不同载体及靶基因对乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫效果的影响

目的　探讨不同DNA载体及靶基因对DNA疫苗免疫效果的影响.方法　用已构建的不同载体HBVS基因疫苗(pCR3.1-S,pcDNA3-S)和HBVC基因疫苗(pCR3.1-C)分别给BALB/c小鼠多点肌肉注射,2wk后追加免疫1次,用ELISA法及MTT法分别检测小鼠血清抗-HBs及HBc及脾细胞对HBsAg或HBcAg的特异性增殖反应.结果　免疫接种2wk后小鼠血清抗-HBc抗体均明显高于对照组,载体pCR3.1的表达效力稍高于pcDNA3,但同一基因不同载体间无显著差异.不同靶基因血清抗体滴度及脾细胞对HBsAg或HBcAg的刺激指数均明显高于对照组,刺激指数pCR3.1-C组明显高于…     

乙型肝炎病毒基因疫苗免疫小鼠的初步研究

为构建编码HBV表面抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S,将它直接肌肉注射BAIB/c小鼠,以ELISA法检测免疫小鼠血清,另用~3H-TdR掺入法测定淋巴细胞增殖活性。结果表明,HBV基因疫苗pCR3.1-S可诱发小鼠产生体液和细胞免疫应答。     

汉坦病毒S基因0.7 kb片段真核载体的构建、表达及基因免疫

目的 在本室前期工作的基础上,进一步进行汉坦病毒S基因0．7kb片段的真核表达及基因免疫的研究。方法 构建汉坦病毒76－118株S基因5'端700bp片段的真核表达载体pcDNA3.1-S0.7,脂质体转染COS－7细胞,免疫荧光检测表达结果;用该质粒免疫BALB／c小鼠,并用免疫荧光法及ELISA法检测免疫的体液免疫应答效果。结果 免疫荧光检测结果表明,目的基因在COS－7细胞中获得瞬时表达;用pcDNA3.1-S0.7基因免疫小鼠可引起抗汉坦病毒核蛋白（NP）特异性的抗体应答。结论 汉坦病毒S基因0．7kb片段可刺激机体产生特异的抗汉坦病毒体液免疫应答。为进一步进行细胞免疫反应的检测及基因疫苗的研究提供实验基础。     

基因转染Sp2/0细胞作为检测乙肝病毒基因疫苗细胞免疫效应的靶细胞的研究

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)S基因转染的Sp2/0细胞作为检测HBV基因疫苗细胞免疫效应的靶细胞的可行性.方法以脂质体介导基因转染,含G418的培养基筛选,获得HBV基因S转染的Sp2/0细胞;构建编码HBV抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为HBV基因疫苗;采用51Cr 4 h释放法体外检测HBV基因疫苗免疫接种小鼠的淋巴细胞杀伤功能.结果与空载体对照组相比较,HBV基因疫苗诱发Balb/c小鼠产生较好的HBV特异的细胞免疫应答(P＜0.05).结论以Sp2/0基因转染细胞作为靶细胞检测免疫BALB/c小鼠的淋巴细胞杀伤功能是可行的.     

中国汉坦病毒H8205株G1-G2-人源IL-2融合基因DNA免疫的实验研究

目的评价融合基因 pcDNA3.1/HisB- IL- 2- G1- G2的 DNA免疫效果. 方法肌注免疫小鼠,分次采血,用酶联免疫法( ELISA)直接免疫酶斑减少中和试验检测小鼠体液免疫;淋巴细胞增殖试验( MTT法)检测其细胞免疫应答.免疫后第六周感染病毒.间接免疫荧光试验( IFIA)观察免疫小鼠抗病毒感染能力. 结果 pcDNA3.1/HisB- IL- 2- G1- G2可诱导小鼠产生特异性抗汉坦病毒抗体和中和抗体,其效价均高于其他对照组,差异显著( P< 0.05). MTT实验表明, pcDNA3.1/HisB- IL- 2- G1- G2诱导小鼠脾细胞对病毒抗原的增殖指数明显高于其他对照组. IFIA结果显示免疫小鼠对病毒攻击有保护性. 结论 pcDNA3.1/HisB- IL- 2- G1- G2可诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答,为新一代汉坦病毒( HTV) DNA疫苗开发提供了实验依据.     

含CpG基序的寡核苷酸对乙型肝炎病毒基因疫苗的细胞免疫效应的影响

目的探讨人工合成的CpG ODN作为佐剂对乙肝病毒基因疫苗诱导小鼠产生细胞免疫应答的影响.方法构建编码乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为HBV基因疫苗,人工合成含CpG基序(motif)的硫代磷酸寡核苷酸(CpG ODN)作为佐剂,观察其对HBV基因疫苗接种Balb/c小鼠诱导产生淋巴细胞增殖和淋巴细胞杀伤等细胞免疫应答的影响.结果与空载体对照组相比较,HBV基因疫苗诱发Balb/c小鼠产生较好的HBV特异的淋巴细胞增殖及杀伤效应(P＜0.05);应用CpGODN组与未应用组相比较,免疫小鼠产生更强的HBV特异性细胞免疫应答(P＜0.05).结论CpG ODN作为佐剂,对HBV基因疫苗诱导Balb/c小鼠产生细胞免疫应答具有促进作用.     

IL-12的真核表达载体对乙肝基因疫苗的免疫佐剂效应

观察编码鼠IL - 12的真核表达载体对HBVDNA疫苗诱导Balb/c小鼠免疫应答的影响。方法 :肌肉注射DNA疫苗 ,ELISA法检测小鼠血清抗HBs,4h51Cr释放法检测小鼠脾细胞CTL杀伤活性。结果 :免疫8周后 ,注射 pCR3.1组、注射 pCR3.1-S组及共注射IL - 12真核表达载体的血清OD值分别为 0 .0 4± 0 .0 1、0 .87± 0 .1及 1.6 7± 0 .15。CTL细胞杀伤活性分别为 (10 .1± 6 .4) %、(5 0 .5± 6 .4) %及 (73.3± 8.8) % ,后两组与pCR3.1组比较均有显著差异 (P <0 .0 0 1) ,后两组比较亦有显著差异 (P <0 .0 5 )。脾细胞悬液经抗CD4 单克隆抗体处理后分别为 (48.3± 5 .9) %、(75 .6± 9.1) % ,抗CD8 单克隆抗体处理后分别为 (10 .6±1.4) %、(16 .9± 2 .3) %。结论 :IL - 12的真核表达载体能够提高小鼠对DNA疫苗的免疫应答 ,CTL细胞杀伤活性主要由CD8 执行。     

插入CpG序列和IL—2基因的HBV重组真核表达载体的构建

目的：构建插入CpG序列和IL-2基因的HBV重组真核表达载体。方法：采用PCR产物直接克隆方法,构建了编码HBsAg基因的真核细胞表达载体pcDNA3.1^ -HBsAg;并以此为基础通过重组DNA技术分别构建了在不同位置含不同数目的CpG序列的重组质粒pcDNA3.1^ -S/CpG1、pcDNA3.1^ -S/CpG2、pcDNA3.1^ -S/CpG1 CpG2及IL-2和HBsAg融合基因的表达载体pcDNA3.1^ -S/IL-2。通过脂质体基因转移技术导入Cos-7细胞中检测其瞬间表达。结果：通过酶切、PCR及测序证实已分别正确完整地插入IL-2基因和CpG序列,体外转染Cos-7细胞后可见基因的表达和分泌,结论：本实验成功构建了我们所设计的5种重组质粒,拟为今后探索优化基因疫苗的设计及HBV治疗性疫苗的研究奠定基础。     

IL-12对乙型肝炎DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的影响

目的　观察编码鼠 IL - 12的真核表达载体对 HBVDNA疫苗诱导 BAL B/ c小鼠免疫应答的影响 .方法　肌肉注射 DNA疫苗 ,EL ISA法检测小鼠血清抗 HBs,4h5 1 Cr释放法检测小鼠脾细胞 CTL杀伤活性 .结果　免疫 8wk后 ,单纯注射 p CR3.1- S及共注射 IL - 12真核表达载体的小鼠血清 45 0 nm A值分别为 0 .87± 0 .1及 1.6 7± 0 .15 .CTL 细胞杀伤活性分别为 (5 0 .5± 6 .4) %及 (73.3± 8.8) % ,两组均有明显差异 (P<0 .0 1) ,脾细胞悬液经抗 CD4+ 单克隆抗体处理后 CTL 细胞杀伤活性分别为 (48.3± 5 .9) % ,(75 . 6±9.1) % ,抗 CD8+单克隆抗体处理后分别为 (10 .6± 1.4) % ,(16 .9± 2 .3) % .结论　 IL - 12的真核表达载体能够提高小鼠对 DNA疫苗的免疫应答 ,CTL细胞杀伤活性主要由 CD8+执行 .基因疫苗可能用于预防及治疗 HBV感染     

CpG ODN联合HBsAg免疫BALB/c小鼠和HBV转基因C57BL/6J小鼠

目的:探讨人工合成硫代修饰的含CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)作为佐剂对HBsAg诱导BALB/c和HBV转基因小鼠产生免疫应答的影响. 方法: 用人工合成CpG ODN与血源HBsAg联合免疫BALB/c和HBV转基因C57BL/6J小鼠,采用ELISA方法观察小鼠血清HBsAg及抗-HBs水平,用ELISPOT方法判断CpG ODN对HBsAg免疫小鼠脾T淋巴细胞分泌细胞因子的影响. 结果: CpG ODN联合HBsAg免疫BALB/c小鼠较HBsAg单独注射组同期抗-HBs滴度明显提高,尤其在首次免疫后6、8、12 wk,2组比较差异显著(P<0.05),联合免疫较CpG ODN单独免疫自首次免疫后4 ～16 wk差异显著(P<0.05).与HBsAg,CpG ODN 单独免疫比较,联合免疫能使HBsAg特异性分泌IFN- γ T细胞分别增加3或9倍;CpG ODN,HBsAg联合免疫可诱导转基因小鼠产生抗-HBs,随时间延长,抗体滴度逐渐升高,并能使更多小鼠产生抗体,而单用HBsAg组、CpG ODN组均不能诱导抗-HBs的产生,免疫后各组血清HBsAg浓度较免疫前明显下降(P <0.05),但组间无明显差别(P>0.05),与HBsAg,CpG ODN 单独免疫比较,联合免疫能使HBsAg特异性分泌IFN- γ T细胞分别增加3或11倍. 结论: CpG ODN作为佐剂可增强HBsAg诱导BALB/c小鼠产生体液及细胞免疫应答,CpG ODN ,HBsAg联合免疫可打破HBV转基因小鼠对HBsAg免疫耐受,可望成为慢性乙型肝炎的有效预防和治疗性疫苗.     

小鼠对HBV DNA疫苗的免疫应答及细胞因子的免疫佐剂效应

目的 :观察编码小鼠 IL- 2及 IL- 12的真核表达载体 ,对 HBV DNA疫苗诱导 Balb/ c小鼠 (H- 2 d )免疫应答的调节作用及其对稳定表达 HBs Ag的小鼠肥大细胞瘤 P815细胞 (P 815 - HBV- S)成瘤性的影响。　方法 :肌内注射HBV DNA疫苗及细胞因子真核表达载体 ;背部皮下接种 P 815 - HBV - S细胞 ,观察成瘤情况 ;EL ISA法测定血清抗HBs;4h5 1 Cr释放法检测小鼠脾细胞 CTL 活性。　结果 :免疫 8周后 ,以 p CR3.1- S、p CR3.1- S+IL- 2及 p CR3.1-S+IL- 12免疫的小鼠血清 ,45 0 nm A值分别为 0 .87± 0 .1、1.98± 0 .17及 1.6 7± 0 .15 ,均较 p CR3.1组显著提高(P<0 .0 5 )。CTL 细胞杀伤活性分别为 (5 0 .5± 6 .4) %、(6 1.9± 7.1) %及 (73.3± 8.8) % ,后两组与 p CR3.1- S组比较差异均显著 (P<0 .0 5 )。脾细胞悬液经抗 CD4+ 单克隆抗体处理后 ,CTL细胞杀伤活性分别为 (48.3± 5 .9) %、(5 6 .2± 7.5 ) %和 (75 .6± 9.1) % ,抗 CD8+ 单克隆抗体处理后分别为 (10 .6± 1.4) %、(13.6± 1.9) %和 (16 .9±2 .3) %。对照组成瘤率为 10 0 % ,p CR3.1- S组小鼠成瘤率为 12 .5 % ,p CR3.1- S+IL- 12真核表达载体组成瘤率为0 ,对照组平均存活期和 6周后存活率分别为 2 8.4天和 0天。后两组分别 >38.2天及 45     

佐剂CpG ODN对HBV基因疫苗诱导抗体产生的影响

目的 探讨人工合成的ＣｐＧ ＯＤＮ作为佐剂对乙肝病毒基因疫苗诱导小鼠产生抗ＨＢｓ的影响。方法 构建编码乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）表面抗原蛋白Ｓ的重组真核表达质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ作为ＨＢＶ基因疫苗,人工合成含ＣｐＧ ｍｏｔｉｆ的硫代磷酸寡核苷酸作为佐剂,以ＢＡＬＢ／ｃ小鼠作为实验动物进行免疫接种,采用ＥＬＩＳＡ法检测免疫小鼠的抗ＨＢｓ应答。结果 与生理盐水作为佐剂组相比较,应用ＣｐＧ ＤＯＮ组小鼠产生更     

IL-12对乙肝病毒全S基因疫苗免疫效应的影响

目的：探讨IL-12对乙型肝炎病毒全S基因疫苗的免疫效果的影响。 方法：BABL/c小鼠分为对照组、HBV全S基因表达质粒单独免疫组（pcDNA3-PS）及pcDNA3-PS联合IL-12表达质粒免疫组（pcDNA3-PS＋IL-12）,免疫后6周测血清抗HBs,T细胞增殖反应实验及IL-2和IFN-γ水平。 结果：pcDNA3-PS＋IL-12组抗HBs滴度、刺激指数（SI）、细胞因子水平均较pcDNA3-PS增高,差异有显著性;两免疫组抗HBs滴度、SI和细胞因子水平均较对照组增高,差异有显著性。 结论：HBV全S基因疫苗可刺激小鼠产生特异性免疫,IL-12对HBV全S基因疫苗具有免疫佐剂效果。     

IL—12提高DNA疫苗诱导小鼠抗HBV皮下移植瘤的免疫研究

目的 观察ＩＬ－２真核表达载体（ｐＷＲＧ３１６９）对ＨＢＶ－ＳＤＮＡ疫苗（ｐＣＲ３．１－Ｓ）诱导Ｂａｌｂ／ｃ小鼠（Ｈ－２＾ｄ）的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达ＨＢｓＡｇ的小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５细胞（Ｐ８１５－ＨＢＶ－Ｓ）成瘤性的影响。方法肌肉注射ＤＮＡ疫苗,背部皮下接种Ｐ８１５－ＨＢＶ－Ｓ细胞,观察成瘤情况,４ｈ＾５１Ｃｒ释放法检测小鼠脾细胞ＣＴＬ活性。结果 对照组、ｐＣＲ３．１－Ｓ及共同免疫     

HBV adr亚型基因疫苗诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答

目的：构建乙型肝炎病毒（HBV)adr亚型基因疫苗pCMV-S2.S(PS），观察其诱导小鼠所产生的特异性体液和细胞免疫应答。方法：将PS注射于C57BL／6小鼠胫骨前肌内，应用ELISA方法检测不同时间小鼠血清中抗HBs抗体以及采用^51Cr释放实验检测淋巴细胞杀伤功能。结果：注射基因疫苗1周后，血清中抗HBs抗体转阳，4周后抗体达到高峰，并以高水平维持至少8周；第12周时PS诱导小鼠产生了良好的HBV特异的细胞免疫应答（P＜0.05）。结论；所构建的HBV adr亚型基因疫苗PS能够诱导小鼠产生较好的体液和细胞免疫应答。     

白细胞介素-2对乙型肝炎病毒基因疫苗免疫效应的影响

目的　构建表达乙型肝炎病毒 (HBV)S蛋白的重组质粒pCR3 .1 -S作为基因疫苗 ,观察重组人白细胞介素 - 2 (rhIL - 2 )作为佐剂对其诱导BALB/c小鼠产生免疫应答的影响。方法　以不同剂量IL - 2作为佐剂 ,生理盐水作为对照 ,测定不同免疫组的血清抗HBs、淋巴细胞增殖活性、淋巴细胞杀伤活性 ,比较不同免疫组间体液和细胞免疫应答的差异。结果　抗HBsELISA滴度 ,IL - 2组与对照组比较差异无显著性 (P >0 .0 5) ;淋巴细胞增殖指数、淋巴细胞杀伤率 ,IL - 2　 1 0 0 0U/ (只·次 )组、IL - 2　 2 0 0 0U/ (只·次 )组与对照组比较差异有显著性 (P <0 .0 5) ,而IL - 2　 50 0U/ (只·次 )组与对照组比较差异无显著性 (P >0 .0 5)。结论　一定剂量的IL - 2作为佐剂可增强HBV基因疫苗的免疫效应。     

白细胞介素2增强HBV基因疫苗的免疫效应

目的：构建乙型肝炎病毒基因疫苗ｐＣＲ３．１－Ｓ,观察重组人白细胞介素２（ｒｈＩＬ－２）作为佐剂对其诱导ＮＡＬＢ／ｃ小鼠产生免疫应答的影响．方法：以ＥＬＩＳＡ法检测免疫小鼠血清抗ＨＢｓ,另用＾３Ｈ－ＴｄＲ参入法测定淋巴细胞增殖活性,初步研究不同免疫组的体液和细胞免疫应答．结果：ｒｈＩＬ－２组免疫小鼠抗ＨＢｓ抗体和淋巴细胞增殖活性与对照组相比有显著差异（Ｐ〈０．０５）．结论：ＨＢＶ基因疫苗可诱发ＢＡＬ     

HIV-1CNgp120与IL-6基因共表达质粒的构建及其免疫调节作用

目的 研究白细胞介素－6对人类免疫缺陷病毒（HIV）gp120基因免疫小鼠后效果的调节作用。方法 构建表达中国流行株HIV－1gp120基因的核酸疫苗质粒pGP及共表达中国流行株HIV－1gp120基因与IL－6基因的核酸疫苗质粒pGPIL-6,并检测其在哺乳动物细胞中的表达。将上述两种质粒经胫前股注射BALB／c鼠,检测gp120抗体的产生情况及ConA和LPS诱导的T细胞增殖能力。结果 以间接免疫荧光法（IFA）检测到gp120在哺乳动物细胞中得到表达。pGPIL-6与pGP均可刺激小鼠产生抗gp120抗体,协同注射gp120和IL－6基因的小鼠产生的抗体滴度明显高于单独注射gp120的小鼠,pGPIL-6免疫鼠对ConA和LPS诱导的T细胞增殖能力明显高于单独注射gp120的小鼠。结论 协同应用IL－6基因可明显加强HIV－1gp120基因的免疫反应,为中国流行株HIV－1核酸疫苗的可行性提供了重要实验依据。