植物超氧化物歧化酶的制备工艺研究

目的优化植物超氧化物歧化酶（SOD）的制备工艺。方法用热变性沉淀、等电点沉淀，45％，90％硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析，冷冻浓缩干燥等方法，从黄瓜中制备SOD，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量，用NBT光还原法测定SOD活性。结果SOD酶比活为89．2381U·mg^-1，回收率为18．41％，提纯倍数为11．02倍。结论该工艺简便高效地从植物中提纯超氧化物歧化酶，可用于生产实际。     

人铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆、表达、发酵及纯化工艺研究

 目的:用基因工程的方法获得人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,Zn-SOD)的高产菌,通过发酵培养,最后纯化获得大量廉价的高纯度的hCu,Zn-SOD?方法:用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增了人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,Zn-SOD)的cDNA,将此正确测定的cDNA重组到分泌型表达载体pET-22b(+)中,重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中用5L全自动发酵罐表达hCu,Zn-SOD,表达产物用亲和层析一步法进行纯化?结果:hCu,Zn-SOD表达产物占菌体总蛋白的30%,发酵水平酶活力可达950u·ml^-1培基,比活为1400u·mg^-1,经亲和层析后纯度可达88%,活力回收率大于80%,比活大于5000u·mg^-1?结论:我们开展人重组SOD的研究不仅大大丰富了应用酶学的内容,而且积极开展应用研究,实现产业化,意义重大?     

附子多糖后处理对缺氧/复氧乳鼠心肌细胞锰超氧化物歧化酶表达的影响

目的:观察附子多糖后处理对缺氧复氧心肌细胞的保护,并以锰超氧化物歧化酶(MnSOD)表达为着眼点,探讨其作用机制。方法:建立乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型,将乳鼠心肌细胞分为正常对照组、缺氧/复氧组、缺氧后适应组、附子多糖(0.1mg/ml、1mg/ml、10mg/ml)后处理组。缺氧/复氧组给予心肌细胞缺氧3h后复氧6h;缺氧后适应组在细胞缺氧3h后,复氧前即给予3个循环的5min,复氧/5min缺氧,随后复氧6h;附子多糖后处理组在缺氧3h后,将心肌细胞换入含附子多糖浓度分别为10mg/ml、1mg/ml、0.1mg/ml的培养液中常规培养6h。流式细胞仪测定心肌细胞线粒体凋亡率和线粒体膜电位,荧光定量PCR测定Bcl-2mRNA和MnSODmRNA的表达量,黄嘌呤氧化酶法检测细胞内MnSOD的活性。结果:与缺氧/复氧组相比较,予10mg/ml浓度的附子多糖后处理可以有效保护线粒体膜电位的稳定,促进Bcl-2mRNA的表达,抑制心肌细胞凋亡的发生。附子多糖可有效促进MnSOD基因表达和增加MnSOD的活性,并呈一定的浓度依赖性。结论:附子多糖后处理对缺氧/复氧后心肌细胞具有保护作用,其机制可能与附子多糖促进锰超氧化物歧化酶的表达合成,保护线粒体,抑制细胞凋亡有关。     

重组人细胞因子基因在转基因中药细胞中的瞬时表达

目的 利用转基因中药表达人细胞因子基因，探讨培育基因修饰（GM）中药的可行性，方法 将体外扩增分别获得的人α-干扰素基因与RANTES基因酶切回收后插入中间载体，用EcoRI和HindⅢ双酶切鉴定重组子，由大肠杆菌分离重组质粒并导入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens，通过加入卡那霉素（Km)和利福平（Rif)筛选含重组双元载体的转化子，用叶盘共培养法转化苦瓜和夏枯草外植体。结果 经RT-PCR检测到人α-干扰素基因与RANTES基因在中药转化愈伤组织中的瞬时表达。结论 首次报道了重组人α-干扰素基因与RANTES基因在转基因苦瓜和夏枯草细胞中的表达。为探讨利用转基因中药抗病毒尤其是抗艾滋病开创了新途径。     

重组人成骨蛋白-1在大肠杆菌中的高效表达及复性

 目的研究重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)的发酵、纯化和复性。方法将构建好的重组质粒pBV221转化Escherichia coliBL21,迅速升温至42℃诱导rhOP-1以包涵体的形式高效表达。裂菌后利用6mol·L^-1尿素溶解目的蛋白,经SP-FastFlow离子交换色谱纯化后,利用cysteine/cystine对单体rhOP-1透析复性。结果rhOP-1的表达量占菌体总蛋白质量的33%,纯化后纯度可达98%,活性得到有效恢复。结论建立了rhOP-1发酵、纯化与复性的方法,获得高表达、高纯度、有活性的rhOP-1。     

重组人Cu,Zn-SOD包含体的复性、纯化及复性蛋白稳定性研究

 目的通过体外复性和纯化技术获得具有高纯度、高生物活性的重组人铜锌超氧化物歧化酶(rhCu,Zn-SOD),并研究复性蛋白的稳定性。方法以透析法对在大肠杆菌中以包含体形式表达的rhCu,Zn-SOD进行复性,采用金属螯合亲和层析对复性样品进行纯化,通过酶活性测定考查复性和纯化的rhCu,Zn-SOD的热稳定性、pH稳定性和对变性剂的稳定性。结果建立了体外透析复性的基本条件,其比活可达2 380 U·mg^-1。该复性样品经金属螯合亲和层析纯化后,结果得到纯度大于95%、比活5 000 U·mg^-1、活性回收率大于100%的目的蛋白。复性和纯化蛋白在温度25～70℃和pH 5.0～10.5内活性稳定,并可耐受2～10 mol·L^-1的尿素和2%～8%的十二烷基硫酸钠(SDS),对更强烈的变性剂盐酸胍稳定性较弱。结论确定了重组人Cu,Zn-SOD包含体的体外复性条件和复性蛋白纯化方法,且复性蛋白表现出很好的稳定性,为重组人Cu,Zn-SOD的生产奠定了良好基础。     

人参茶的工艺研究

目的：寻找人参茶的最佳加工工艺。方法：对人参茶的组成比例,乙醇浓度及干燥温度用正交试验设计方法。对人参总皂甙和单体皂甙Re,Rg1为指标进行工艺考察,实验测定分别用比色法和双波长薄层扫描法。结果：当红参与白参比例为1：6,乙醇浓度为50％,60℃干燥时,人参皂甙Rg1含量最高（P＜0．05）。当红参与白参比例为1：5时,人参皂甙Re含量最高（P＜0．05）.其余因素对Re含量无显著影响,各因素对各皂甙含量的影响不显著。     

重组人干细胞生长因子(rhSCF)生物活性测定方法研究

 目的 建立rhSCF生物活性测定方法。方法 分别采用MTT比色法与琼脂集落培养法进行rhSCF生物活性测定。结果 两种方法对同批次rhSCF成品测定结果无显著性差异。结论由于MTT比色法操作简便、稳定性好,可以替代琼脂集落培养法,使rhSCF测定更加准确、可行。     

聚乙醇化重组人生长激素的免疫原性及药动学研究

目的：研究聚乙二醇化重组人生长激素的免疫原性及药动学。方法：用rhGH及其两种mPEG修饰物PGH1、PGH2免疫家兔，检测免血清中的抗体滴度；对家兔单次背部皮下给药，定时取血清，建立rhGH及其修饰物的ELISA双抗夹心检测法，检测血清中的药物浓度，并计算药动学参数。结果：经过mPEG修饰后，明显降低了rhGH的抗体滴度，缩短了抗体持续时间。在药动学研究中发现，其t1／28从3.1h显著延长到PGHI的9.9h和PGH2的22.5h，其AUC也有很大的提高。结论：mPEG修饰后可明显降低rhGH的免疫原性，延长药物在动物体内的半衰期，降低清除率，改善其药动学性质。且改善程度随mPEG相对分子质量的增大而增强。     

重组人胰高血糖素样肽前药的表达、纯化及生物活性分析

 目的建立重组人胰高血糖素样肽前药(prodrug of recom binant human GLPs,Pro-rhGLPs)的表达、纯化方法,研究Pro-rhGLPs对体内血糖水平及血清胰岛素水平的影响。方法采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG,0.01mmol·L^-1)诱导原核表达系统E.coli BL21(DE3)/pET32a(+)-hGLPs表达Pro-rhGLPs,12%SDS-PAGE检测蛋白表达量,Ni-NTA亲和层析纯化Pro-rhGLPs,应用Westernblot在体外观察前体药物的活性分子释放过程。在C57BL/6小鼠上进行葡萄糖耐量实验检测其生物学活性,不同时间间隔取血测定血糖及血清胰岛素水平。在糖尿病db/db小鼠上观察其降糖作用。结果所构建的Pro-rhGLPs原核表达系统中,Pro-rhGLPs表达量约为细菌总蛋白的50%。纯化得到的蛋白纯度达到95.43%,并且可以在特异性酶作用下缓慢降解,释放出多个胰高血糖素样肽1(GLP-1)分子。纯化的Pro-rhGLPs呈剂量依赖性降低血糖浓度,同时升高血清胰岛素水平。等剂量Pro-rhGLPs的降糖作用较GLP-1作用更强。结论建立了Pro-rhGLPs高效表达、纯化方法,获得了高纯度Pro-rhGLPs,对糖尿病小鼠具有明显的降血糖作用。     

重组人血小板生成素联合白介素-11衍生物治疗化疗所致血小板减少症的临床观察

目的研究重组人血小板生成素（rhTPO）联合白介素-11衍生物（rhIL-11Ala10）治疗化疗所致血小板减少症的临床疗效和安全性。方法选取郑州大学第一附属医院2012年6月-2013年6月接受化疗期间出现血小板（Pit）≤50×logm的实体瘤患者32例,采用自身交叉对照试验的办法将患者随机分为AB、BA两组,每组均接受两阶段治疗。A疗程为化疗结束后12-24h皮下注射rhTPO1．5×10。U／次,1次／d,连续给药2d后换用rhlL-11Ala10皮下注射,1．5mg／次,1次／d;B疗程为化疗结束后12-24h单用rhlL-11Alam皮下注射1．5mg／次,1次／d。AB组第一阶段为A疗程,第二阶段为B疗程,BA组恰好相反。A、B疗程的治疗过程中当Plt的绝对值升高≥50×10。／L,或P1t≥100×109／L,或用药达14d即可停药。监测所有患者血小板生长情况和不良反应。结果联合用药与单一用药卡¨比,化疗后血小板下降的最低值平均升高5×109／L,血小板恢复的最高值平均升高78×109／L,持续用药的天数5F均缩短了3．7d,且不良反应发生率低。结论联合应用rhTPO和rhlL-11Ala10治疗化疗后血小板减少症的临床效果更优,更经济,更安全。     

聚乙二醇化重组人生长激素对去垂体幼鼠胰岛分泌的影响及其机制

目的观测长效生长激素聚乙二醇化重组人生长激素（PEG-rhGH）是否引起胰岛素抵抗及其与短效生长激素注射用重组人生长激素（rhGH）的差异。方法3周龄SD雄性幼鼠106只,随机取88只进行去垂体手术造模,取成模的幼鼠54只分为模型组、rhGH组、PEG-rhGH组,另18只假手术组为对照组。分别给予生理盐水（0．25mg·kg-1．d-1）、rhGH（0．25mg·kg-1．d-1）、PEG-rhGH（1．4mg·kg-1周-1）处理。4周后进行糖耐量实验和胰岛素释放试验,计算胰岛素曲线面积与葡萄糖曲线面积比值,胰岛素稳态模型（HOMA-IR）;检测血清生长抑素水平;免疫组织化学法检测胰岛胰岛素（INs）、胰高血糖素（GLU）、生长抑素（SS）、胰多肽（PP）。结果PEG-rhGH组HOMA-IR较对照组、模型组低（P〈0．05）,与rhGH组比较无差异。AUCI／AUCG值组间比较显示PEG-rhGH组高于rhGH组,但无统计学差异。PEG-rhGH组GLU蛋白表达与模型组表达无差异。PEG-rhGH组INS表达较模型组表达上升（P〈0．05）。PEG-rhGH组SS、PP表达与rhGH无差异。血清SS各组间均无明显差异。结论未观察到PEG-rhGH引起去垂体大鼠胰岛素抵抗和胰岛D细胞分泌能力下降,对胰岛分泌蛋白的表达无明显影响。     

半乳糖化重组人生长激素的制备及其肝靶向性

 目的:将重组人生长激素(rhGH)进行半乳糖化修饰,制得半乳糖化重组人生长激素(Gal-rhGH),并研究其在小鼠体内的分布特征。方法:以D-半乳糖为原料,制得双功能试剂 2-亚氨基-2-甲氧基乙基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷(IME),利用IME与重组人生长激素的碱性氨基酸偶合,制得Gal-rhGH。以¹²⁵I标记Gal-rhGH和rhGH,iv,比较其在小鼠体内的组织分布。结果:差热分析(DTA)证实Gal-rhGH是共价偶联物,平均糖密度为5。Iv后,¹²⁵I-rhGH-Gal浓集于肝脏,最大分布量是¹²⁵I-rhGH的2.3倍;在胃脏,最大分布仅为¹²⁵I-rhGH的43%。Gal-rhGH在血、肝、肾、心、肺、脾、肠中全组织相对放射性分布的ACU分别是rhGH的60%,1.55倍,58%,31%,95%,43%,67%。结论：成功地制备了化学偶联物Gal-rhGH,小鼠体内分布表明其具有明显的肝靶向性。     

15例尿毒症患者应用rHuEpo的药代动力学研究

 报道了１５例尿毒症患者，ｉｖ和ｓｃｒＨｕＥｐｏ的药代动力学。用ＥＬＩＳＡ法测定血清ｒＨｕＥｐｏ浓度，用３Ｐ８７软件处理药浓度。时间数据。ｉｖ的药代动力学符合线性二室模型，其主要动力学参数Ｔ＿（１／２），Ｖ，Ｃｌ和ＡＵＣ＿（０～∞）分别为５．４５±１．４８ｈ，７９．７±５２．２ｍｌ／ｋｇ，０．３０５±０．２９８（ｍｌ·ｍｉｎ）／ｋｇ和５２９５．９±３６６１．２（ｍＵ·ｈ）／ｍｌ。ｓｃ的药代动力学符合线性一室模型，其主要的药代动力学参数Ｔ＿（ｍａｘ），Ｃ＿（ｍａｘ），Ｔ＿（１／２）和ＡＵＣ＿（０～∞）分别为１０．２±５．７ｈ，３７．２±１９．２ｍＵ／ｍｌ，１７．６±８．１ｈ和１６２０．３±８６０．７（ｍＵ·ｈ）／ｍｌ。单次ｓｃ后，血药浓度约为ｉｖ相同剂量时峰浓度的５％。占ｓｃ组５０％的患者，ｓｃ后约０．５ｈ才从血清中测到ｒＨｕＥｐｏ浓度。ｓｃ组较ｉｖ组浓度。时间曲线下总面积小。此外还比较了ｉｖ和ｓｃ的临床价值。     

重组人生长激素聚乙交酯-丙交酯微球体外释放度研究

 目的 研究重组人生长激素(rhGH)聚乙交酯-丙交酯共聚物微球体外释放规律,并考察附加剂对药物释放的影响。方法 以分子排阻色谱法测定34 d释放液中rhGH含量。考察①不同有机溶剂;②不同比例PLGA;③外水相中加入缓冲盐;④内水相中加入乳化剂;⑤rhGH投入量不同对微球释放的影响。结果制备载生长激素聚乙交酯-丙交酯(PLCA)微球时,采用醋酸乙酯或二氯甲烷做溶剂对微球中药物释放没有显著性影响;采用不同比例PLGA对微球释放有显著性影响,其中以乙交酯:丙交酯=75:25比例的PLGA累积释放量最高;外水相中加入缓冲盐,内水相中加入乳化剂使累积释药量降低;随着生长激素投药量的增加,累积释药量增加。结论 重组人生长激素聚乙交酯-丙交酯共聚物微球体外释放有显著的长效作用,释放速度受到前面5种因素的影响。     

国产与进口重组人胰岛素注射液Beagle犬皮下注射的生物等效性研究

目的以美国礼来公司重组人胰岛素注射液（优泌林R,Humulin R）为对照品,评价国产重组人胰岛素注射液（Insulin R）的相对生物利用度和生物等效性。方法采用自身随机交叉给药方案,12只健康Beagle犬分别sc同剂量Insulin R和Humulin R,按设计采集6 h内动态血标本。采用罗氏血糖仪与检测血药浓度同步测定动物血糖水平;放射免疫分析（RIA）法检测血药浓度;试验数据采用DAS 3.0药动学程序拟合计算参数,并进行生物等效性分析。结果 Beagle犬自身交叉sc Insulin R和Humulin R 0.5 U/kg后的血浆最低葡萄糖浓度（Cmin）分别为（1.6±0.4）、（1.6±0.2）mmol/L;达到最低浓度所需时间（tmin）分别为（1.0±0.5）、（1.1±0.6）h。Insulin R和Humulin R的主要药动学参数均值分别为：达峰时间（tmax）为（0.43±0.21）、（0.42±0.09）h;峰浓度（Cmax）为（203.2±63.3）、（193.5±63.1）μU/m L;药时曲线下面积（AUC0-6 h）为（281.2±47.5）、（266.6±62.5）μU/（m L·h）;受试药Insulin R相对于对照药Humulin R的相对生物利用度为（109.4±25.5）%。结论两种重组人胰岛素注射剂在健康Beagle犬体内具有生物等效性。     

不同剂量重组人脑利钠肽治疗心力衰竭的研究

目的评价不同剂量冻干重组人脑利钠肽(rhBNP)治疗心力衰竭的疗效。方法将36例急性失代偿性心力衰竭或慢性心力衰竭急性发作患者随机分为小剂量组(n=20)和大剂量组(n=16)。按照1.5μg/kg的剂量静脉推注后,小剂量组以0.01μg/(kg.min)继续维持治疗24~48 h,大剂量组以0.015μg/(kg.min)维持治疗24~48 h。分析2组患者血浆NT-pro BNP水平、临床症状改善情况、出院时心功能分级、住院死亡率、住院时间、24 h尿量及不良反应。结果2组患者使用不同剂量新活素后,血浆NT-pro BNP都有明显降低,24 h尿量明显增加,且以大剂量组改善更为显著(P0.05),但2组患者整体症状改善情况、出院时NYHA分级、住院时间、住院死亡率均无显著性差异(P均0.05)。结论不同剂量的新活素对急性心力衰竭患者的NT-pro BNP2、4 h尿量的改善不同,但并不影响患者出院时NYHA分级、住院时间、住院死亡率及整体症状的改善。     

幼仓鼠肾细胞表达重组人红细胞生成素在猕猴中的药动学

 目的：研究幼仓鼠肾(BHK)细胞表达红细胞生成素(EPO)在猕猴体内的药动学。方法：ELISA法测定血清浓度。结果：iv200u·kg^-1后符合二室开放模型，t_1/2α和t_1/2β分别为(1.8±0.3)h和(11.3±1.7)h?Sc50，200和800u·kg^-1后符合一级吸收一室模型，t_1/2Ke分别为(10.5±3.2)h?(10.0±1.3)h和(7.4±1.0)h，吸收速率受剂量限制，t_{1/2F=8.2，P<0.05)。tmax分别为(3.0±1.2)h,(4.0±0.0)h和(5.5±1.9)h。AUC随剂量增加，Cls相近，生物利用度为0.64。结论：EPO体内总过程基本符合线性药动学，方法学与结果对人体研究有参考意义。}     

人类重组促红细胞生成素治疗中老年慢性肾性贫血观察

目的　观察国产和进口人类重组红细胞生成素 (rhEPO)治疗中老年慢性肾功能衰竭伴肾性贫血的疗效。方法　将 76例慢性肾功能衰竭伴肾性贫血患者随机分为 2组 ,分别采用国产和进口rhEPO进行皮下注射 ,剂量为每周 6 0 0 0IU。治疗 12周后观察全血红细胞数(RBC)、红细胞压积 (Hct)以及肾功能变化。结果　两组患者在用药过程中血红蛋白 (Hb)、Hct、RBC均逐渐上升 ,两组患者相同时间疗效比较无显著性差异 ,且均无明显不良反应。结论　国产rhEPO治疗中老年慢性肾性贫血疗效与进口同类产品相同 ,在治疗过程中需补充铁剂。