复方鳖甲软肝方对离体肝星形细胞向肌成纤维细胞转型的影响

目的：观察复方鳖甲软肝方药物血清对离体肝星形细胞(hepatic stellate cells，HSC)转型的影响，以探讨该药物血清防治肝纤维化作用的机制。方法：将成年的健康雄性SD大鼠75只随机分为对照组、模型组、高、中、低剂量药物组共5组，并制备各组血清。采用大鼠HS分离技术，将分离得到的HSC分别添加各组血清培养24，48h后，免疫组化ABC法检测各组HSC的α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表达，经图像分析系统定量分析。结果：培养24，48h各药物血清组血清对HSC中α-SMA阳性染色不同时相吸光度(A值)(24h：高、中、低剂量分别为110．95&;#177;45．21，243．82&;#177;62．97，417．46&;#177;126．72；48h分别为：333．71&;#177;57．90，345．08&;#177;51．85，675．35&;#177;202．20)与模型组(24h：778．93&;#177;190．26；48h：1032．69&;#177;106．6_4)比较，差异有显著性意义(P&;lt;0．05)；模型组、高、中剂量药物血清组与正常组比，差异有显著性意义(P&;lt;0．05)。结论：高、中剂量复方鳖甲软肝方药物血清能抑制HSC的α-sMA表达，其抗肝纤维化作用机制可能与药物能抑制HSC向α-SMA的转型有关。     

复方鳖甲软肝方对肝星形细胞结蛋白、突触素表达的影响

目的：观察复方鳖甲软肝方药物血清对离体SD大鼠肝星形细胞(hepatic stellate cells，HSC)结蛋白、突触素表达的影响，以探讨其抗肝纤维化作用机制。方法：将成年健康雄性SD大鼠75只，随机分为正常对照组、模型组、高、中、低剂量药物组共5组，并制备各组血清。采用大鼠HSC分离技术，将分离得到的HSC分别添加各组血清培养24，48，72h后，免疫组化检测各组HSC的结蛋白、突触素表达，并经图像分析系统作定量分析。结果：培养24h正常对照组、高、中、低剂量药物组大鼠HSC结蛋白、突触素的表达(A值)(78．93&;#177;18．56，396．29&;#177;78．56；58．95&;#177;5．21，138．92&;#177;20．21；63．83&;#177;12．97，190．87&;#177;52．97；75．46&;#177;26．72，284．54&;#177;66．72)与模型组(119．69&;#177;23．84，528．79&;#177;26．84)比较，差异有显著性意义(P&;lt;0．05)；培养48，72h各组结蛋白、突触素的表达(A值)与模型组比较。差异也有显著性意义(P&;lt;0．05)。除低剂量药物组外的其余各组大鼠HSC结蛋白、突触素表达与正常对照组比较，差异有显著性意义(P&;lt;0．05)。结论：复方鳖甲软肝方能显著抑制HSC结蛋白、突触素的表达，其抗肝纤维化作用机制可能与药物抑制HSC活化有关。     

复方鳖甲软肝方对离体肝星形细胞增殖的影响

目的：观察复方鳖甲软肝方药物血清对离体肝星形细胞(hepatic stellate cells，HSC)增殖的影响，以探讨其抗肝纤维化的作用机制。方法：将成年健康雄性SD大鼠75只，随机分为正常对照组、模型组、高、中、低剂量药物组共5组，并制备各组血清。采用大鼠CCl4造模后肝星形细胞分离、培养，药物血清制备，MTT法检测法各组血清对HSC不同时相增殖的影响，酶标仪波长为450 nm。结果：培养24h，各组HSC增殖比较，差异无显著性意义(P&;gt;0．05)；培养48，72h，高、中、低剂量药物组HSCA值(0．47&;#177;0．02，0．55&;#177;0.07：0．46&;#177;0．02,0．58&;#177;0．08；0．51&;#177;0．03，0．69&;#177;0．07)与模型组(0．66&;#177;0．05和0．96&;#177;0.05)比较。差异有显著性意义(P&;lt;0．05)；高、中剂量组药物组与对照组比较，差异有显著性意义(P&;lt;0．05)。结论：不同剂量的复方鳖甲软肝方药物血清作用48，72h后均能降低或抑制HSC的增殖，尤以高、中剂量作用明显。     

复方鳖甲软肝方对离体肝星形细胞增殖的影响

目的:观察复方鳖甲软肝方药物血清对离体肝星形细胞(hepaticstellatecells,HSC)增殖的影响,以探讨其抗肝纤维化的作用机制。方法:将成年健康雄性SD大鼠75只,随机分为正常对照组、模型组、高、中、低剂量药物组共5组,并制备各组血清。采用大鼠CCl4造模后肝星形细胞分离、培养,药物血清制备,MTT法检测法各组血清对HSC不同时相增殖的影响,酶标仪波长为450nm。结果:培养24h,各组HSC增殖比较,差异无显著性意义(P>0.05);培养48,72h,高、中、低剂量药物组HSCA值(0.47±0.02,0.55±0.07;0.46±0.02,0.58±0.08;0.51±0.03,0.69±0.07)与模型组(0.66±0.05和0.96±0.05)比较,差异有显著性意义(P<0.05);高、中剂量组药物组与对照组比较,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:不同剂量的复方鳖甲软肝方药物血清作用48,72h后均能降低或抑制HSC的增殖,尤以高、中剂量作用明显。     

复方鳖甲软肝方对活化肝星形细胞细胞因子分泌的影响

目的:观察复方鳖甲软肝方药物血清对离体肝星形细胞(hepaticstellatecell,HSC)活化时分泌转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)和血小板源性生长因子(plateletderivedgrowthfactor,PDGF)的影响,以探讨其抗肝纤维化作用机制。方法:将成年健康雄性SD大鼠75只,随机分为对照组、模型组、高、中、低剂量药物组共5组,并制备各组血清。采用SD大鼠肝星形细胞分离、培养、药物血清制备,免疫组化检测各实验组血清对肝星形细胞分泌TGF-β1,PDGF的影响,并经图像分析系统作定量分析。结果:培养48h模型组TGF-β1,PDGF阳性反应物A值分别为733.58±189.73和659.45±76.56;72h分别为1509.87±77.50和1208.02±132.21,与对照组(48h:570.78±57.61和479.65±38.49;72h:1279.30±147.78和805.30±121.04)比较,差异显著有显著性意义(F=5.833～21.250,P<0.05)。培养48,72h,高、中剂量药物组与模型组TGF-β1,PDGF表达比较,差异也有显著性意义(F=5.833～21.250,P<0.05),可显著抑制TGF-β1,PDGF表达,并呈量效关系。结论:复方鳖甲软肝方药物血清能有效抑制肝纤维化时活化肝星形细胞分泌TGF-β1和PDGF,从而达到抑制肝星形细胞增殖、活化的抗肝纤维化防治作用。     

复方鳖甲软肝方对肝星形细胞中细胞核因子κB活化的影响

目的:观察复方鳖甲软肝方药物血清对离体肝星形细胞(hepaticstellatecells,HSC)中细胞核因子κB(nuclearfactorkappaB,NF-κB)活化的影响,以探讨其防治肝纤维化作用机制与核转录因子之间的相关性。方法:实验选用成年健康雄性SD大鼠75只,随机将75只大鼠分为正常对照组、模型组、高、中、低剂量药物组共5组,并制备各组血清。采用SD大鼠肝星形细胞分离、培养,药物血清制备,免疫组化检测实验各组血清对肝星形细胞中NF-κB活化的影响,并经图像分析系统定量分析。结果:HSC培养24,48,72h,模型组NF-κB表达的速率(NF-κB阳性染色A值分别为:217.36±29.02,429.23±25.48,627.31±37.68)与正常对照组(127.30±15.31,240.65±38.49,321.27±121.04)比较,差异有显著性意义(P<0.05)。高、中剂量药物组NF-κB表达的速率与正常对照组比较,差异有显著性意义(P<0.05)。表明HSC培养24h,NF-κB即可在核内发生活化并表达;而复方鳖甲软肝方高、中剂量药物血清组均可有效抑制HSC中NF-κB的活化和表达。结论:复方鳖甲软肝方能有效抑制HSC中NF-κB的活化和表达。     

复方鳖甲软肝方对肝星形细胞胶原表达及降解的影响

目的:观察复方鳖甲软肝方药物血清对离体肝星形细胞(hepaticstellatecell,HSC)中Ⅰ,Ⅲ型胶原及组织金属蛋白酶抑制物(tissueinhibitorofmetalloproteinases,TIMPs)表达的影响,以探讨防治肝纤维化作用机制。方法:将成年健康雄性SD大鼠75只,随机分为正常对照组、模型组、高、中、低剂量药物组共5组,并制备各组血清。采用SD大鼠肝星形细胞分离、培养,药物血清制备,免疫组化检测实验各组肝星形细胞中Ⅰ,Ⅲ型胶原及TIMPs的表达经图像分析系统定量分析。结果:培养72h,高、中、低剂量药物组Ⅲ型胶原的表达犤Ⅲ型胶原反应物吸光度(A值)为178.36±5.82,182.27±20.32,220.38±19.32犦早于Ⅰ型胶原(I型胶原反应物A值为300.23±25.80,329.37±45.98,425.38±19.32),与模型组比较,差异有显著性意义(P<0.05)。高、中剂量药物组均可有效抑制Ⅰ,Ⅲ型胶原的表达,并呈药物量效关系;培养24h,实验各组均无TIMPs的表达,培养48h后TIMPs开始表达,培养72h时,高、中、低药物组与模型组比较,差异有显著性意义(P<0.05),可显著抑制TIMPs的表达。结论:复方鳖甲软肝方药物血清能有效抑制肝纤维化时肝星形细胞中Ⅰ,Ⅲ型胶原及TIMPs的表达,其抗肝纤维化作用机制可能与减少细胞外基质生成的同时,加速已生成的细胞外基质降解有关。     

复方鳖甲软肝方对活化肝星形细胞细胞因子分泌的影响

目的：观察复方鳖甲软肝方药物血清对离体肝星形细胞(hepatic stellate cell，HSC)活化时分泌转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和血小板源性生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)的影响，以探讨其抗肝纤维化作用机制。方法：将成年健康雄性SD大鼠75只，随机分为对照组、模型组、高、中、低剂量药物组共5组，并制备各组血清。采用SD大鼠肝星形细胞分离、培养、药物血清制备，免疫组化检测各实验组血清对肝星形细胞分泌TGF-β1。PDGF的影响，并经图像分析系统作定量分析。结果：培养48h模型组TGF-β1，PDGF阳性反应物A值分别为733．58&;#177;189．73和659．45&;#177;76．56；72h分别为1509．87&;#177;77．50和1208．02&;#177;132．21。与对照组(48h：570．78&;#177;57．61和479．65&;#177;38．49；72h：1279．30&;#177;147．78和805．30&;#177;121．04)比较，差异显著有显著性意义(F=5．833～21．250，P&;lt;0．05)。培养48，72h。高、中剂量药物组与模型组TGF-β1，PDGF表达比较，差异也有显著性意义(F=5．833～21．250，P&;lt;0．05)，可显著抑制TGF-β1。PDGF表达。并呈量效关系。结论：复方鳖甲软肝方药物血清能有效抑制肝纤维化时活化肝星形细胞分泌TGF-β1和PDGF。从而达到抑制肝星形细胞增殖、活化的抗肝纤维化防治作用。     

复方鳖甲软肝方对肝星形细胞结蛋白、突触素表达的影响

目的观察复方鳖甲软肝方药物血清对离体SD大鼠肝星形细胞(hepaticstellatecells,HSC)结蛋白、突触素表达的影响,以探讨其抗肝纤维化作用机制。方法将成年健康雄性SD大鼠75只,随机分为正常对照组、模型组、高、中、低剂量药物组共5组,并制备各组血清。采用大鼠HSC分离技术,将分离得到的HSC分别添加各组血清培养24,48,72h后,免疫组化检测各组HSC的结蛋白、突触素表达,并经图像分析系统作定量分析。结果培养24h正常对照组、高、中、低剂量药物组大鼠HSC结蛋白、突触素的表达(A值)(78.93±18.56,396.29±78.56;58.95±5.21,138.92±20.21;63.83±12.97,190.87±52.97;75.46±26.72,284.54±66.72)与模型组(119.69±23.84,528.79±26.84)比较,差异有显著性意义(P<0.05);培养48,72h各组结蛋白、突触素的表达(A值)与模型组比较,差异也有显著性意义(P<0.05)。除低剂量药物组外的其余各组大鼠HSC结蛋白、突触素表达与正常对照组比较,差异有显著性意义(P<0.05)。结论复方鳖甲软肝方能显著抑制HSC结蛋白、突触素的表达,其抗肝纤维化作用机制可能与药物抑制HSC活化有关。     

复方丹参滴丸联合复方鳖甲软肝片抗肝纤维化疗效观察

目的:探讨复方丹参滴丸联合复方鳖甲软肝片治疗早期肝纤维化疗效。方法:对照C组30例,单纯应用甘利欣、益肝灵、茵栀黄等护肝降酶退黄药物治疗;治疗A组33例,在对照组治疗的基础上加用C复方丹参滴丸联合复方鳖甲软肝片;治疗B组30例,在对照组的基础上加用复方鳖甲软肝片。观察3组治疗前后患者肝功能、血清肝纤维化标志物及B超等指标的变化。结果:治疗组治疗前后血清肝纤维化标志物比较差异有显著性(P<0.01),治疗后与对照组比较差异有显著性(P<0.01);治疗后各组患者的肝功能指标均有不同程度的好转,组间差异不明显;治疗A、B组中多数患者的B超指标有改善。结论:复方丹参滴丸联合复方鳖甲软肝片治疗早期肝纤维化疗效显著,并优于常规治疗。     

肝纤维化中肝星状细胞和肌纤维母细胞的形态学观察

目的：观察肌纤维母细胞和肝星状细胞在人慢性乙型病毒性肝炎肝纤维化过程中的作用。方法：对69例肝穿刺活检组织标本行HE、Masson三色及Sweet网织纤维的染色，按照2000年新的病毒性肝炎病理分级分期标准，进行炎症活动度和纤维化程度评定，应用免疫组织化学方法，观察平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、vimentin、结蛋白（desmin)在肝星状细胞、肌纤维母细胞的表达。结果：在慢性肝炎肝纤维化过程中α－SMA阳性细胞不仅仅是肝星状细胞的活化。结论：在人的慢性肝炎肝纤维化过程中，并不排除肝星状细胞所起的作用，但随着肝组织炎症损伤的修复，以肌纤维母细胞为代表的间叶细胞在纤维化过程中可能起主要作用。     

复方鳖甲软肝方对自发性高血压大鼠心肌纤维化的抑制作用

目的:评价复方鳖甲软肝方对自发性高血压大鼠(SHR)心肌纤维化、左室重构及血浆中血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)、醛固酮的效应。方法:实验选用12周龄SHR50只,随机将其分为5组,即空白对照组、依那普利组、小、中、小剂量复方鳖甲组(小、中、大剂量药物组),每组各10只。另取正常SD大鼠10只作为正常对照组。测定治疗10周后各组大鼠收缩压、心脏质量指数(heartweightindex,HWI)、左室质量指数(leftventricularmassindex,LVMI)、胶原蛋白含量,血浆中血管紧张素Ⅱ、醛固酮含量,心肌胶原容积分数(collagenvolumefraction,CVF)和血管周围胶原面积(perivascularcircuferentialarea,PVCA)。结果:治疗10周后,空白对照组大鼠收缩压,HWI,LVMI,胶原蛋白含量犤(195±9)mmHg,(5.38±0.25),(3.81±0.09),(6.13±0.93)mg/g,1mmHg=0.133kPa犦均明显高于正常对照组犤(127±10)mmHg,(3.88±0.28),(2.57±0.17),(4.19±0.72)mg/g犦(P<0.01)。依那普利组大鼠收缩压明显低于与空白对照组(P<0.01),而复方鳖甲软肝方各组收缩压比较,差异无显著性意义(P>0.05);依那普利组大鼠HWI,LVMI明显低于空白对照组(P<0.01),而复方鳖甲软肝方各组差异无显著性意义(P>0.05);依那普利组,复方鳖甲软肝方中、大剂量组大鼠心肌组织胶原蛋白含量     

靶向性血小板衍生生长因子siRNA对肝星状细胞增殖的影响

目的探讨小干扰RNA（siRNA）降低血小板衍生生长因子B链（PDGF-B）基因对肝星状细胞（HSCs）增殖与细胞外基质表达的影响。方法构建PDGF-B靶向siRNA重组表达质粒pSilencer3.l-Hlhygro-PDGF-B siR-NA,将重组质粒转染HSCs细胞,噻唑蓝（MTT）法测定转染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h的增殖抑制率;半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）与免疫印迹检测转染后36 h HSCs细胞PDGF-B表达。放免法检测HSCs细胞株上清液中透明质酸和Ⅲ型前胶原的表达。结果经酶切鉴定和测序结果证实PDGF-B靶向siRNA重组表达载体构建成功,转染重组质粒36 h后,PDGF-B siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3干预组的HSCs增殖抑制率明显高于对照质粒转染组（34.04%、14.89%、25.53%VS 3.19%;均P〈0.01～0.05）;RT-PCR和免疫印迹显示：各siRNA表达质粒阳性HSCs细胞PDGF-B mRNA和蛋白表达明显降低,与空脂质体组及对照质粒组比较,差异具有统计学意义（均P〈0.05）,放免法显示：siRNAs干预组HSCs细胞透明质酸和Ⅲ型前胶原表达明显降低,与空脂质体组及对照质粒组比较,差异具有统计学意义（均P〈0.05）。结论靶向PDGF-B链的siRNA可降低HSCs的PDGF-B基因表达,具有抑制HSCs增殖和分泌细胞外基质的能力。     

人骨髓间质干细胞对肝星状细胞的体外调控

背景:目前肝纤维化尚没有公认的特效疗法,近年来骨髓间质干细胞应用于肝纤维化的治疗已取得一定效果,但具体机制仍不明确.目的:体外探讨人骨髓间质干细胞对肝星状细胞的调控作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/12在中山大学干细胞与组织工程研究中心、中山大学第三附属医院中心实验室完成.材料:骨髓来源于青年健康志愿者髂骨,入肝星状细胞购自中山大学实验动物中心,人正常肝细胞系L-02购自中山大学实验动物中心.方法:将分离提纯的人骨髓间质干细胞与肝星状细胞在β孔Transwell板上建立上下共培养体系.接种密度均为2×104cells/well.另设L-02代替人骨髓间质干细胞作为阴性对照,单纯培养的肝星状细胞为空白对照,培养72 h.主要观察指标:肝星状细胞形态及免疫细胞化学染色结果,流式细胞仪检测肝星状细胞凋亡情况,Western blot法检测肝星状细胞活化标志α-肌动蛋白的表达.结果:倒置显微镜下活化的肝星状细胞呈扁平状,胞浆内缺乏脂肪滴,α-肌动蛋白位于肝星状细胞胞质内,呈高张力纤维状分布.与L-02+肝星状细胞组、单纯肝星状细胞组比较,骨髓间质干细胞+肝星状细胞共培养组的肝星状细胞凋亡率明显升高(P<0.05),α-肌动蛋白表达水平明显下调.结论:人骨髓间质干细胞可抑制肝星状细胞活化,促进其凋亡,这可能是骨髓间质干细胞抗肝纤维化的作用机制.     

中药复方对瘦素刺激肝星状细胞增殖功能的影响及其机制

目的:观察中药复方保肝宁对瘦素刺激的肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)增殖功能的影响及其发生的可能机制。方法:实验于2005-07/2006-07在南方医科大学细胞生物实验室完成。①药物血清的制备:保肝宁的方药由黄芪、桃仁、丹参、黄芩、白背叶根、鳖甲、柴胡、白芍、枳实等组成,煎煮配制成1.77g/mL,3.54g/mL剂量药液。秋水仙碱配制成0.05g/mL。取wistar大鼠24只,随机分为4组,每组6只,分别为正常血清组、保肝宁等剂量组、保肝宁二倍剂量组、秋水仙碱含药血清组。正常血清组给予等量生理盐水,其余各组给予相应药物1mL/100g,胃灌1次/d,连续7d。腹主动脉采血,离心分离血清。②用四甲基偶氮唑盐比色法检测0,10,50,100,200及400μg/L的瘦素在6,12,18,24h对HSC-LX2增殖的影响及保肝宁对100μg/L的瘦素刺激HSC-LX2增殖的阻断作用;应用蛋白印迹实验检测细胞膜瘦素受体长片段b(OB-Rb)蛋白表达水平。结果:①不同剂量瘦素在不同时间点对HSC-LX2增殖的影响:瘦素剂量为10～400μg/L时,对HSC-LX2的促进增殖作用呈现剂量、时间依赖性。各剂量组之间差异有显著性(P<0.01),同一剂量、不同时间比较差异有显著性(P<0.01)。②保肝宁对HSC-LX2生长的影响:与正常血清组比较,保肝宁等剂量组、保肝宁二倍剂量组均能明显抑制HSC-LX2的增殖(A600值,0.818±0.239,0.115±0.114,0.107±0.055,n=5,P<0.01),秋水仙碱组(0.388±0.073)亦能抑制HSC-LX2细胞的增殖(P<0.05);与秋水仙碱组比较,保肝宁等剂量组、保肝宁二倍剂量组明显抑制HSC-LX2的增殖(P<0.05)。③保肝宁作用HSC-LX20不同时间后OB-Rb的表达:与正常血清组,保肝宁作用6h后,OB-Rb水平有显著的降低,秋水仙碱组则无明显的降低。结论:中药复方保肝宁有阻断瘦素刺激HSCs-LX2增殖的作用,而OB-Rb的表达降低可能是其主要的作用机制之一。