人成骨细胞系hFOB1．19生物学特性的研究

本研究以成骨细胞系hFOB1．19（hFOBs）为对象，探讨成骨细胞在造血调控中的作用。采用RT-PCR检测hFOB多能干细胞的标志（Oct-4，Rex-1，hTERT）的表达及体外向脂肪细胞诱导分化程度，以测定其多向分化的能力。用流式细胞术（FCM）检测hFOB的细胞表型，RT—PCR检测细胞因子（SCF，IL-6，IL-11，SDF-1α，GM—CSF及G—CSF）的表达，并和骨髓来源的间充质干细胞（BM—MSC）进行比较。结果表明：hFOBs可表达Oct-4、Rex-1多能干细胞的标志，但不表达hTERT；体外诱导分化实验证实hFOB具有多向分化潜能。FCM发现hFOBs和BM—MSC具有相同的细胞表型，均表达CD44、CD73（SH3）、CD105（SH2）及CD90（Thy-1），但不表达CD34、CD45、HLA—DR等造血细胞标记。RT—PCR检测还发现：hFOBs和BM—MSC均表达SCF，IL-6，IL—11，SDF-1α等细胞因子mRNA，但hFOBs还能表达GM-CSF和G-CSF。结论：人成骨细胞系hFOB1．19可能是处于较早阶段的成骨祖细胞，表达多种造血相关的细胞因子，是研究成骨细胞调控造血的较好的模式系统。     

骨髓间充质干细胞分化的成骨细胞支持脐血造血干祖细胞的研究

本研究利用骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞构建二维培养体系,探讨其体外支持脐血干/祖细胞生存的作用.体外进行人骨髓间充质干细胞（MSC）原代培养后诱导为成骨细胞,构建二维培养体系.将免疫磁珠分选的CD34^＋脐血干/祖细胞接种于其中,在无外源性细胞因子情况下进行体外培养,进行CFU,HPP-CFU和LTC-IC测定并将其分别与MSC、成骨细胞,MSC/成骨细胞（1：2）作为饲养细胞的二维培养体系实验结果相比较.结果发现：在所构建的造血干/祖细胞（HSPC）二维培养体系中,骨髓MSC诱导成骨细胞对于脐血造血干/祖细胞培养的支持作用显著优于其他各组培养体系,尤其对长期造血干细胞（long term-HSC）体外生存有更为明显地支持作用.结论：骨髓间充质干细胞诱导成骨细胞构建的二维体系对于脐血干/祖细胞体外培养具有支持作用,进一步证实成骨细胞对造血干细胞生存与增殖具有重要调控作用.     

干细胞因子与骨髓增生异常综合征

干细胞因子(SCF)为迄今所发现的作用于造血最早阶段的细胞因子。它在维持适宜的造血微环境及造血干细胞的生存中起重要作用,并且能刺激造血干细胞和早期造血祖细胞的增殖和分化。骨髓增生异常综合征(MDS)病人SCF水平明显低于正常。而且,低的骨髓血浆SCF水平与病人骨髓前体细胞呈白血病性生长方式有关。体外加入外源性SCF可刺激MDS病人造血前体细胞集落形成,部分地恢复MDS患者的骨髓造血功能。     

重组人干细胞因子对骨髓增生异常综合征长期骨髓培养和集落形成的影响

骨髓增生异常综合征(MDS)是造血干细胞异质性克隆性疾病,有报道MDS祖细胞对细胞因子刺激的反应能力有缺陷,其骨髓培养中细胞集落形成明显低于正常人。而干细胞因子(SCF)尤其是与GM-CSF、G-CSF及IL-3联合应用可显著地增加MDS病人CFU-GM的体积和集落数。尤以对红细     

低危骨髓增生异常综合征患者间充质干细胞的生物学特性的实验研究

骨髓增生异常综合征的发病机制至今尚未明确，有研究表明MDS患者骨髓基质微环境功能的异常与其发病有关。间充质干细胞是造血微环境的重要成分，本研究拟探讨低危MDS患者间充质干细胞（MSC）的生物学特性及功能．采集低危MDS患者的骨髓标本，分离、培养和扩增MSC，观察细胞形态，进行免疫表型、成骨分化能力鉴定，检测其增殖能力及对体外造血的支持功能；用实时定量RT—PCR法测定MSC中相关细胞因子及化学趋化因子的表达，并与健康供者的MSC进行比较。结果表明：培养低危MDS患者的MSC呈典型的成纤维细胞样，细胞表达SH2（CD105），SH3（CD73），Thy—1（CD90），CD34及CD45均为阴性，诱导后可向成骨细胞分化。其体外扩增能力与与健康供者相比无显著差异（P〉0．05），但体外支持造血功能较后者显著减低（P〈0．05）。实时定量PT—PCR显示SDF—1在低危MDS患者MSC中显著高表达（P〈0.01）。结论：间充质干细胞的功能异常与低危MDS患者骨髓微环境的造血调控失常相关，这为MDS发病机制的认识及治疗提供了新的思路，值得进一步探讨。     

骨髓间充质干细胞体外分化过程中端粒酶活性表达及意义

目的：探讨体外诱导兔骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞覆其扩增过程中端粒酶活性的表达及其意义。方法：联合应用密度梯度离心和贴壁培养法分离骨髓间充质干细胞，继而诱导其向内皮细胞方向分化并传代培养。用TRAPezeELISA法和TRAP银染法分别检测骨髓问充质干细胞体外诱导分化前后端粒酶活性。结果：兔骨髓问充质干细胞体外培养时具有快速增殖能力，在特定环境中诱导分化细胞具有内皮细胞特征；增殖前的骨髓阃充质干细胞端粒酶活性低水平表达，一旦经过诱导分化其端粒酶活性表达上调，在5代内其端粒酶活性不因细胞传代而下降或消失。结论：骨髓间充质干细胞在体外有限扩增和诱导分化时保持端粒酶活性，维持组织干细胞特性，为内皮祖细胞的临床研究奠定理论基础。     

脐血单个核细胞与骨髓间充质干细胞滋养层的共培养

背景:骨髓间充质干细胞具有维持骨髓正常造血功能,在造血调控中发挥重要的作用。目的:观察骨髓间充质干细胞的生物学性状和多向分化能力,并检测其在体外支持造血的能力。方法:利用密度梯度培养法分离骨髓单个核细胞进行培养,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表型;接种脐血单个核细胞于骨髓间充质干细胞滋养层培养板上共培养,观察粒-单系祖细胞集落变化。结果与结论:骨髓间充质干细胞呈典型的成纤维样细胞形态,强表达CD44,CD29,不表达CD34和CD106。可促进脐血单个核细胞扩增并形成造血祖细胞集落。提示骨髓间充质干细具有造血支持作用。     

骨髓增生异常综合征患者间充质干细胞的生物学特性及其支持造血的体外研究

为了解骨髓增生异常综合征（MDS）患者间充质干细胞（MSC）的生物学特性,探讨其对体外造血的支持能力,采集MDS的骨髓标本,分离、培养和扩增MSC,进行细胞形态观察和免疫表型、成骨分化及增殖能力检测,并对骨髓细胞进行成纤维细胞集落（CFU-F）形成分析.对MDS患者的MSC进行贴壁培养,接种脐血单个核细胞（MNC）,以观察细胞数和CFU-GM的变化,作为MDS患者MSC支持造血体外实验.结果表明：来自MDS患者的MSC呈典型的成纤维样细胞形态,表型鉴定CD34,CD45阴性,SH2（CD105）,SH3（CD73）,Thy-1（CD90）阳性,体外诱导可向成骨细胞分化,其增殖能力和CFU-F形成能力与源于正常供者的MSC相当.支持造血的体外实验显示,实验组培养上清中的细胞总数和CFU-GM计数在第2周后均显著低于对照组（P＜0.05）.结论：来源于MDS患者骨髓的间充质干细胞的生物学特性与正常供者的MSCs无差异,但其体外支持造血的功能较后者显著减弱.     

骨髓间充质干细胞体外诱导向内皮和上皮细胞的分化

背景：骨髓来源的间充质干细胞在体外具有多系分化潜能,但其在体外向肺组织细胞的分化能力尚存在争议。目的：体外诱导验证小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞和上皮细胞分化的能力。方法：分离小鼠骨髓来源的间充质干细胞,以内皮诱导液向内皮细胞分化。另外将小鼠骨髓间充质干细胞分别在以下诱导培养基中进行上皮诱导3周：单纯上皮诱导培养液,上皮诱导培养液加10μg/L转化生长因子β1,并以未经诱导的小鼠骨髓间充质干细胞作为阴性对照,肺泡上皮作为阳性对照。结果与结论：小鼠骨髓间充质干细胞在上皮诱导培养液中诱导培养3周后,部分细胞由梭形变为典型的卵石样上皮细胞形态,诱导后约 60%细胞表达广谱上皮细胞标志pan-CK,RT-PCR结果显示分化后的细胞表达上皮细胞特异标志CK18,未经诱导的间充质干细胞未表达。小鼠骨髓间充质干细胞在内皮诱导24h后即出现了典型的血管网状结构,vWF免疫荧光染色显示约 70%的细胞呈阳性,RT-PCR 显示分化后的细胞表达内皮细胞特异性标志CD31、vWF和 CD34。提示骨髓来源的间充质干细胞体外诱导培养具有跨胚层多系分化能力。     

骨髓间充质干细胞体外诱导向内皮和上皮细胞的分化

背景:骨髓来源的间充质干细胞在体外具有多系分化潜能,但其在体外向肺组织细胞的分化能力尚存在争议.目的:体外诱导验证小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞和上皮细胞分化的能力.方法:分离小鼠骨髓来源的间充质干细胞,以内皮诱导液向内皮细胞分化.另外将小鼠骨髓间充质干细胞分别在以下诱导培养基中进行上皮诱导3周:单纯上皮诱导培养液,上皮诱导培养液加10 μg/L 转化生长因子β1,并以未经诱导的小鼠骨髓间充质干细胞作为阴性对照,肺泡上皮作为阳性对照.结果与结论:小鼠骨髓间充质干细胞在上皮诱导培养液中诱导培养3周后,部分细胞由梭形变为典型的卵石样上皮细胞形态,诱导后约60%细胞表达广谱上皮细胞标志pan-CK,RT-PCR结果显示分化后的细胞表达上皮细胞特异标志CK18,未经诱导的间充质干细胞未表达.小鼠骨髓间充质干细胞在内皮诱导24 h后即出现了典型的血管网状结构,vWF免疫荧光染色显示约70%的细胞呈阳性,RT-PCR显示分化后的细胞表达内皮细胞特异性标志CD31、vWF和CD34.提示骨髓来源的间充质干细胞体外诱导培养具有跨胚层多系分化能力.     

多发性骨髓瘤骨髓间充质干细胞生物学特性分析

为了研究多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）病人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）的病理生物学特性，以探讨MSC在MM骨损伤发生中的作用，取11例初治MM病人和5例正常人骨髓，用贴壁法体外分离培养MSC。应用流式细胞术分析MM骨髓MSC表型，MTT法检测MSC增殖能力，组织化学染色测定细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化能力。应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定细胞培养上清液中白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stem cell factor，SCF）浓度。收集MSC培养上清作为条件培养液，按梯度浓度加入人SKO007骨髓瘤细胞系培养体系中，MTT法测定细胞增殖能力差异。结果表明：与正常人骨髓MSC比较，MM患者骨髓MSC的表型无改变，均一表达CD29、CD73、CD166和HLA-ABC，不表达CD45和CD31；MM患者骨髓MSC增殖和分化能力正常，且具有相似的成骨和成脂肪分化功能；MM骨髓MSC分泌IL-6和SCF的水平均明显高于正常；MM来源的MSC培养上清显著促进SKO007细胞的增殖。结论：MM患者骨髓MSC的增殖分化功能正常，MM时骨损伤可能与MSC分化功能无关，而IL-6和SCF高表达为骨髓瘤细胞提供了必要的生存信号。     

成骨细胞的体外培养与鉴定

背景：成骨细胞的体外培养方法均存在一定的局限性。目的：对体外培养成骨细胞的来源,成骨细胞的培养方法及培养条件,鉴定成骨细胞的标志进行总结。方法：以＂Osteoblast,cell culture,identification＂为检索词,检索PubMed数据库（2000/2010）,以＂成骨细胞、细胞培养、鉴定＂为检索词,检索万方数据库（2000/2010）,文献检索语种限制为英文和中文。纳入与成骨细胞的体外培养及鉴定密切相关的研究,排除重复性研究和Meta分析后对文献进行综述。结果与结论：随着体外细胞培养技术的发展,人们已经从许多动物的骨、骨膜、骨髓及骨外组织中成功培养了成骨细胞,经鉴定具有典型成骨细胞的特征及良好的生物学特性,目前体外培养成骨细胞为常用的体外实验模型,成为研究骨生理、病理及修复的重要手段,也成为研究成骨细胞生长代谢及骨组织工程的基础。     

脂肪间充质干细胞的基本生物学特性及其向成骨细胞分化的特征

背景最早研究的是骨髓来源的间充质干细胞.由于脂肪组织与骨髓同为中胚层起源的组织,那么能否从脂肪组织中获得间充质干细胞,而且也具有多分化潜能呢?目的研究脂肪间充质干细胞的基本生物学特性以及在特定培养条件下向成骨细胞分化,探讨其作为骨组织工程的种子细胞的可行性.设计以细胞为研究对象的随机对照实验.单位北京大学第三医院骨科.对象实验于2002-10/2004-01在北京大学第三医院骨科完成,实验对象为从Lewis大鼠脂肪组织中提取的间充质干细胞.方法取3周龄Lewis大鼠的腹股沟脂肪垫,消化法获得脂肪间充质干细胞,分别用脂肪诱导培养基和成骨诱导培养基诱导其向脂肪细胞与成骨细胞分化,组织化学染色、免疫细胞化学染色和Western blotting检测细胞分化的情况.主要观察指标脂肪间充质干细胞的形态学和生物学特性,以及成骨诱导后成骨细胞特异性标志.结果从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪间充质干细胞,体外培养呈成纤维细胞样,能大量稳定增殖传代.原代脂肪间充质干细胞能自发分化为脂肪细胞,传代细胞在胰岛素和地塞米松的作用下生成脂滴,过氧化物酶体增殖物激活受体?表达增强,向脂肪细胞分化;在地塞米松、抗坏血酸、?-甘油磷酸钠的诱导下,碱性磷酸酶活性检测显示诱导组与对照组差异有显著性意义(P＜0.01),yon Kossa染色出现钙结节,骨桥蛋白免疫细胞化学染色阳性,Western blotting检测到诱导后细胞骨桥蛋白的表达.结论从脂肪组织中可获得具有多分化潜能的间充质干细胞,经诱导后可分化为脂肪细胞和成骨细胞,有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一.     

骨髓基质干细胞成骨分化过程中Wnt、骨形态发生蛋白2信号通路相关因子与辛伐他汀的作用

背景:辛伐他汀可促进体外培养的人或鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化,但作用机制尚不清楚。目的:观察辛伐他汀对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程中Wnt与骨形态发生蛋白2信号途径中相关因子表达的影响。方法:取6周龄雌性SD大鼠双侧股骨、胫骨全骨髓进行体外成骨细胞诱导培养。实验分为对照组及SIM组。SIM组加入浓度为10-7mol/L辛伐他汀,对照组加入等量无水乙醇和PBS。培养14d,行碱性磷酸酶染色,28d时,行vonKossa染色观察细胞外基质矿化情况;培养14,21d,免疫荧光细胞化学染色观察成骨细胞中β-catenin,Smad1/5,Cbfa1的表达及分布。结果与结论:大鼠骨髓基质干细胞经体外诱导后可分化为具有碱性磷酸酶活性和矿化细胞外基质能力的成熟成骨细胞。辛伐他汀可显著上调骨髓基质干细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶的表达。同时,与对照组比较,SIM组β-catenin,Smad1/5,Cbfa1表达明显增多(P<0.05),且呈现明显的核内聚集趋势。说明辛伐他汀促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的作用可能与调控Wnt与骨形态发生蛋白2信号通路中相关因子的表达及细胞内分布有关。     

纳米晶羟基磷灰石/胶原骨与骨髓间充质干细胞的相容性

背景：组织工程支架材料表面的微观和亚微观结构对细胞的黏附与生长有很重要的影响。利用纳米技术和三维造孔技术制备的纳米晶羟基磷灰石，胶原骨模仿了天然骨的成分与微结构特征。目的：观察体外培养的人骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石，胶原骨的细胞相容性。设计、时间及地点：单一样本观察，于2005-09／2006—12在江苏大学医学技术学院完成。材料；纳米晶羟基磷灰石，胶原骨由清华大学材料科学与工程系研制。人骨髓间充质干细胞由健康成年志愿者自愿捐献，受试者对实验内容知情同意。方法：全骨髓法体外培养骨髓间充质干细胞，应用成骨诱导剂（地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油、碱性成纤维细胞生长因子）诱导向成骨细胞表型转化。将第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石，胶原骨复合培养14d。主要观察指标：通过碱性磷酸酶组织化学染色、Von Kossa染色鉴定诱导培养的成骨细胞的细胞学特性。通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞生长及其在纳米晶羟基磷灰石，胶原骨上的生长情况。结果：原代培养的骨髓细胞增殖迅速，10～12d左右即可稳定传代，传代细胞7-9d即可传代。经诱导培养的细胞碱性磷酸酶组织化学染色阳性，Von Kossa染色阳性，可见钙化的基质沉积，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。构建的骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石／胶原骨共培养模型中，细胞可在纳米晶羟基磷灰石，胶原骨表面良好贴壁。复合培养8d，分布于支架材料上的细胞大量增殖、分泌细胞外基质。复合培养14d，大量细胞在材料表面和孔隙中生长，细胞之间广泛存在突起连接。结论：纳米晶羟基磷灰石肢原骨适合种子细胞的贴附、生长和增殖，细胞相容性良好。     

成骨细胞培养在骨组织工程和运动领域的研究进展

背景:成骨细胞在不同的培养环境、细胞因子刺激下增殖、分化及功能不同。目的:总结成骨细胞体外培养技术与成骨细胞增殖速度的研究进展。方法:检索1990/2011 PubMed数据及万方数据库有关运动、成骨细胞培养和骨组织工程等方面的文献,英文检索词为"exercise,Osteoblast raise method",中文检索词为"运动,成骨细胞,骨组织工程"。排除与研究目的无关和内容重复者。保留29篇文献做进一步分析。结果与结论:骨组织工程构建中种子细胞的选择方式、支架材料的不同形式、细胞因子、培养环境、力学因素都对成骨细胞的培养有重要影响。构建骨组织工程中成骨细胞在不同的培养环境、细胞因子刺激下会有不同的增殖能力和分化结果。成骨细胞的增殖速度与旋转壁式生物反应器提供的低剪力环境、适宜的细胞因子、细胞支架的选择密切相关。     

猪骨髓间质干细胞的分离培养及分化潜能的鉴定

目的：建立猪骨髓间质干细胞(MSCs)的体外分离培养和鉴定的方法，探讨体外培养的间充质干细胞的一些生物学特点，为利用猪的实验研究提供实验基础。方法：猪的髂嵴穿刺吸取骨髓，经密度梯度离心得到骨髓单个核细胞，接种后形成单层贴壁的成纤维样的细胞。检测细胞周期，多向诱导分化鉴定分离的细胞。结果：体外培养的原代MSCs12～14d达到融合，传代后仍具有分化成骨的能力，细胞周期显示有80％的细胞处于GO／G1期。结论：体外培养猪的MSCs具有分化成骨的潜能，生长稳定，传代后仍保持未分化状态．猪骨髓间充质干细胞分离培养体系的建立为基础研究和组织工程提供了一个有价值的动物模型。