兵，赵健，韩虹，时安平，彭朝晖１型单纯疤疹病毒胸腺激酶基因（ＨＳＶ－１ＴＫ）和潮霉素磷酸转移酶基因（Ｈｙ）相融合的ＨｙＴＫ基因克隆至逆转录病毒...     

携带人多药抗性基因逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

从ｐＨａｍｄｒｌ／Ａ质粒用ＸｈｏⅠ和ＳａｃⅡ将ｍｄｒｌ基因切下后克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ质粒的相应酶切位点获得测序质粒ｐＢＳｍｄｒｌ，测定了ｍｄｒｌ基因的两端序列。用ＥｃｏⅠＣＲＩ和ＸｈｏⅠ从ｐＢ－Ｓｍｄｒｌ切下ｍｄｒｌ基因，定向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ和ｐＭＳＣＶ２．１，得到携带ｍｄｒｌ基因的逆转录病毒载体ｐＬｍｄｒｌＳＮ和ｐＭＳＣＶｍｄｒｌ。用ＰＡ３１７病毒包装细胞包装后三种携带ｍｄｒｌ基因的病毒具有相似的滴度。用此三种病毒分别感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞后，以ｐＨａｍｄｒｌ／Ａ载体ｍｄｒｌ基因产物表达量最高。提示Ｈａｒｖｅｙ肉瘤病毒的启动子可能具有较高的强度。     

IL-2重组逆转录病毒载体的构建及介导的肝癌特异性基因治疗研究

将小鼠白细胞介素２（ｍＩＬ－２）ｃＤＮＡ全序列克隆到逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ的ＰＬ位点，使其转录受ＳＶ４０早期启动子驱动，构建ｐＭＮＳＭ－ＳＶ４０－ｍＩＬ－２。用小鼠白蛋白增强子／启动子（Ａｌｂｅ／ｐ）置换ｐＭＮＳＭ－ＳＶ４０－ｍＩＬ－２中ＳＶ４０启动子，构建ｐＭＮＳＭ－Ａｌｂｅ／ｐ－ｍＩＬ－２。经酶切鉴定符合要求。将重组体用磷酸钙共沉淀法导人逆转录病毒包装细胞ｐＡ３１７中，用所得的重组病毒在８μｇ／ｍｌＰｏｌｙｂｒｅｎｅ存在条件下体外感染小鼠肝癌细胞（ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ、ＢＮＬＩＭＥ）、黑色素瘤…     

DNA修复蛋白MGMT基因的克隆及转导脐血CD23^＋细胞后耐药特征的研究

目的：增强脐血ＣＤ３４＾＋造血细胞对化疗药物的耐药表型,探讨逆转录病毒介导的基因转移效率和耐药基因特性,以及在脐血造血干细胞保护性基因治疗中的作用和意义。方法：应用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从人肝细胞中获得编码六氧甲基鸟嘌呤－ＤＮＡ－甲基转移酶（Ｏ＾６－ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ－ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ,ＭＧＭＴ）ｃＤＮＡ;利用基因重组技术,将其克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ质粒载体并构建了逆转录病毒载体Ｇ１Ｎａ－ＭＧＭＴ;应用脂质体ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ基因转移法将后者导入ＧＰ＋Ｅ８６和ＰＡ３１７病毒包装细胞,以卡氮芥１,３－Ｂｉｓ（２－Ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）－１－Ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ（ＢＣＮＵ）加压筛选后的阳性克隆上清经乒乓效应后继而感染脐血ＣＤ３４＾＋细胞。应用ＰＣＲ,Ｓｏｕｔｈ     

携带人多药抗性基因逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中的…

从ｐＨａｍｄｒｌ／Ａ质粒用ＸｈｏⅠ和ＳａｃⅡ将ｍｄｒｌ基因切下后克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ质粒的相应酶切位点获得测序质粒ｐＢＳｍｄｒｌ，测定了ｒｄｒｌ基因的两端序列。用ＥｃｏⅠＣＲＩ和ＸｈｏⅠ从ｐＢＳｍｄｒｌ切下ｍｄｒｌ基因，定向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ和ｐＭＳＣＶ２．１，得到携带ｍｄｒｌ基因的逆转录病毒载体ｐＬｍｄｒｌＳＮ和ｐＭＳＣＶｍｄｒｌ。用ＰＡ３１７病毒包装细胞包装后三种携带ｍ     

不同载体对癌胚抗原DNA疫苗诱导小鼠产生抗—CEA水？…

目的 将癌胚抗原（ＣＥＡ）基因克隆入载体ｐｃＤＮＡ３及ＶＲ１０１２中，比较两套重组质粒在体内表达并诱导小鼠产生抗－ＣＥＡ的差别。方法 通过基因工程技术构建两套ＣＥＱ真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ＣＥＡ及ＶＲ１０１２－ＣＥＡ，将重组质粒肌注ＢＡＫＢ／ｃ小鼠，运用ＥＬＩＳＡ法检测不同时间肌肉组织表达ＣＥＡ水平及血清中抗－ＣＲＡ的产生。结果 ｐｃＤＮＡ３－ＣＥＡ在肌肉内呈低表达ＣＥＡ，最高时为０．１８ｍｇ／     

含I-A~dα和β链cDNA的三顺反子逆转录病毒载体构建及真核表达

为了协同表达MHCII类分子的两个链α和 β ,利用脑心肌炎病毒和脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入位点 ,构建了含MHCII类分子α和 β链及选择标记新霉素磷酸转移酶基因的三顺反子逆转录病毒载体。经包装细胞包装成重组逆转录病毒后 ,感染NIH3T3、MM45T Li、COS7细胞 ,经PCR、RT PCR、Southern印迹、Northern印迹及流式细胞术在多水平上证实了α链和 β链的基因表达和MHCII类分子的正确组装。     

携带绿色荧光蛋白的逆转录病毒载体的构建及其初步应用

目的构建带有快速筛选基因标记的逆转录病毒载体。方法构建携带绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因的逆转录病毒载体（ＧＣＧＦＰＰＸＳＮ），转染包装细胞系ＰＡ３１７，荧光显微镜及流式细胞仪观察结果。结果构建了一个携带快速筛选标记ＧＦＰ的逆转录病毒载体，其转染包装细胞系后在荧光显微镜及流式细胞仪（ＦＡＣＳ）中直接观察到该基因表达。应用该包装细胞系转染Ｔ细胞后第２天即表达绿色荧光蛋白，并可用ＦＡＣＳ进行分选。结论携带ＧＦＰ的逆转录病毒载体能够有效转染哺乳类动物细胞，与新霉素筛选基因相比，具有快速、简便的优点     

逆转录病毒载体介导乙型肝炎病毒反义基因的转录表达

为了探索在真核细胞内转录表达乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）反义核酸的方法，用基因重组技术将ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因（ＰｒｅＣ／Ｃ）和前Ｓ／Ｓ基因（ＰｒｅＳ／Ｓ）片段反向插入逆转录病毒载体质粒，再将重组体分别转染ＰＡ３１７包装细胞，进而获得能够介导ＨＢＶ反义基因向小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞转移表达的重组逆转录病毒。经分子杂交试验表明，含有ＨＢＶ反义基因的重组逆转录病毒序列已经整合到转染的ＰＡ３１７细胞染色体上；转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。结论：逆转录病毒载体包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞中转录表达，因而有可能利用反义技术和基因转移方法进行抗－ＨＢＶ基因治疗     

不同载体对癌胚抗原DNA疫苗诱导小鼠产生抗-CEA水平的影响

目的　将癌胚抗原（ＣＥＡ） 基因克隆入载体ｐｃＤＮＡ３ 及ＶＲ１０１２ 中,比较两套重组质粒在体内表达并诱导小鼠产生抗ＣＥＡ 的差别。方法　通过基因工程技术构建两套ＣＥＡ 真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ＣＥＡ 及ＶＲ１０１２ＣＥＡ,将重组质粒肌注ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠,运用ＥＬＩＳＡ 法检测不同时间肌肉组织表达ＣＥＡ 水平及血清中抗ＣＥＡ 的产生。结果　ｐｃＤＮＡ３ＣＥＡ 在肌肉内呈低表达ＣＥＡ,最高时为０－１８ｎｇ／ ｍｇ 肌肉（ 胫前肌） ,而ＶＲ１０１２ＣＥＡ 表达量为０－９３ｎｇ／ ｍｇ 肌肉,但两重组质粒诱导小鼠产生的抗ＣＥＡ 的水平相差不大,均大于１ ２００ 。结论　ＤＮＡ 疫苗诱导的免疫反应不仅取决于其在体内的表达抗原量,质粒结构中的免疫激活序列（ＩＳＳ） 对免疫反应也起重要的调节作用。     

Reassessment of the 12q15 deletion syndrome critical region

Interstitial deletions of the long arm of chromosome 12 are rare and only few cases have been reported in literature so far, with different phenotypic features related to size and gene content of deleted regions. Five patients reported a 12q15-q21 deletion, sharing a 1.3 Mb small region of overlap (SRO) and presenting with developmental delay, nasal speech and mild dysmorphic features.We identified by microarray analysis a new case of 12q15 deletion. Our patient clinical features allow the refinement of the SRO to CNOT2, KCNMB4, and PTPRB genes, improving genotype-phenotype correlations.     

Differential expression of mRNA encoding interleukin-12 p35 and p40 subunits in situ

Interleukin-12 (IL-12) is a heterodimeric cytokine that plays an important role in the regulation of the immune response. For biological activity the expression of both subunits of IL-12, p35 and p40, is required. Moreover, in the mouse the p40 chain of IL-12 specifically inhibits the effects of the IL-12 heterodimer. In the present study we have analyzed by in situ hybridization the expression of the p35 and p40 mRNA in the spleens of BALB/c and mutant (SCID, nude, beige) mice, unstimulated and after in vivo stimulation with lipopolysaccharide (LPS) and with staphylococcal enterotoxin B (SEB). In unstimulated spleens of BALB/c mice, p35 and p40 mRNA were only detectable in a few strongly stained single cells, p35 mRNA was expressed in addition weakly in the B cell areas. After injection of LPS or SEB, p40 mRNA was strongly induced in the T cell areas all over the spleen, whereas expression of p35 mRNA and its distribution pattern did not change. Surprisingly, most of the mRNA for p35 and p40 was localized in different areas of the spleen and was apparently produced by different cells. In macrophage-depleted spleens the increased expression of p40 mRNA in response to LPS was reduced but still detectable, demonstrating that other cells besides macrophages can up-regulate IL-12 p40 mRNA. Nude mice showed a stronger expression of p35 mRNA, SCID mice lacked the weak p35 staining of the B cell areas but showed a strong basal expression of both p35 and p40 mRNA and a focal response to LPS. The pattern of IL-12 mRNA expression in beige mice was the same as in normal mice. These data demonstrate a spatial dissociation of expression of the two chains of IL-12 and are compatible with a regulatory role of the isolated IL-12 p40 chain in vivo. In addition, they indicate that the demonstration of mRNA for both chains of IL-12 in whole tissues or cell mixtures is not necessarily indicative of functional IL-12.     

IL-12对BALB/c小鼠Th17细胞的分化的影响

目的: 观察细胞因子IL-12对Th17细胞分化的影响.方法: 小鼠脾淋巴细胞经抗CD3单克隆抗体(mAb)和不同浓度的重组小鼠IL-12刺激, 3 d后使用ELISA方法观察培养物上清液中IL-17的产生情况.并使用细胞内细胞因子染色的方法, 通过流式细胞术观察CD3 mAb和重组小鼠IL-12刺激对Th1和Th17细胞分化的影响.结果: Th17细胞不分泌IFN-γ、 IL-5、 IL-10等细胞因子, 不表达Foxp3, 是一个独立的细胞亚群.不同浓度的重组小鼠IL-12可以诱导抗CD3 mAb 的T细胞分泌IFN-γ, 并向Th1细胞方向分化.同时, IL-12可以抑制活化的T细胞分泌IL-17, 抑制T细胞向Th17细胞分化.结论: IL-12可以抑制Th17细胞的分化.     

五加皮抗肿瘤活性物质Age对单核细胞产生TNF-α和IL-12的影响

目的 :研究五加皮抗肿瘤成分Age对单核细胞功能的影响 ,揭示Age抗肿瘤机制。方法 :使用对TNF敏感的L92 9细胞采用生物法测定了TNF含量 ,用ELISA法测定了IL 12的含量。用RT PCR法分析了单核细胞的细胞因子mRNA表达。用同位素法分析了Age对单核细胞吞噬功能的作用。结果 :Age与单核细胞共同培养后 ,单核细胞TNF α、IL 12等细胞因子的产生明显增加 (P <0 0 1) ,而且有较好的量效关系。在单核细胞与LPS的培养液中加入不同浓度的Age ,经培养后与单独加入LPS相比TNF α分泌的量显著增加 ,显示了Age对LPS的单核细胞刺激有相加作用。经Age处理后 ,单核细胞的TNF α、IL 12等细胞因子的mRNA表达也明显增强。体内实验结果也显示 ,Age对单核细胞的细胞因子产生有一定的影响。荷瘤小鼠经口连续投入Age后 ,血清中和脾脏分离的单核细胞体外培养上清中TNF α和IL 12含量明显提高 ,单核细胞TNF α、IL 12mR NA表达也明显增强 (P <0 0 1) ,从蛋白水平和分子水平证明了Age对单核细胞的细胞因子产生有促进作用。结论 :中药五加皮抗肿瘤有效成分Age对单核细胞有较强的刺激作用。通过促进其细胞因子的分泌和吞噬功能的增强杀伤肿瘤或抵抗肿瘤发生 ,所分泌的细胞因子还可通过调节免疫功能达到治疗肿瘤作用。该结果对五加皮     

应用重组PCR技术克建人单链白细胞介素12融合基因

目的 构建人单链白细胞介素１２（ｈｓｃＩＬ－１２）融合基因并在真核细胞中进行表达,为进一步研究ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白的生物学活性奠定基础。方法 应用重组ＰＣＲ技术将ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位两段编码序列的ｃＤＮＡ通过一疏水性多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３碱基序列进行前后拼拼（ＩＬ－１２ｐ４０－多肽接头－ｐ３５）,构建ｈｓｃＩＬ－１２融合基因,并进行核苷酸序列测定,进一步将ｈｓｃＩＬ－１２融合基因插入ｐｃＤＮＡ３．１真核表达载体中,转染ＣＯＳ－７细胞表达ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白,并行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果 该融合基因经ＤＮＡ序列分析表明：ｐ４０、ｐ３５、ｌｉｎｋｅｒ的连接顺序、方向及序列完全正确,融合基因可在ＣＯＳ－７细胞中表达ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示该融合蛋白分子     

锌指蛋白KOX12单克隆抗体的制备及在肿瘤组织中的表达

目的：制备重组锌指蛋白KOX12（肿瘤相关蛋白）,并制备其特异性的单克隆抗体,用免疫组化观察它在肿瘤组织中的表达。方法：通过逆转录-酶链聚合反应（RT-PCR）得到KOX12 cDNA片段,构建真核表达质粒和原核表达质粒,在大肠杆菌M15和293T细胞中进行表达。以KOX12蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,用聚乙二醇（PEG）融合法进行细胞融合制备产生抗KOX12单克隆抗体的杂交瘤细胞株;该抗体用免疫组化法对结肠癌、肺癌组织进行染色。结果：构建了含KOX12的真核细胞和原核细胞的表达质粒,并表达及纯化了KOX12重组蛋白,建立了产生抗KOX12单克隆抗体的杂交瘤细胞株6C8,酶联免疫吸附试验（ELISA）和蛋白质免疫印迹试验（Western blot）显示6C8对KOX12有高度的特异性,免疫组化染色结果提示在结肠癌组织和肺癌组织切片中有少数细胞呈阳性反应。结论：6C8单克隆抗体是锌指蛋白KOX12特异的单克隆抗体,该抗体为IgG1型、k链亚类免疫球蛋白。在肺癌组织及对肠癌组织中有阳性细胞可见。该文为KOX12蛋白的研究工作创造了一个平台,为肿瘤的防治提供了一条新的可能途径。     

人IL-12表达质粒联合含信号肽Mtb8.4基因疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果

目的研究结核分枝杆菌含信号肽Mtb8.4(MS)基因疫苗与人白细胞介素12(hIL-12)联合免疫小鼠后,诱导的细胞免疫应答及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。方法将40只C57BL/6N小鼠随机分为联合免疫组(MS基因疫苗 hIL-12组)、MS基因疫苗组、卡介苗(BCG)组、空载体组和PBS组。将基因疫苗、空载体和PBS,经肌内注射免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,共免疫3次;BCG组经尾部皮下注射1×106CFU BCG免疫1次。采用ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中细胞因子的水平;用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫小鼠细胞毒性T细胞的杀伤活性。用结核杆菌强毒株H37Rv静脉攻击小鼠后,计数肺和脾组织中结核杆菌的菌落数。对小鼠的部分肺和脾组织作病理切片,经HE染色观察组织病变的程度,经ZN染色检查抗酸杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果联合免疫组能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,免疫小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ和IL-2的水平,与BCG组相当,显著高于MS基因疫苗组,IL-4分泌减少,特异性CTL的杀伤活性增强,对小鼠结核杆菌感染有较好的免疫保护效果。表现为小鼠肺和脾组织中结核杆菌的菌落数显著减少,组织病变明显减轻,其效果与卡介苗(BCG)组相当,但优于MS基因疫苗组。结论以hIL-12表达质粒与MS基因疫苗联合免疫后,能显著增强MS基因疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。     

ADAM12在产前诊断中的的研究进展

ADAM12是新发现的细胞膜结合糖蛋白家族的一员，它在妊娠期妇女血清中水平显著增高，在胎儿染色体缺陷时降低，它的发现为临床筛查治疗疾病提供了新的靶点。     

共表达不同水平的IL-12对于HBV DNA疫苗质粒免疫原性的影响

目的 在HBsAg DNA疫苗质粒中共表达IL-12佐剂分子,研究IL-12的表达水平对于HBV DNA疫苗质粒免疫原性的影响.方法 构建携带来源于中国地区C型HBV参照序列CHN-HBV07-C经密码子优化的preS2-S基因的DNA疫苗质粒pHBV,并将3个不同IL-12表达水平的佐剂分子表达盒序列分别克隆入该疫苗质粒中,通过瞬时转染293T细胞以检测重组质粒IL-12分子及乙肝表面抗原的表达情况.将不同IL-12表达水平的疫苗质粒免疫BALB/c雌性小鼠,IFN-γ的ELISPOT方法检测HBsAg抗原特异性的细胞免疫应答,化学发光定量ELISA法检测HBsAg特异的抗体水平.结果 成功构建3个不同IL-12表达水平的HBV DNA疫苗质粒,293T细胞转染结果显示:不携带IL-12分子表达盒的对照疫苗质粒pHBV的HBsAg表达水平可达70 ng/ml;低表达IL-12的疫苗质粒pHBV-12l的HBsAg表达水平为18 ng/ml;而高表达IL-12的重组疫苗质粒pHBV-12h的HBsAg表达水平仅为6 ng/ml.BALB/c小鼠的免疫结果表明:高表达IL-12分子的疫苗质粒pHBV-12h所诱导的细胞免疫及体液免疫水平相对于对照疫苗质粒pHBV均显著降低了.低表达IL-12分子的疫苗质粒pHBV-12l所诱导的抗体水平也显著降低了,但其细胞免疫应答水平却显著提高了.结论 在同一疫苗质粒中,高表达IL-12分子的质粒可能会影响到抗原蛋白的表达,而低表达IL-12分子的疫苗质粒却能增强细胞免疫应答.因此,平衡好佐剂分子及抗原蛋白的表达水平对于诱导高水平的免疫应答是个重要的因素.     

电离辐射与腺病毒介导的IL-12基因联合治疗Lewis肺癌的实验研究

目的：研究AdCMVIL-12基因与电离辐射联合治疗Lewis肺癌的疗效及其副作用。方法：应用腺病毒为载体，采取瘤内注射的方法将IL-12基因导入Lewis肺癌细胞中，结合肿瘤的局部放疗，并同时设计了不同的治疗方案，观察联合治疗是否能增加疗效。结果：联合治疗组明显好于单独AdCMVIL-12组及单独照射组。结论：电离辐射与AdCMVIL-12基因联合治疗Lewis肺癌能提高疗效，两种疗法之间有协同增效的作用。