含绿色荧光蛋白基因的子宫内膜异位症体外模型的建立

目的 由腺病毒介导绿色荧光蛋白基因转染子宫内膜细胞,构建子宫内膜异位症体外模型.方法 取5例正常子宫内膜组织,分离子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞,进行形态学观察和免疫荧光鉴定.用携带有绿色荧光蛋白基因的腺病毒转染细胞,比较转染后12、18、36、42h细胞的绿色荧光蛋白表达阳性率和凋亡率的差异.结果 分离培养获得高纯度的子宫内膜腺上皮细胞(90%)和基质细胞(接近100%).两种细胞均表达绿色荧光;与腺上皮细胞比较,基质细胞转染率明显增高(F=8.362,P=0.020),凋亡率明显降低(F=46.119,P<0.001);转染对细胞的凋亡率无明显影响(F=4.208,P=0.057).结论 利用腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因载体转染子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,可获得相对稳定的体外荧光子宫内膜异位症模型.     

子宫内膜增殖症诊治研究进展

<正>子宫内膜增殖症病灶位于子宫内膜,是一类妇科常见的增生性疾病,好发于围绝经期女性[1]。患者临床常表现为子宫异常出血、宫腔积液、阴道异常排液及下腹疼痛等。本研究就子宫内膜增殖症诊治的研究进展作一综述。1 发病机制子宫内膜增殖症主要危险因素可能为子宫内膜受雌激素异常刺激,而无孕激素抵抗,机体受内外源性雌激素持续上升的影响,在孕激素拮抗丢失而子宫内膜腺体持续生长繁殖的情况下,内膜无法经增殖期过渡至分泌期,导致子宫内膜异常增生[2]。内     

育龄期功血患者子宫内膜中雌二醇和孕酮水平及其受体表达的变化

目的探讨育龄期功血患者子宫内膜中雌二醇（E2）和孕酮（P）水平及其受体表达的变化。方法回顾性分析60例育龄期功能失调性子宫出血（功血组）患者临床资料,并选择30例健康体检育龄妇女为对照组,比较两组子宫内膜组织中雌激素、孕激素以及相关受体的差异。结果功血组子宫内膜E2水平显著升高,P水平显著下降（P〈0．05）。血清E2和子宫内膜E2水平呈正相关,r=0．684,P〈0．01,血清P与子宫内膜P呈正相关,r=0．584,P〈0．01。功血组雌二醇受体（ER）、孕酮受体（PR）和凋亡指数均显著升高（P〈0．01）。结论育龄期功血患者子宫内膜组织中雌激素水平升高、孕激素水平下降,其相应的受体表达升高。     

超排卵着床期小鼠子宫内膜LIF表达与雌孕激素的关系

目的研究超排卵对围着床期小鼠子宫内膜LIF表达的影响及其与雌孕激素的关系,探讨超排卵是否影响子宫内膜容受性的形成。方法将实验动物随机分为超排卵妊娠组和正常妊娠对照组,分别选取动情周期当天、合笼后发现阴道栓第2天、第4天、第6天、第8天共五个时间点取小鼠子宫内膜,用免疫组化和原位杂交法测定小鼠子宫内膜LIF的蛋白表达和LIF mRNA的表达,同时分别测定小鼠血清雌、孕激素水平。结果正常妊娠组小鼠LIF蛋白在围着床期子宫内膜上的表达动情周期较低,在妊娠之后开始上升,在妊娠第4天（即小鼠孕卵着床当天）达到最高峰（P〈0.05）,继之在子宫内膜的表达下降,在妊娠第8天降到非孕期水平;超排卵组小鼠围着床期子宫内膜LIF蛋白随着妊娠天数而表达增加,在妊娠第2天达到最高峰（P〈0.05）,继之在子宫内膜的表达下降,在妊娠第8天降至非孕期水平。超排卵组与对照组相比较,其在妊娠第2天的表达明显高于对照组（P〈0.05）,在妊娠第4天的表达明显低于对照组（P〈0.05）;超排卵组和对照组小鼠血清雌、孕激素浓度均随妊娠天数的增加逐渐升高,在各时间点超排卵组的雌、孕激素水平明显高于对照组（P〈0.05）。小鼠子宫内膜LIF蛋白的表达与雌激素水平在一定范围内成正相关,超过一定临界水平后呈负相关（P〈0.05）,而与孕激素未发现有相关性（P〉0.05）。结论超排卵可能对小鼠围着床期子宫内膜LIF蛋白的表达有影响,使其表达峰值提前,由此推测影响子宫内膜容受性的建立;体内雌激素水平与围着床期子宫内膜LIF蛋白的表达有相关性,但尚不能排除孕激素水平与其有相关性,说明LIF蛋白的表达与雌激素的调控有关,并且可能存在一定的数量关系。     

模拟微重力条件下奥金肽对MC3T3-E1前成骨细胞增殖的影响

目的：研究模拟微重力（simulated microgravity,SMG）条件下奥金肽（osgentide, OST）对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖功能的影响。方法在正常细胞培养环境下,利用MTT法检测6种OST化合物对MC3T3-E1细胞增殖的影响,从中筛选出有效作用浓度的化合物,进一步利用 MTT 实验及流式细胞术分别检测 SMG 条件下1 nmol／L OST5对MC3T3-E1细胞的增殖效应及细胞周期的分布。结果在正常细胞培养环境下,1 nmol／L OST5对MC3T3-E1细胞的增殖具有显著促进作用（P＜0．01）。 MTT实验结果表明,与正常细胞培养环境相比,MC3T3-E1细胞在SMG条件下其增殖受到显著抑制。在SMG条件下,用1 nmol／L OST5处理MC3T3-E1细胞（ OST-SMG）3 d,流式细胞术检测结果表明,SMG促使更多的MC3T3-E1细胞进入G1期。1 nmol／L OST5处理MC3T3-E1细胞后S期比例比SMG条件下显著提高（P＜0．05）,表明OST5能够促进DNA合成。结论在SMG条件下,OST5能够促进成骨细胞的增殖,为研究OST5对模拟微重力相关的骨丢失防治提供了理论依据。     

雌、孕激素受体蛋白在子宫肉瘤中的表达及其相关性研究

目的检测雌激素受体ERα、ERβ（estrogen receptorα、estrogen receptorβ）和孕激素受体PRA、PRB（progesteronereceptor A、progesterone receptor B）在子宫肉瘤中的表达及其相关性。方法选取子宫肉瘤患者66例,采用石蜡病理切片,用免疫组织化学染色法检测雌、孕激素受体蛋白的表达情况并分析其相关性。结果 3种肉瘤组分别与正常子宫肌层对照组ERα蛋白阳性率比较均有统计学差异（均P〈0.01）;子宫内膜间质肉瘤组分别与子宫平滑肌肉瘤组、子宫癌肉瘤组PRA蛋白、PRB蛋白阳性率比较均有统计学差异（均P〈0.05）。结论雌激素受体ERα、ERβ和孕激素受体PRA、PRB在3种肉瘤组织和正常子宫肌层组织中均有表达。在子宫内膜间质肉瘤组织中ERα与PRA、PRB表达有相关关系且均呈正相关。     

MC002诱导人喉癌细胞Hep-2凋亡及其作用机制

目的与雷公藤内酯醇（PG490）进行比较,观察雷公藤内酯醇衍生物MC002对人喉癌Hep-2细胞体外增殖的抑制作用及其分子机制。方法以MC002和PG490分别处理人喉癌细胞Hep-2,采用噻唑蓝比色法（MTT）检测药物对Hep-2细胞的增殖抑制作用并计算IC50值;利用软琼脂克隆形成实验观察细胞的锚定非依赖性生长能力;选用Hoechst33258染色法观察细胞凋亡的形态学变化;用ROS检测试剂盒分析药物对细胞活性氧水平的影响;以实时荧光定量PCR技术（Realtime-PCR）检测细胞凋亡相关因子Bcl-2及Bax mRNA水平的表达变化。结果 MC002及PG490均对体外培养的人喉癌Hep-2细胞有增殖抑制作用,且具有剂量依赖性,IC50值分别为183.58nmol/L和119.35nmol/L,而且两种药物可以抑制细胞的锚定非依赖性生长能力;此外,MC002及PG490可以降低ROS水平,并且使凋亡相关因子BaxmRNA表达上调,Bcl-2mRNA表达下调。结论 MC002具有与PG490相同的作用,可以抑制人喉癌细胞株Hep-2的生长,诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡,其机制可能与调节凋亡相关因子Bcl-2、Bax及ROS的表达有关。     

表皮生长因子对脂肪干细胞体外增殖、迁移和凋亡的影响

目的 研究表皮生长因子(EGF)对脂肪干细胞体外增殖、迁移和凋亡的影响.方法 利用无血清培养基建立体外细胞生长饥饿模型和Fas配体(FasL)诱导的凋亡模型,观察10 nmol/L和100 nmol/L的EGF对脂肪干细胞体外增殖、迁移和凋亡的影响,并检测影响上述过程相关细胞通道蛋白磷脂酶C-γ(PLC-γ)、胞外信号调控激酶(ERK)和丝/苏氨酸激酶(AKT)的表达. 结果10 nmol/L和100 nmol/L的EGF均能有效促进脂肪干细胞体外增殖、迁移和抗凋亡作用,且影响上述过程的相关信号通道蛋白的表达均发生上调.结论 EGF能有效促进脂肪干细胞体外增殖、迁移和抗凋亡.     

组织工程化子宫片层构建的实验研究

目的利用组织工程方法体外构建了与子宫壁内膜和肌层相近的子宫片层。方法将分离培养的兔子宫平滑肌细胞和基质细胞分别与液态Ⅰ型胶原支架材料混合,依次接种于自制静态力学拉伸模具中,再将上皮细胞接种在基质层上,形成组织工程化子宫组织。采用组织学和免疫组织化学方法观察所构建的组织工程化子宫的组织学特征,扫描电镜检测上皮细胞微结构。结果分离培养的兔子宫平滑肌细胞、基质细胞和内膜上皮细胞的纯度均达到95％以上。在静态力学拉伸下培养14天后,在胶原凝胶上生长的平滑肌细胞和基质细胞按拉伸方向有序排列,上皮细胞生长在最上层。激素处理后,扫描电镜观察显示上皮细胞表面有羽状突或纤毛,并且附有大量的微绒毛。结论由平滑肌细胞、基质细胞、上皮细胞和Ⅰ型液态胶原构建,并经静态力学拉伸构建的组织工程化子宫片层能较好地模拟自然子宫的形态结构和功能。     

抑癌基因PTEN在孕三烯酮诱导子宫内膜异位症细胞凋亡中的作用

目的　研究抑癌基因PTEN在孕三烯酮诱导体外培养的子宫内膜异位症细胞凋亡中的作用。方法　以不同浓度的孕三烯酮对体外培养人子宫内膜异位症细胞进行处理 ,MTT法测算孕三烯酮作用 0～ 4 8h对子宫内膜异位症细胞的抑制情况并绘制生长曲线 ;取 2 4h为作用时间 ,透射电镜观察细胞超微结构变化 ,流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期 ,应用PTEN单克隆抗体经由流式细胞仪分析细胞内PTEN的表达。结果　细胞生长曲线显示孕三烯酮对子宫内膜异位症细胞的生长增殖有显著的抑制作用 ,且呈时间 剂量 效应关系 ;透射电镜观察发现 ,孕三烯酮可诱导子宫内膜异位症细胞发生典型的凋亡形态学改变 ;流式细胞仪检测显示 1× 1 0 -6mol/L和1× 1 0 -4mol/L浓度的孕三烯酮作用 2 4h后 ,子宫内膜异位症细胞的凋亡率分别为 1 3%和 1 5 0 % ,与对照组相比差异显著 ;同时细胞内PTEN的表达有不同程度的上调。结论　孕三烯酮能明显抑制子宫内膜异位症细胞的生长增殖 ,这一作用可能与上调PTEN的表达及诱导细胞凋亡有关     

子宫内膜细胞的培养和侵袭性研究

为探讨不同子宫内膜细胞在子宫内膜异位症(EM）发病机制中的作用，体外分离培养EM患者和对照组子宫内膜共49例。观察间质和上皮细胞的形态学特点，并采用Transwell—Col Insert细胞培养板，比较不同细胞的侵袭行为。结果显示，间质细胞侵袭能力强于上皮细胞；EM组子宫内膜细胞侵袭力强于对照组。提示在子宫内膜异位种植过程中，间质和上皮细胞可能具有不同的功能；EM患者子宫内膜本身具有不同于对照组的特性，使其更易于异位种植生长。     

白介素8和干扰素α对离体培养的子宫内膜细胞的影响

目的　探讨白介素 8(IL 8)和干扰素α(IFN α)对体外培养的子宫内膜异位症患者的子宫内膜细胞的影响。方法　收集患者的子宫内膜组织进行体外培养、纯化 ,采用免疫组织化学的方法鉴定纯化的细胞。在培养基中加入不同浓度的IL 8(0 1、1、5、10、5 0ng/ml)和IFN α 2b(10、5 0、10 0、10 0 0、10 0 0 0U/ml) ,对腺上皮细胞进行培养 ,2 4h后用MTT法检测细胞增殖的状况。同时 ,用含有 1ng/mlIL 8的培养基对内膜细胞进行培养 ,2 4h后用透射电镜观察IL 8对腺上皮细胞和间质细胞的影响。结果　细胞的增殖与IL 8的含量有着明显的剂量依赖关系 ,并且在IL 8浓度为 10ng/ml时最为显著(P <0 0 5 )。电镜观察发现在 1ng/ml的IL 8的作用下 ,内膜细胞功能活跃 ,分泌旺盛 ,可见细胞外有胶原产生。而IFN α 2b对腺上皮细胞的增殖却有明显的抑制作用 (P <0 0 5 )。结论　本研究明确了IL 8和IFN α 2b对内膜细胞的影响 ,并且发现IL 8可以使内膜细胞分泌胶原纤维增多 ,这可能在子宫内膜异位症的发病机制中起着重要作用。IL 8可能是通过自分泌或者旁分泌的方式参与发病的。IFN α 2b是一类免疫正调因子 ,它可以调节子宫内膜异位症患者的免疫功能。免疫刺激疗法有可能成为治疗子宫内膜异位症的一种新的方法。     

子宫内膜异位症异位内膜细胞原代培养方法的改良

目的：建立一种简易的人异位子宫内膜细胞体外原代培养方法。方法：通过胰蛋白酶消化、贴壁纯化等技术,分离及培养10例子宫内膜异位症患者的异位子宫内膜细胞。在光学显微镜下观察细胞形态,以免疫细胞化学法鉴定细胞类型。结果：8份标本获得成功,培养的异位内膜细胞均有腺上皮细胞和间质细胞两种形态细胞。膜上皮细胞和基质细胞分别经角蛋白单抗和波形蛋白单抗免疫组化染色为阳性,腺上皮细胞平均生长时间为5周,间质细胞平均生长时间为14周。结论：成功建立了子宫内膜异位症异位内膜细胞体外原代培养方法,该改良培养法经济、简单、高效。     

基于ERα-EGFP核颗粒形成的荧光成像分析快速识别环境中雌激素样物质

目的：利用基于荧光成像分析的细胞高内涵分析（ high content analysis ，HCA）技术，建立快速识别环境中雌激素样物质的方法。方法以稳定表达雌激素受体α（ ERα）-增强型绿色荧光蛋白（ enhanced green fluorescent protein，EGFP）融合蛋白（ERα-EGFP）的人骨肉瘤U2OS细胞为模型，以雌激素（17-β-雌二醇）为阳性对照药，以黄体酮为阴性对照药，基于ERα-EGFP核颗粒形成的荧光成像分析探查环境污染物质双酚A、壬基酚、邻苯二胺、对氨基苯酚、间苯二酚、间氨基苯酚、对苯二胺和甲基-2，5-二胺硫酸盐等对ERα-EGFP细胞核颗粒形成作用（ Foci作用）的影响，分析其量效关系；并利用荧光素酶报告基因实验验证HCA的结果。结果 HCA结果显示，仅有双酚A、壬基酚和阳性药17-β-雌二醇能够剂量依赖地促进ERα-EGFP 细胞核颗粒形成作用，其EC50分别为（1．48±1．79）μmol／L、（3．70±0．78）μmol／L及（4．17±0．41） nmol／L，最小检出浓度分别为1 nmol／L（17-β-雌二醇）、300 nmol／L（双酚A和壬基酚）；邻苯二胺、对氨基苯酚、间苯二酚、间氨基苯酚、对苯二胺和甲基-2，5-二胺硫酸盐等不能诱导ERα-EGFP细胞核颗粒形成作用。荧光素酶报告基因实验结果同样显示，活性药物双酚A、壬基酚和阳性药17-β-雌二醇能够剂量依赖地诱导ERα报告基因ERE-Luc的活性，其EC50分别为（2．31±0．21）μmol／L、（6．60±0．94）μmol／L及（4．46±0．56）nmol／L；最小检出浓度是3 nmol／L（17-β-雌二醇）、300 nmol／L（双酚A）和1μmol／L （壬基酚）。 HCA和荧光素酶报告基因实验的结果基本一致，但HCA方法更为灵敏，实验步骤更为简便。结论基于荧光成像定量分析的HCA技术能够快速和灵敏地识别具有ERα激动活性的环境物质，是分析环境雌激素的有效方法。受试化合物中双酚A和壬基酚有明确的ERα激动活性。     

大鼠角膜缘上皮细胞的体外培养以及碱烧伤后β-连环蛋白表达的实验研究

目的探讨角膜缘上皮细胞的体外培养以及碱烧伤后β-连环蛋白(β-catenin)的表达规律。方法消化法培养大鼠角膜缘上皮细胞,并对其生物学特征[细胞形态、泛角质蛋白抗体(AE1/AE3)和细胞核增殖抗原(PCNA)]做初步鉴定;构建体外碱烧伤模型,利用实时定量聚合酶链反应和免疫荧光技术检测伤后各时相点β-catenin的表达。结果体外培养的角膜缘上皮细胞具典型的上皮细胞特点,大部分细胞分化程度较低且生活状态良好;核酸和蛋白水平均显示,伤后24小时β-catenin的表达有显著升高(P0.05),至伤后48小时达到峰值(P0.01)。结论在一定程度上可以利用角膜缘上皮细胞的研究结果来近似反映角膜干细胞的特点;Wnt经典信号途径参与了碱烧伤后的细胞修复过程。     

来曲唑对体外培养子宫内膜异位细胞增殖的影响

目的探讨来曲唑对体外培养的子宫内膜异位症患者在位内膜细胞的增殖影响。方法MTT比色法检测来曲唑对位内膜细胞（Eutopic Endometrium,EE）/正常内膜（normal endometriumNE）抑制情况,并采用蛋白印迹法与RT-PCR方法检测芳香化酶及其转录调节因子SF-1的蛋白与mRNA表达情况。结果NE细胞用药组与对照组比较无显著性差异（P〉0.05）;EE细胞在来曲唑作用下呈现较强的抑制增殖效应,抑制作用随浓度增加而加强,细胞增殖活力明显降低,有显著性差异（P〈0.01）,不同浓度的来曲唑均可明显抑制细胞内芳香化酶及其转录调节因子SF-1的蛋白与mRNA表达,且呈剂量依赖性,有显著性差异（P〈0.01）。结论芳香化酶抑制剂-来曲唑对内异症在位内膜细胞具有抑制其增殖作用,明显抑制EE细胞内芳香化酶及其转录调节因子SF-1的蛋白与mRNA表达。     

不同浓度地塞米松对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的观察不同浓度地塞米松对体外培养人骨髓间充质干细胞（hMSCs）成骨分化、增殖能力及凋亡率的影响。方法以梯度密度分离法获取人骨髓间充质干细胞进行体外培养,以1×10^-9、1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6mol／L4种不同浓度地塞米松分别处理细胞。检测各组细胞的碱性磷酸酶（ALP）活性;RT-PCR法检测骨桥蛋白（OPN）基因的表达;四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定各组细胞的增殖率;流式细胞仪分析细胞凋亡率。结果低浓度（1×10^-9mol／L）地塞米松对ALP的表达无显著作用（P〉0．05）,而1×10^-8mol／L及以上浓度的地塞米松可明显增加ALP的活性（P〈0．01）;所有实验组的hMSCs均有OPN mRNA表达,其表达强度随着地塞米松浓度增加而增强;1×10^-9mol／L地塞米松对细胞增殖无明显影响（P〉0．05）,1×10^-8mol／L及以上浓度的地塞米松可明显抑制细胞的增殖（P〈0．01）;体外培养的hMSCs凋亡率随地塞米松浓度的增加而升高（P〈0．01）。结论1×10^-8mol／L及以上浓度的地塞米松可显著增强hMSCs成骨分化能力,同时抑制细胞增殖并促进其凋亡。     

激活素A刺激肾小管上皮细胞转分化的研究

目的研究激活素A对体外培养的人肾小管上皮细胞转分化的影响。方法取人肾小管上皮细胞株进行体外培养,分为ACT—A组（含不同浓度激活素A）、FS组（含不同浓度卯泡抑素）、ACT—A＋Fs组（含30ng／mlACT＋不同浓度卵泡抑素）和对照组（含无血清培养基及0ng／mlACT—A和0ng／mlFS）,应用免疫组化法检测培养细胞转化生长因子β蛋白（TGF—β）的表达,以观察肾小管上皮细胞转分化的情况。结果与对照组和卵泡抑素组相比,激活素组。肾小管—巳皮细胞表达的TGF-β蛋白显著增多（P〈0．05）。结论激活素A能促进肾小管上皮细胞增殖、转分化,激活素A可能在肾小管问质纤维化中起重要作用。     

Anti-miR-155反义寡核苷酸对人肺鳞癌H157细胞增殖的影响

目的：观察anti-miR-155反义寡核苷酸（AMOs）对肺鳞癌H157细胞增殖的影响。方法：将H157细胞分为对照组和AMOs处理组，AMOs处理组采用AMOs抑制H157细胞内miR-155的活性，液闪计数仪测定[^3H]-TdR掺入量，MTT法测定细胞增殖抑制率，流式细胞仪测定细胞周期。结果：与对照组相比，AMOs显著减少H157细胞[^3H]-TdR掺入量（P〈0．01），随着浓度从10nmol／L逐渐增加至于100nmol／L，H157细胞[^3H]-TdR掺入量亦随之减少（P〈0．01）；AMOs显著抑制H157细胞的增殖（P〈0.01），使G0／G1细胞比例显著增加，G2／M期细胞比例显著减少（P〈0．01）。结论：AMOs通过抑制H157细胞内高水平表达miR-155的活性，显著抑制H157细胞的增殖。     

人巨细胞病毒感染对人涎腺导管上皮细胞存活的影响

目的：研究体内外人巨细胞病毒（HCMV）感染对人涎腺导管上皮细胞存活的影响。方法：用细胞凋亡检测技术研究11例腮腺巨细胞包涵体病（PCID）尸检石蜡包埋组织中细胞凋亡情况;用免疫组化法检测PCID组织存活素、PCNA和P,,的表达;用流式细胞术检测HCMV感染对体外培养的涎腺导管上皮细胞周期的影响。结果：所有包涵体巨细胞凋亡检测呈阴性。包涵体巨细胞存活素和P53,表达呈阴性,其他导管上皮细胞呈弱阳性（±～＋）;75％的包涵体巨细胞核PCNA表达呈弱阳性（±）。与模仿感染组相比,病毒感染组G0／G1期细胞所占百分数在感染36、60和72h显著增高（P均〈0．01）。结论：HCMV感染后涎腺导管上皮细胞并未发生凋亡,而发生了增殖阻滞,大部分细胞处于G1期。