人细胞周期蛋白H基因的真核表达载体构建和表达及功能检测

<正>细胞周期蛋白H(cyclin H)是一种含323个氨基酸,相对分子质量(Mr)为38 000的细胞周期调控蛋白,普遍存在于真核细胞中,可与细胞周期蛋白依赖性激酶7(cyclin-dependent kinase 7,CDK7)共同参与细胞周期和基因转录的合理调控,其复合体可以催化各种CDK分子的活化,从而影响细胞增殖[1]。Cyclin H可催化多种CDK(如CDK2、CDK4、     

组蛋白共价修饰——组蛋白H3第4赖氨酸甲基化

染色体组蛋白的共价修饰在调节染色体结构,控制基因的转录等方面发挥重要的作用。组蛋白H3第4赖氨酸的甲基化作为共价修饰的方式之一,可以调控基因的转录激活。随着对组蛋白甲基化转移酶及相关作用蛋白研究的深入,人们对组蛋白H3第4赖氨酸的甲基化的功能也有了更深的了解。目前研究发现它与癌症也有很密切的关系。     

前列腺癌细胞组蛋白H3甲基化的差异

 目的：整体分析雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌细胞组蛋白H3甲基化差异,探讨前列腺癌从激素依赖性发展为非激素依赖性的表观遗传机制。方法：应用重甲基细胞培养条件下氨基酸稳定同位素标记(SILAC)技术结合生物质谱分析雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP和非依赖性前列腺癌细胞DU145组蛋白H3的甲基化修饰谱,寻找差异的修饰位点和模式;通过Western blotting验证所发现的差异修饰;采用real-time PCR检测2株细胞相关甲基化酶和去甲基化酶的表达差异。结果：质谱鉴定发现2株前列腺癌细胞的组蛋白H3存在5个甲基化位点,甲基化模式分别为H3K14me2、H3R17me1、H3K36me1、H3K36me2、H3K36me3、H3R72me2、H3K79me1和H3K79me2。其中,包含甲基化位点H3K36的肽段有2种,分别为“KSAPATGGVKKPHR”和“KSAPSTGGVKKPHR”,前者鉴定到的频数高于后者,两者的区别在于第31位的氨基酸分别为A与S,前者归属于组蛋白H3变异体H31T、H31和H32,主要出现在DU145细胞中,后者归属于组蛋白H3变异体H33,在LNCaP细胞中出现次数稍多;提示2株细胞可能表达不同的组蛋白H3变异体,从而导致甲基化模式的差异。Western blotting检测发现H3K36的一甲基化和二甲基化在2株细胞间没有差异,而其在DU145细胞中的三甲基化程度显著高于LNCaP细胞。Real-time PCR检测显示DU145细胞的H3K36去甲基化酶mRNA表达比LNCaP细胞有所降低。结论：组蛋白H3变异体和H3K36去甲基化酶的差异表达可能导致非激素依赖性前列腺癌细胞H3K36三甲基化增加,成为前列腺癌从激素依赖性发展为非激素依赖性的一种表观遗传转变。     

siRNA靶向干扰组蛋白H3表达对人鼻咽癌细胞增殖的抑制作用

 目的：应用RNA干扰技术抑制人鼻咽癌细胞株CNE1中组蛋白H3的表达,观察其对鼻咽癌细胞增殖的影响。方法：构建针对组蛋白H3的小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,转染CNE1细胞并筛选获得稳定表达细胞株。实时荧光定量RT-PCR和Western blotting检测细胞中组蛋白H3 mRNA和蛋白表达的改变;CCK-8法和平板克隆形成实验观察细胞增殖能力的改变;双萤光素酶报告系统检测细胞激活蛋白1（AP-1）转录活性的改变。结果：与阴性对照组和空白对照组相比,siRNA-H3质粒转染组的组蛋白H3 mRNA和蛋白表达均显著下降,细胞生长速度明显减慢,表皮生长因子诱导的细胞克隆形成能力和AP-1转录活性均受到明显抑制。结论：通过RNA干扰技术阻断组蛋白H3的表达,可抑制CNE1细胞的生长、增殖,其机制可能与下调AP-1转录活性有关。组蛋白H3 可能是潜在的肿瘤治疗新靶点。     

真核表达载体pEGFP-GPC3的构建及表达

目的:构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)真核表达载体pEGFP-GPC3,并在小鼠树突状细胞(DC)表达.方法:将质粒pCMV-SPORT6-GPC3和载体pEGFP-N1分别进行双酶切获得目的基因GPC3片段和空载体,回收纯化后用T4连接酶将两者连接并转化E.coli DH5α菌株,用EcoR I、BamH I双酶切鉴定后通过脂质体法转染到DC中,然后进行荧光检测和Western blot分析.结果:构建的真核表达载体pEGFP-GPC3,转染DC后,荧光显微镜下可见转染的DC中有EGFP-GPC3融合蛋白的表达,Western blot分析发现有相对分子质量(M,)大小约为67 000的蛋白条带.结论:成功地构建了真核表达载体pEGFP-GPC3并在转染DC后能在其中表达,为进一步研究GPC3基因的功能提供实验基础.     

组蛋白H3甲基化修饰与心脏发育的研究进展

正哺乳动物心脏发育需要干细胞的精确定位、增殖以及心肌祖细胞的分化等过程~([1]),这一系列过程涉及到多个心脏目的基因的精确编程调控。心脏基因组装于致密的染色质结构中,而染色质的基本单位核小体主要是由147 bp碱基对组成的线性DNA盘绕于组蛋白八聚体外侧构成~([2])。心脏目的基因的表达除了与基因序列相关外,还与心脏关键转录因子及基因组染色质结构修饰因子等表观遗传学途径密切相关。表观遗传学修饰是在基因序列不变的情     

人组蛋白H1基因的原核表达、纯化及其活性检测

目的:克隆人组蛋白H1全长编码区基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化以及活性检测.方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人组蛋白H1全长编码区基因,将其克隆到pGEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达与纯化产物.结果:从人乳腺文库中扩增获得约650 bp的DNA片段,并成功克隆至pGEX-KG载体上,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出相对分子质量(Mr)约为52 000的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白GST-H1,激酶实验证明该蛋白活性良好.结论:成功获得了活性良好的重组蛋白GST-H1,为后续研究细胞周期蛋白调控奠定了实验基础.     

磷酸化组蛋白H3——检测心肌细胞有丝分裂指数的可靠指标

目的采用磷酸化组蛋白H3鉴定心肌细胞有丝分裂,为研究心肌细胞增殖机制奠定形态学基础。方法对H9c2(2-1)大鼠心肌细胞进行培养,利用免疫荧光双重染色技术,用横纹肌肌动蛋白IgM单克隆抗体标记心肌细胞,用磷酸化组蛋白H3 IgG单克隆抗体标记有丝分裂的染色体,同时用Hochest 33342显示细胞核,荧光显微镜观察并摄片。结果心肌细胞胞质呈红色荧光,有丝分裂的染色体呈现不同形状的绿色荧光,胞核为蓝色。结论磷酸化组蛋白H3是观察和鉴别心肌细胞有丝分裂的可靠指标。     

甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体的构建与表达

目的:构建甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏首例甲型H1N1流感病毒毒株(A/Nan jing/1/2009(H1N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-NS1质粒,双酶切pMD18-T-NS1与PXJ40-HA后,构建真核表达载体PXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功。West-ern blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达。结论:成功克隆NS1全长基因,并构建了其真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究提供了材料。     

人PRMT1真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建人PRMT1基因真核表达载体,并进行表达检测及鉴定。方法:采用RT-PCR技术扩增人PRMT1全长cDNA;经过双酶切、连接等反应,构建pcDNA3.1(+)-PRMT1真核表达载体,并转化DH5α感受态细胞;用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆;经菌液PCR及测序鉴定重组质粒;瞬时转染A549细胞,采用实时定量PCR检测重组质粒的表达水平及PRMT1对eotaxin-1和ccr-3表达的影响。通过Western blot从蛋白水平检测重组质粒在真核细胞内的表达。结果:RT-PCR扩增的人PRMT1全长cDNA为1136 bp;所筛选出的pcDNA3.1(+)-PRMT1重组载体中插入片段与NCBI GenBank文库中人PRMT1 cDNA的序列完全一致;实时定量PCR和Western blot检测证实重组质粒在A549细胞内可高效表达;并且PRMT1与eotaxin-1和ccr-3的表达呈正相关性。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-PRMT1重组载体,为进一步研究PRMT1基因的作用机制奠定基础。     

mTSARG3真核表达载体的构建及其稳定转染细胞系的建立

目的:构建小鼠mTSARG3基因真核表达载体,转染小鼠精原细胞系GC-1,建立稳定转染mTSARG3的GC-1细胞系,利用流式细胞技术(FCM)进行初步功能研究。方法:应用RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mTSARG3的开放阅读框(ORF),并将PCR产物插入到pGEM-TEasy载体中测序验证。随后,经NotI和Hind III酶切后将目的片段进一步克隆到pcDNA3.1 Hygro(-)真核表达载体中。将经过测序验证的pcDNA3.1 Hygro(-)/mTSARG3表达质粒转染GC-1细胞,通过潮霉素筛选建立mTSARG3稳定转染的GC-1细胞系。RT-PCR和Western blot检测mTSARG3在稳定转染的GC-1细胞系中的表达;FCM观察转染pcDNA3.1 Hygro(-)/mTSARG3重组质粒)对GC-1细胞周期和凋亡的影响。结果:成功构建了pcDNA3.1 Hygro(-)/mTSARG3表达质粒,建立了稳定转染的GC-1细胞系。RT-PCR和Western blot检测结果发现,mT-SARG3在GC-1细胞系中成功表达。进一步通过FCM检测分析发现,转染mTSARG3可促进GC-1细胞增殖,抑制细胞凋亡。结论:mTSARG3真核表达载体的成功构建和稳定转染重组质粒GC-1细胞系的建立为进一步体外研究mTSARG3的功能奠定了基础。     

IFITM3真核表达载体的构建和细胞内定位研究

目的构建人干扰素诱导的跨膜蛋白3(IFITM3)的真核表达载体并观察其表达产物的细胞内定位,以研究IFITM3的蛋白功能及作用机制。方法提取人外周血淋巴细胞mRNA,行RT-PCR扩增IFITM3编码序列并经琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小,PCR产物及真核表达载体pEGFP-C2经酶切、连接、转化入Top10菌株进行筛选和扩增,重组的pEGFP-C2-IFITM3载体用酶切及DNA测序鉴定其插入序列的正确性,进而转染该重组真核表达载体进入sy5y细胞,倒置荧光共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞内定位。结果琼脂糖凝胶电泳显示经RT-PCR的扩增产物与IFITM3编码区的实际长度相吻合,重组入绿色荧光载体pEGFP-C2的pEGFP-C2-IFITM3经酶切和测序显示实际连入的DNA片段大小、序列及读码框均正确。经真核表达后,重组蛋白定位于细胞膜和在细胞内存在颗粒样聚集。结论成功构建IFITM3的真核表达载体,该载体表达的IFITM3融合蛋白在细胞内定位清晰,为后续的IFITM3功能研究奠定了基础。     

IgA肾病组蛋白H3K4三甲基化和DNA甲基化基因修饰的相关性

目的: 探讨IgA肾病(IgAN)外周血单个核细胞(PBMCs)组蛋白H3赖氨酸4 (H3K4)三甲基化与DNA甲基化之间的关系。方法: 采用染色质免疫共沉淀联合芯片技术(ChIP-chip)对40例IgAN患者和40例健康者的PBMCs H3K4三甲基化进行高通量筛选,染色质免疫共沉淀-实时定量聚合酶链反应 (ChIP-qPCR) 验证芯片结果,定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测阳性基因的mRNA表达水平,采用甲基化DNA免疫共沉淀定量聚合酶链反应(MeDIP-qPCR)检测DNA甲基化水平。结果: IgAN病人PBMCs 基因组H3K4三甲基化水平升高,基因组DNA甲基化水平降低。 4个阳性基因H3K4三甲基化水平和DNA甲基化水平与正常对照组相比,显著差异(P<0.05)。结论: IgAN患者PBMCs基因组H3K4三甲基化和DNA甲基化水平存在显著改变,DNA甲基化和组蛋白H3K4三甲基化基因修饰存在相互作用。     

组蛋白变异体macroH2A1真核表达载体构建及其细胞内定位的研究

目的构建带有血凝素（HA）标签的小鼠组蛋白变异体macroH2A1（mH2A1）的真核表达载体,并观察其在人胚肾293T细胞中的表达定位情况。方法提取内毒素休克的BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过逆转录-聚合酶链反应获得内毒素休克小鼠肝脏组织的cDNA,以cDNA为模板使用PCR方法扩增得到mH2A1编码序列,并将其酶切后连接至带有HA标记的载体pcDNA3-HA上;对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。随后将重组质粒瞬时转染293T细胞,利用荧光显微镜观察。结果 PCR、双酶切和测序鉴定表明pcDNA3-mH2A1-HA真核表达质粒构建正确;经转染实验发现,该质粒能够在293T细胞中表达,表达产物主要定位在细胞核中。结论 mH2A1真核表达载体pcDNA3-mH2A1-HA的成功构建及明确其在哺乳动物细胞中的具体核定位,为进一步研究mH2A1作用细胞的信号通路提供了一个重要的工具。     

组蛋白H3K27M诱发弥漫中线胶质瘤的发病机制

弥漫中线胶质瘤属于高度恶性的胶质细胞肿瘤,H3 K27 M突变是其重要的分子改变.研究显示,H3 K27 M可能通过多种途径影响PRC2活性,减少H3 K27三甲基化程度.H3 K27 me3的降低,使其受抑制的基因激活,导致肿瘤的发生.该文现对H3 K27 M诱发弥漫中线胶质瘤的多种可能机制及相关靶向治疗进展作一综述...     

GILZ真核表达载体的构建及其表达定位

目的:克隆、构建HA标签的糖皮质激素诱导亮氨酸拉链蛋白GILZ表达载体,观察其在细胞中表达与定位,为研究GILZ在脂肪细胞分化中的作用提供工具。 方法：采用逆转录PCR（RT-PCR）法从C3H10T1/2细胞中扩增带有HA标签的GILZ cDNA编码区,并将其重组于真核表达载体pcDNA3中。经酶切、序列鉴定分析后,将该重组质粒通过Lipofectamine 2000脂质体和CaCl2方法,分别转染C3H10T1/2和293T细胞,用HA抗体免疫荧光和免疫印迹法检测GILZ在细胞内的表达、分布及分子量大小。 结果：HA-GILZ表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在C3H10T1/2和293T细胞中获得了高效表达。在荧光显微镜下,GILZ主要表达于细胞质内,分子量约20 kD。 结论：成功构建HA-GILZ基因表达载体并表达于C3H10T1/2细胞质中,为GILZ的功能研究奠定了基础。     

人颗粒酶B真核表达载体的构建与表达分析

目的:构建能在Hep2细胞中表达的颗粒酶B的表达质粒pVAX1-GrB。方法:用淋巴细胞分离液分离肿瘤组织中的淋巴细胞,并抽提RNA,用RT-PCR方法扩增其分泌蛋白颗粒GrB的全部外显子片段,利用基因重组技术将其定向插入pVAX1多克隆位点。脂质体介导转染Hep2细胞,用间接免疫荧光法观察目的蛋白在细胞中的表达。结果:限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实成功获得GrB基因片段,GrB准确克隆入pVAX1的多克隆位点,未改变读码框架。转染Hep2细胞后,检测到目的蛋白的表达。结论:成功构建了pVAX1-GrB,并在Hep2细胞中得到表达。     

甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与宿主蛋白的相互作用的初步研究

目的利用酵母双杂交技术研究甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与人类宿主蛋白的相互作用,为该病毒蛋白的功能研究和致病机制提供理论依据。方法以本实验室分离和鉴定的甲型H3N2流感病毒A／Guangdong／7028／2010为模版,构建pGBKT7-PB1-F2重组载体,利用Y2HGold酵母双杂交系统,从人类通用cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白。结果成功构建含诱饵蛋白基因的pGBKT7-PB1-F2重组载体,转化酵母自激活和毒性实验显示为阴性：酵母双杂交实验显示Y2HGold和Y187酵母的结合率为5．22％,符合实验要求;经筛选和验证后,得到3个与截短型PB1-F2蛋白有相互作用的阳性克隆,分别为钾／钠ATP酶B1亚基、热休克蛋白40和白介素-2受体1亚基。结论初步推断截短型H3N2流感病毒PB1-F2蛋白可能影响流感病毒在宿主细胞中的复制功能和凋亡调控。     

人DcR3 表达载体的构建及验证

目的:构建人DcR3 表达载体并验证其在体外细胞表达情况。方法:从人血液组织中扩增出DcR3 中长度915 bp 的CDS 区,将其克隆到带有红色荧光的真核表达载体pEF1a-IRES-DsRed-Express2 上,用FuGene HD 转染法转染到肝星状细胞(LX-2)中,用RT-PCR 以及Western blot 检测其mRNA 表达量和蛋白表达量。结果:通过RT-PCR 和Western blot 检测显示转染DcR3 表达载体质粒的肝星状细胞中DcR3 的转录和翻译水平均显著性提高。结论:成功构建出人DcR3 表达载体并在LX-2 细胞中高效表达。