HCV核心基因转染胆管癌细胞中NF-κB的表达

目的 探讨丙型肝炎病毒（HCV）感染在胆管癌中的致癌机理。方法 通过分子克隆技术构建HCV－C基因重组质粒,经酶切鉴定后,经染胆管癌细胞（QBC939）,经G418选择培养,以免疫细胞学测定、Western blotting鉴定其表达;以透射电镜观察细胞形态学改变,并用免疫细胞学检测NF－κB的表达。结果 限制性内切酶反应证明HCV－C基因质粒构建成功,构建的PBK－HCVc质粒经免疫细胞学、Western blotting鉴定在QBC939细胞中有稳定表达。透射电镜可见胞质空泡内球型病毒颗粒,直径约50－80nm,有外膜结构。HCV核心蛋白可激活NF－κB表达。结论 进一步探讨HCV感染在胆管癌中的致癌机理提供了理想的实验细胞株,NF－κB可能与HCV感染的胆管癌细胞免疫逃逸及致癌有关。     

NOEY2基因对人乳腺癌细胞体外生长的影响

目的：构建NOEY2基因真核表达载体。研究其对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231生长的影响。方法：RT-PCR获得目的基因编码区,经T/A策略克隆后,再亚克隆至pcDNA3,获得真核表达载体。用lipofectAMINE辅助转染MDA-MB-231细胞,经G418长期筛选而获得稳定转染细胞克隆。Western印迹检测NOEY2蛋白水平的表达。通过记录生长曲线和流式细胞分析术观察转染细胞的生长和细胞周期变化。结果：NOEY2真核表达载体pcDNA3/NOEY2-CR构建成功。被稳定转染该载体的MDA-MB-231细胞有明显NOEY2蛋白表达,而对照细胞无表达。NOEY2转染细胞的生长抑制率可达46.3%,在细胞周期改变上可见明显的S期分数和G2/M期分数下降,而G0/G1期比例上升。结论：NOEY2基因转染对体外培养的人乳腺癌细胞生长具有一定的抑制作用。支持其人微言轻一个抑癌基因的推测,本研究为进一步探索NOEY2作为治疗基因的价值创造了条件。     

PTEN基因转染联合奥沙利对胆管癌细胞生长的影响

目的: 〖HT5"SS〗观察脂质体介导PTEN基因转染人胆管癌细胞（QBC939）,联合化疗药物奥沙利铂（LOHP）对胆管癌细胞生长的影响,探索人类胆管癌的生物治疗方法。〖HT5W〗方法: 〖HT5"SS〗将携带PTEN基因的真核表达载体pBPPTEN和不含该基因的空载体转染胆管癌QBC939细胞,嘌呤霉素抗性筛选克隆、扩增培养,SP免疫组化法检测转染前后PTEN阳性表达率。实验分组为QBC939、QBC+LOHP、PTENQBC和PTEN+LOHP 4组,以MTT法检测癌细胞生长活性,透射电镜扫描观察转染前后及联合奥沙利铂后细胞的超微结构变化,流式细胞仪分析转染前后细胞周期变化和凋亡情况,体外细胞侵袭力抑制试验观察转染及用药前后细胞侵袭力的变化。〖HT5W〗结果: 〖HT5"SS〗PTEN基因转染后QBC939细胞稳定表达、PTEN阳性表达率升高(P<0.05);基因转染后肿瘤细胞活性下降(P<0.05);细胞周期G1～S期抑制、细胞凋亡率增加(P<0.01);透射电镜下显示细胞较成熟、分化好、线粒体增多;细胞侵袭力明显抑制(P<0.05),其中以PTEN+LOHP抑制作用最强,LOHP抑制作用次之。〖HT5W〗结论：〖HT5"SS〗PTEN基因转染生物治疗联合奥沙利铂化疗对人胆管癌细胞生长具有显著的抑制作用。     

p27kip1真核表达载体的构建及其对人胆管癌细胞生长的影响

目的：构建p27^kip1真核表达载体并进行基因转染,研究其对人胆管癌细胞生长特性的影响。方法：将人p27^kip1 cNDA克隆至真核表达载体pClneo的No1 1酶切位点中,然后应用DOTAP脂质体将重组质粒转染人胆管癌QBC939细胞中,用G418筛选抗性细胞克隆,采用PCR、RT-PCR和Western印迹法检测外源性目的基因在靶细胞基因组中的整合及表达,以及转基因细胞对裸鼠致瘤性能力的改变。结果：成功构建p27^kip1基因真核表达载体,并将其导入QBC939细胞中。经G418筛选得到稳定表达p27^kip1基因的细胞株,p27^kip1基因转染细胞生长速度明显减慢,并出现分化的迹象,其裸鼠致瘤性能力明显降低。结论：p27^kip1基因具有抑癌基因的作用,在未来胆管癌的基因治疗中可能具有应用前景。     

RI基因真核表达载体的构建及其对C6胶质瘤细胞生长的影响

目的通过构建核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor, RI)基因的真核表达载体——pLNCX-ri, 并转染C6神经胶质瘤细胞,探讨RI抑制肿瘤生长的作用机制.方法用Nde I / Xho从已构建的pET-ri上切下1.4 kb的RI基因片段,再构建到pLNCX上,获得真核表达载体(pLNCX-ri),采用Lipofect AMINE辅助转染大鼠C6神经胶质瘤细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,用Western blotting 检测RI基因的表达水平.将转染阳性的C6神经胶质瘤细胞接种于大鼠皮下,观察肿瘤的生长情况.结果在转染的C6神经胶质瘤细胞中,RI基因的表达量明显高于未转染的C6神经胶质瘤细胞,转染阳性的C6神经胶质瘤细胞在大鼠体内的成瘤潜伏期23±5.7天(对照组14±3.5天),瘤组织重量转染组1.35±0.43g比对照组2.40±0.61g(P＜0.01)明显下降,瘤组织的血管密度转染组27.2±4.31比对照组47±6.54(P＜0.01)明显减少.结论RI基因的转染对肿瘤的生长有明显抑制作用,其作用机制可能是抑制肿瘤组织血管的形成.     

PTEN在肝癌中表达缺失的意义及其体外转染对人肝癌细胞系的作用

目的探讨PTEN表达与肝细胞癌发生、发展的关系,观察体外转染外源性PTEN对肝癌细胞的生长、细胞周期和超微结构的影响。方法检测PTEN在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达缺失情况,以观察该基因与肝癌病理分级、转移和预后的关系。将含PTEN的反转录病毒载体及空载体转入人肝癌细胞系HHCC,观察转染前后细胞的生长、超微结构、细胞周期及裸鼠致瘤能力改变情况。结果肝癌中PTEN表达缺失率为30.16%(19/63),显著高于正常肝组织0(0/8)和肝硬化组织7.15%(1/14)。随着恶性程度的增高,PTEN表达缺失率随之增加。PTEN表达缺失与转移及预后显著相关。PTEN在人肝癌细胞系hHCC中也不表达。将抑癌基因PTEN转入后,hH-CC细胞生长明显受到抑制,细胞超微结构失去部分恶性表型特征,细胞周期由G1→S0期受抑制,并出现凋亡峰,体外成瘤能力下降。结论抑癌基因PTEN失表达多见于肝细胞肝癌进展期,并与肝细胞肝癌分化程度、是否转移以及临床预后相关;体外PTEN的转入可以明显地抑制HHCC生长、体外成瘤能力。     

FTEN在肝癌中表达缺失的意义及其体外转染对人肝癌细胞系的作用

目的探讨PTEN表达与肝细胞癌发生、发展的关系,观察体外转染外源性PTEN对肝癌细胞的生长、细胞周期和超微结构的影响.方法检测PTEN在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达缺失情况,以观察该基因与肝癌病理分级、转移和预后的关系.将含PTEN的反转录病毒载体及空载体转入人肝癌细胞系HHCC,观察转染前后细胞的生长、超微结构、细胞周期及裸鼠致瘤能力改变情况.结果肝癌中PTEN表达缺失率为30.16%(19/63),显著高于正常肝组织0(0/8)和肝硬化组织7.15%(1/14).随着恶性程度的增高,PTEN表达缺失率随之增加.PTEN表达缺失与转移及预后显著相关.PTEN在人肝癌细胞系hHCC中也不表达.将抑癌基因PTEN转入后,hH-CC细胞生长明显受到抑制,细胞超微结构失去部分恶性表型特征,细胞周期由G1→S0期受抑制,并出现凋亡峰,体外成瘤能力下降.结论抑癌基因PTEN失表达多见于肝细胞肝癌进展期,并与肝细胞肝癌分化程度、是否转移以及临床预后相关;体外PTEN的转入可以明显地抑制HHCC生长、体外成瘤能力.     

脂质体介异的人α-干扰素基因转染人口腔粘膜鳞癌细胞引起的凋亡研究

肿瘤的细胞因子基因治疗是近年来新兴的一门学科，其中疗法之一是将细胞因子基因转至肿瘤细胞中使之表达，从而有效地提高肿瘤免疫原性．降低其致瘤性后作为新型“瘤苗”用于肿瘤的基因治疗。我们利用脂质体介导，在体外成功地将人α-干扰素基因转入人口腔粘膜鳞状细胞癌(Tca8113)中并证实有人α-干扰素基因存在及表达，     

4-1BBL基因真核表达载体构建及在肝癌细胞中表达的研究

目的 研究含鼠源性4-lBBL真核表达载体体系的构建及其在大鼠肝细胞癌(HCC)细胞系CBRH7919中获得稳定、高效表达的方法。方法 将4-lBBL全长cDNA亚克隆到真核表达载体PCI-neo中,获得4-1BBL定向插入重组子PCI-neo-4-lBBL,采用酶切法和测序法鉴定。用阳离子脂质体将PCI-neo-4-1BBL转染CBRH7919,经G418筛选,获得阳性克隆,命名为PCI-neo-4-lBBL-CBRH7919 细胞。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测4-1BBL在CBRH7919中的表达。结果 PCI-neo-4-1BBL经限制性内切酶切,电泳后显示有980bp的4-lBBL目的基因片段和5．4kb的线性化PCI-neo载体片段;重组子测序结果与Genbank中4-lBBL cDNA序列相符,证实构建成功。RT-PCR检测到4-lBBL在PCI-neo-4-1 BBL-CBRH7919 细胞中获得稳定表达。结论 重组4-1BBL真核表达载体构建正确,并在PCI-neo-4．1 BBL-CBRH7919 细胞中获得稳定、高效表达。     

人TNFα基因转染的人肝癌细胞稳定高表达细胞克隆SMMC7721-TNF的建立及其部分生物学特性的初步观察

用重组逆转录病毒载体L-tnfSN的包装病毒颗粒感染人肝癌细胞SMMC7721，G418筛选后，随机挑选10个细胞克隆，扩大培养，检测细胞培养液上清中TNFα的水平，将其中表达TNF最高细胞克隆命名为SMMC7721-TNF。观察SMMC7721-TNF的分子生物学特性。Southern Blot证明TNFα基因完整地整合在细胞基因组中，     

肝癌细胞端粒酶逆转录酶(htert)活性与c-myc表达的关系及调控研究

 目的　研究肝癌细胞端粒酶逆转录酶 (htert)活性与c myc的表达及其在肝癌发生中的调控机制。方法　TRAP ELISA法和RT PCR分别测定肝癌细胞株端粒酶活性、htert和c myc表达 ;将c myc表达质粒与含有htert启动子序列的报告基因质粒共转染COS 7细胞后测定启动子活性。结果　肝癌细胞株均有端粒酶活性表达 ;htert和c mycmRNA表达明显增高 ;外源性c myc可上调htert启动子活性。 结论　在肝癌细胞株中 ,c myc和htert的表达均增强且有着重要的相关性 ;c myc对htert基因调控可能是激活端粒酶诱发肝癌发生的重要途径。     

胆管癌及癌旁组织中端粒酶逆转录酶蛋白和基因的表达及意义

目的 检测胆管癌和癌旁胆管组织中端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白和基因的表达,探讨其在胆管癌发生中的作用。方法 应用免疫组化S-P法检测71例胆管癌和39例癌旁胆管组织中hTERT。蛋白的表达,同时应用组织原位杂交技术检测这些组织标本中hTERT mRNA的表达,并与临床病理资料进行相关性分析。结果 71例胆管癌组织中,hTERT。蛋白阳性表达率为78．9％(56／71),hTERT mRNA阳性表达率为67．6％(48／71);而39例癌旁胆管组织中的hTERT蛋白阳性表达率仅为35．9％(14／39),hTERT mRNA阳性表达率仅为23．1％(9／39),且阳性信号全部见于伴有不典型增生的胆管上皮细胞内。病理资料的相关性分析显示,胆管癌组织中,HTERT蛋白和基因的表达分布与临床病理特征无相关性。结论 hTERT基因转录和蛋白表达可能参与胆管癌的发生发展过程,检测hTERT表达可能有助于阐明胆管癌的发生机制。     

肝细胞癌端粒酶活性及hTERT mRNA表达与术后早期复发的关系

目的：研究肝细胞癌端粒酶活性及人端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA表达与肝细胞癌术后早期复发的关系。方法：采用ELISA—TRAP法检测60例肝癌组织及其癌旁组织端粒酶活性，RT—PCR法检测hTERT mRNA表达，5例正常肝脏组织作为对照。分析端粒酶活性及hTERT mRNA表达与临床病理之间的关系。结果：肝癌组织端粒酶活性及hTERT mRNA表达阳性率分别为86．7％（52／60）及90％（54／60），癌旁组织端粒酶活性及hTERT mRNA表达阳性率分别为40％（24／60）及43．3％（26／60）。正常肝脏组织均未检测到端粒酶活性及hTERT mRNA表达。癌旁组织端粒酶活性及hTERT mRNA表达与术后早期复发及包膜浸润、门静脉侵犯、肝内转移等恶性肿瘤的恶性生物学行为有关。结论：癌旁组织端粒酶活性及hTERT mRNA表达可能是肝细胞癌术后早期复发的预后指标。     

骨肉瘤端粒酶逆转录酶的定性与定量检测及其意义

目的 对骨肉瘤中人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达进行定性及定量检测,探讨hTERT在骨肉瘤中的表达及意义.方法 用免疫细胞/组织化学法分别定性检测人宫颈癌细胞株HeLa、人骨肉瘤细胞株U2-OS、MG-63、SAOS-2及15例骨肉瘤组织中hTERT的表达情况;用蛋白印迹法(Western-blot,WB)定量检测上述细胞株及7例骨肉瘤组织中hTERT的表达情况.结果 免疫细胞/组织化学显示,HeLa细胞hTERT表达率最高(95.16%);MG-63、SAOS-2、U2-OS细胞系中hTERT阳性率分别为8.75%、5.26%、2.33%;骨肉瘤组织中hTERT表达阳性率26.7% (4/15).蛋白印迹法显示,Hela、MG-63及两个骨肉瘤样本(OS1和OS2)有hTERT表达,U2-OS及SAOS-2中几乎没有hTERT表达.结论 hTERT在骨肉瘤中表达很低,可能无法成为骨肉瘤的临床治疗靶点.     

端粒酶永生化原始乳腺癌组织来源细胞及其意义

背景与目的：乳腺癌细胞系大部分来源于乳腺癌转移所致的胸水或非原始乳腺癌组织来源，与真正的乳腺癌的生物学性状有很大差异。而仅部分细胞系直接由乳腺癌原代细胞在体外培养条件下成为永生化的细胞系，过表达人端粒酶逆转录酶（hTERT）可使正常人上皮细胞永生化。本研究将通过hTERT转染人原始乳腺癌组织来源的细胞建立永生化乳腺癌细胞系，并研究过表达hTERT对其他基因表达的影响。方法：通过重组逆转录病毒pBABE-hTERT-puro将hTERT基因导人原始乳腺癌组织来源的细胞，建立稳定表达hTERT的永生乳腺癌细胞。再利用微阵列技术检测乳腺癌细胞中hTERT诱导的基因表达改变。结果：Real-TimeRT-PCR证实hTERT转染后的乳腺癌细胞中hTERT过度并稳定表达，为转染前表达量的1400倍以上，并使得被转染的细胞永生化，可以传40～50代以上。微阵列结果进一步证实hTERT在转染后的细胞中过表达，另外，有22个基因在转染后的乳腺癌细胞中上调，未观察到所有细胞株中均下调的基因。结论：过表达hTERT可导致乳腺癌原代细胞的永生化，并对部分基因有上调作用。