人免疫缺陷病毒I型外膜糖蛋白gp^120和gp^160在重组痘苗…

人免疫缺陷病毒Ｉ型（ＨＩＶ－１）是严重威胁人类健康的病原体，其主要抗原是病毒外膜糖蛋白ｇｐ＾１６０（ｇｐ＾１２０＋ｇｐ＾４１）。本文报道运用遗传工程技术，在噬菌体Ｔ７启动子或痘苗病毒启动子ｐ７．５控制下，在重组痘苗病毒系统中构建和表达ＨＩＶ－１ｇｐ＾１２０和ｇｐ＾１６０。进一步研究表明，在此系统中表达的重组ＨＩＶ－１ｇｐ＾１２和ｇｐ＾１６０以糖蛋白形式存在，保留着病毒在自然状况下的抗原表位构象，可     

HIV-1 gp160多表位嵌合基因的构建及表达蛋白的免疫原性分析

目的:HIV感染引起的AIDS已经成为严重影响人类健康和社会发展的全球性疾病。酶联免疫吸附试验和免疫印迹检验组合则被认为是HIV检测的"金标准"。因此本实验构建gp160的抗原多表位融合基因及在原核系统的高表达,为HIV抗体测定提供特异、价廉的抗原。方法:选定HIV-1 gp160基因中三个片段包含较多抗原表位的区域,设计带有酶切位点的引物,用PCR的方法从HIV-1HXB2全基因扩增编码这三个片段的基因序列,通过质粒提取、酶切、测序方法鉴定基因片段的正确性,SDS-PAGE和Western Blot测定融合蛋白的抗原特异性。结果:构建的HIV-1 gp160多表位嵌合基因的原核表达质粒,酶切和测序结果表明基因序列正确,基因全长969bp。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白分子量为37kDa,以包涵体的形式存在。结论:应用western blot测定10例正常人和12例HIV/AIDS病人血浆显示HIV-1 gp160多表位融合蛋白具有良好的抗原特异性。成功构建了高表达HIV-1 gp160多表位蛋白的原核表达系统,纯化的融合蛋白有较强的抗原特异性。     

人类免疫缺陷病毒抗体确证试验假阳性1例分析

目的:通过对1例人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体确证试验结果假阳性者进行随访检测分析,探讨HIV抗体确证试验技术在实际工作中存在的问题和解决的方法。方法:对1例受检者进行HIV抗体筛查和确证试验,并于4周、8周和12周随访检测,后两次随访进行HIV-1病毒载量检测以及第四次进行CD4+T淋巴细胞检测。结果:4次HIV抗体检测结果免疫印迹试验带型均为gp160、gp120、p24;后两次病毒载量结果均为TND,第四次CD4+T淋巴细胞检测结果为885 cells/μl,结合流行病学资料,最终判定HIV抗体阴性。结论:随着HIV抗体确证试验结果不确定样本不断增多,检测者要格外谨慎判断处于临界状态的样本,必须结合流行病学资料分析及随访检测,才能给予准确的检测报告。     

HIV-1膜蛋白gp140三聚体的真核表达、纯化、鉴定

摘要：目的构建表达中国流行株HIvl-1cRF_07B／C亚型（CN54）膜蛋白gpl40及其突变体,为HIV-1疫苗设计提供优秀的免疫原。方法构建gpl40、gpl40ST质粒,将质粒瞬时转染293F细胞,120h后收获上清液,经纯化、浓缩、PBS置换后,利用SDS-PAGE电泳、Western-blot检测蛋白的表达,ELISA检测其与HIV-1阳性病人血清的反应性。结果SDS-PAGE电泳、Western-blot试验证明成功表达了gpl40、gpl40ST蛋白,并且gpl40ST是-个稳定的三聚体蛋白质。ELISA试验检测,发现表达的gpl40ST蛋白与HIV-1阳性病人血清的亲和力高于gpl40蛋白。结论经过突变改造的gpl40ST具有稳定的三聚体构象,可作为HIV-1免疫原进行疫苗研究。     

抗HIV-1 gp120单克隆抗体体外阻断CD4细胞HIV感染的研究

目的:抗HIV-1gp120单克隆抗体对细胞感染HIV的拮抗作用研究。方法:制备抗HIV-1gp120单克隆抗体,鉴定其特性;研究抗HIV-1gp120单克隆抗体对细胞感染HIV的拮抗作用。结果:构建的重组质粒的外源基因片段经测序与预期HIV-1gp120抗原基因片段大小一致;高浓度时该单克隆抗体能够抑制HIV病毒的感染,随着抗体浓度的降低,中和实验的抑制率也随之下降;高浓度时该单克隆抗体能够显著抑制病毒的感染,随着抗体浓度的降低,HIVgp120RNA定量增高。结论:获得6株稳定分泌抗HIV-1gp120单克隆抗体的杂交瘤细胞株,该抗HIV-1gp120单克隆抗体具有一定的抗HIV作用。     

IFN-γ与HIV-1gp120融合蛋白的表达及其免疫调节作用

目的：研究gamma干扰素（IFN-γ）对人类免疫缺陷病毒（HIV-1）gp120蛋白免疫小鼠后效果的调节作用。方法：利用分子生物学技术，构建表达中国流行株HIV-1gp120N端片段基因的原核质粒pet44b-gp120，及共表达HIV-1gp120N端片段基因与IFN-γ基因的原核质粒pet44b-gp120／IFN-γ，在E．coli BL21（DE3）细胞中进行低温诱导蛋白表达，然后经纯化后免疫BALB／c小鼠。实验设皮下注射gp120／IFN-γ组、gp120组和PBS三组，以检测HIV-1gp120诱导的T细胞增殖能力，CTL杀伤作用以及Th1型细胞因子（IL-2，IFN-γ）和Th2型细胞因子（IL-4，IL-10）的表达情况。结果：通过PAGE和Western blot检测，证实上述两种蛋白在DE3细胞中得到表达。免疫学实验表明，针对HIV-1gp120的特异性T淋巴细胞增殖作用、特异性CTL杀伤作用，以及Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ表达在三组之间均有显著性差异（P〈0．05），gp120／IFN-γ组高于gp120组，gp120组高于PBS组（P〈0．05）。反映体液免疫反应的Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达在三组之间没有显著性差异（P〉0．05）。结论：协同应用IFN-γ基因可明显加强HIV-1gp120基因的细胞免疫反应。     

Immunogenicities of Env glycoproteins from circulating HIV-1 isolates in China focusing on the strategy of ＂DNA prime plus protein boost＂

Background The adenovirus-based HIV-1 vaccine developed by Merck Company suffered from an unexpected failure in September 2007. This generated a big shift in the strategy of HIV vaccine development with renewed focus on the induction of neutralizing antibodies. A major challenge in developing an HIV-1 vaccine is to identify immunogens and adopt delivery methods that can elicit broadly neutralizing antibodies against primary isolates of different genetic subtypes. Methods Most circulating HIV-1 isolates in China are composed of clades Thai-B, CRF_BC and CRF01_AE. In order to construct DNA vaccines against these 3 HIV-1 subtypes, DNA vaccines carrying the gp120 regions from HIV-1 isolates of GX48（AE）, GX79（AE）, NX22（BC）, GS22（BC）, HN24（Thai-B） were constructed. Expression of gp120 from these DNA vaccines was detected by Western blotting in transiently transfected 293T cells. Pilot immunizations of New Zealand white rabbits were performed using the strategy of ＂DNA prime plus protein boost＂ and the neutralizing antibody response was detected in a Tzm-bl cell based assay against different HIV-1 strains. Results Response of gp120-specific antibody was relatively low after DNA primes （mean titer=10^4.72）; however, the titer of gp120-specific antibody went up with 2 protein boosts （mean titer=10^6.81）. Above all, neutralizing antibody （Nab） titers induced by this combined approach were much better than those elicited by DNA or protein used alone （P 〈0.01）. Neutralizing activities of immunized rabbit sera against several pseudoviruses and laboratorial strains were evaluated, most rabbit sera primed with monovalent vaccine were capable of neutralizing only 1 of 5 viruses, however, sera primed with the polyvalent DNA vaccines were able to neutralize at least 2 of 5 viruses. Conclusion Polyvalent DNA prime plus protein boost is an effective immunization strategy to broaden the neutralization breadth and further research should be performed on the basis of this pilot study.     

人源化卵巢癌单链抗体基因的构建与表达

目的：通过基因工程技术获得完全人源化的卵巢癌患者自身的单链抗体并在毕氏酵母中获得表达，为人源化单链抗体(ScFv)在卵巢癌的诊断与治疗的应用提供实验基础。方法：用TRIZOL法自卵巢癌患者的淋巴细胞中提取RNA,利用SOEingPCR方法分别获得V_H、V_L基因，构建真核表达载体pPICZα/ScFv。电转化毕赤酵母菌株X-33。用PCR法筛选转染阳性克隆,SDS-PAGE法鉴定甲醇诱导的培养上清液中的ScFv的表达,筛选高表达工程菌。结果：构建ScFv基因,V_H与V_L连接后得到700 bp左右的条带，ScFv基因在毕赤酵母中获得表达，在26 000处出现目的条带。结论：获得ScFv基因及其真核表达载体以及高效表达ScFv的毕赤酵母工程菌。     

固相生物素－亲和素ELISA检测HIV抗体方法的建立与应用

采用生物素化ＨＩＶ合成肽抗原与预吸附在ＥＩＡ反应板上的亲和素结合，建立检测ＨＩＶ抗体的固相生物素－亲和素ＥＬＩＳＡ方法。经ＨＩＶ（１＋２）抗体参考血清Ｐａｎｅｌ检定，其灵敏度（１３／１３）１００％，特异性（２８／２８）１００％，批内变异系数＜７％，批间变异系数＜１０％。１０５６８例确认血清标本验证，阳性检出率１００％，阴性总符合率９９．８％，假阳性率０．２％。与常规间接ＥＬＩＳＡ法比较，本法操作简便，试验所需时间短，灵敏度、特异性和稳定性提高明显     

HIV跨膜蛋白gp41和gp36原核表达及抗原性研究

目的 构建HIV跨膜蛋白gp41和gp36原核表达载体,诱导表达HIV抗原,为HIV快速诊断和蛋白疫苗研究提供材料基础.方法 用PCR方法对HIV-1包膜蛋白gp41和HIV-2包膜蛋白gp36基因序列进行全长、截短扩增,分别或以融合表达方式克隆入原核表达载体pQE30、pET32a(+)及pGST-MOLUC,重组质粒经异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达,并经Ni-NAT或谷胱甘肽-Sepharose-4B层析柱亲和纯化HIV跨膜糖蛋白抗原,对获得的纯化抗原进行Western blot检测,利用HIV抗原制备ELISA检测试剂盒,并分析HIV临床样本. 结果 成功构建了HIV包膜蛋白的原核表达载体,利用亲和层析纯化得到了纯度较高的HIV包膜蛋白;Western blot分析结果证实表达纯化的HIV跨膜蛋白gp41(aa.538～718)、gp36(aa.533～764)以及gp41-gp36均能和HIV阳性血清反应;ELISA试剂盒检测临床样本显示,特异性达95%以上,灵敏度达100%.结论 获得了有生物学活性的HIV截短包膜蛋白,并可用于HIV快速检测试剂盒的研发.     

Evaluation of three commercial rapid tests for detecting antibodies to human immunodeficiency virus

Determine HIV-1/2, Chembio HIV-1/2 STAT-PAK and PenTest are simple/rapid tests for the detection of antibodies to HIV-1 and HIV-2 in human whole blood, serum and plasma samples. The assay is one step and the result is read visually within 15 minutes. Using 92 known HIV-1 reactive sera and 108 known HIV-1 negative sera, the 3 HIV tests correctly identified all the known HIV-1 reactive and negative samples. The results indicated that Determine HIV-1/2, Chembio HIV-1/2 STAT-PAK and PenTest HIV are as sensitive and specific (100% concordance) as Microparticle Enzyme Immunoassay. The data indicated that these 3 HIV tests are effective testing systems for diagnosis of HIV infection in a situation when the conventional Enzyme Immunoassay is not suitable.     

中国HIV-1B’亚型流行株gpl20蛋白的表达与纯化

目的：表达纯化中国HIV-1 B’亚型流行株gp120蛋白。方法：将gp120基因克隆至真核表达载体pTriEx-3 hygro ,构建真核表达质粒pTriEx-3-gp120,转染CHO-K1细胞,96 h后收取上清,利用金属螯合层析的方法纯化该重组蛋白,并通过SDS-PAGE以及Western blotting验证重组蛋白的表达。结果：酶切及测序结果表明真核质粒表达构建正确,表达的重组蛋白可以被His标签抗体以及HIV-1阳性血清所识别,并从细胞转染上清中成功纯化了该蛋白。结论：我们成功构建了一个可用于免疫检测、疫苗设计以及其它相关研究的HIV-1免疫原。     

HIV-1B gp120 genes from one patient with AIDS dementia complex can affect the secretion of tumor necrosis factor and interleukin in glial cells

Background HIV-1 infected and immune-activated macrophages and microglia secrete neurotoxins,such as tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β),which play major role in the neuronal death.It has been shown that different HIV-1 variants have varying abilities to elicit secretion of TNF-α by peripheral blood mononuclear cell (PBMC); however,whether the difference of gp120 gene could affect the secretion of TNF-α and IL-1β by glial cells is unknown.The aim of this study was to explore the association between gene diversity and induction of neurotoxic cytokines.Methods In this study,we constructed retroviral vectors MSCV-IRES-GFP/gp120 using HIV-1 gp120 genes isolated from four different tissues of one patient who died of AIDS dementia complex (ADC).Recombinant retroviruses produced by cotransfection of MSCV-IRES-GFP/gp120,pCMV-VSV-G and pUMVC into 293T cells were collected and added into U87 glial cells.Concentrations of TNF-α and IL-1β secreted by transduced U87 cells were assayed with ELISA separately.Results The four HIV-1 gp120 were in the different branch of the neighbor-joining tree.Compared to the pMIG retrovirus (gp120-negative) or U87 cells,all the gp120-positive recombinant retroviruses induced more TNF-α (P ＜0.01) and IL-1β (P ＜0.01).In addition,compared with the L/MIG retrovirus,all the three brain gp120-positive recombinant retroviruses induced less TNF-α (P ＜0.01) and IL-1β (P ＜0.01).Conclusions HIV-1 gp120 could induce U87 cells secret more TNF-α and IL-1β again.The more important is that difference of HIV-1 gp120,especially cell-tropism may account for the different ability in eliciting secretion of TNF-α and IL-1β,which might supply a novel idea helping understand the pathogenesis of ADC.     

HIV感染肝星状细胞促进肝纤维化实验研究——HIV/HCV合并感染快速肝纤维化机制探讨

目的 HIV/HCV合并感染较单纯HCV感染患者肝纤维化发展迅速,肝病死亡率高。肝纤维化进程与HIV RNA水平相关,提示HIV在肝纤维化形成中起重要作用。然而,HIV通过HSC促进肝纤维化作用知之甚少。本文就HIVⅢB能否感染HSC、HIV/HIVgp120促进HSC活化和Ⅰ型胶原蛋白表达及其相关细胞信号通路进行了检测。方法以HIVⅢB感染和gp120刺激原代人HSCS后,采用ELISA、qRT-PCR和Western Blot对感染结果和纤维化发生有关标志物进行分析,并以shRNA和uo126预处理HSC封闭CXCR4及其下游因子ERK,进一步评估CXCR4-ERK细胞信号系统在HIV诱导肝纤维化中的作用。结果 HIVⅢB能感染培养的人HSCS并促其表达Ⅰ型胶原蛋白。gp120同样可刺激HSC表达Ⅰ型胶原蛋白和肌动蛋白。当CXCR4及/或ERK被抑制后,HIV和gp120的上述作用明显降低。结论本研究表明,HIV/HIVgp120通过诱导HSC生物学功能促进肝纤维化,CXCR4-ERK细胞转导通路是主要机制之一。     

False Human Immunodeficiency Virus Test Results Associated with Rheumatoid Factors in Rheumatoid Arthritis

Objective To investigate if immunological factors associated with rheumatoid arthritis（RA） affect the result of human immunodeficiency virus（HIV） screening by electrochemiluminescence immunoassay（ECLIA） and enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. Methods 100 RA cases were enrolled from January 2012 to February 2013 into this study. HIV screening was conducted with ECLIA detecting both HIV-1 p24 antigen, HIV-1 and HIV-2 antibodies, with ELISA and colloidal gold method detecting HIV-1 and HIV-2 antibodies. The samples producing positive results were submitted to the Center for Disease Control for confirmation using Western blotting method. The antibody titers of rheumatoid factors（RF） including RF-IgG, RF-IgM, RF-IgA, and CCP-IgG were analyzed by ELISA. Results The HIV positive-rate determined by ECLIA was significantly higher than that by ELISA and colloidal gold method（P〈0.01）. The false-positive rate of HIV screening was associated with antibody titers of RF-IgG, RF-IgM, RF-IgA, and CCP-IgG in RA（P〈0.01）. Conclusion Immunological factors, including RF and anti-CCP antibody, may influence the screening of HIV by ECLIA, producing false-positive result.     

α7nAChR基因敲除HIV-1gp120转基因小鼠模型的构建

目的 通过构建双基因编辑小鼠模型（α7R-/-/gp120+）,为探索α7乙酰胆碱受体（α7 nAChR）介导gp120中枢神经毒性的作用和机制提供研究基础。方法 α7 nAChR基因敲除小鼠（α7R-/-）与HIV-1 gp120转基因小鼠（gp120+）杂交（F0）,从产生的F1小鼠中,选取基因型为α7R+/-/gp120+的小鼠进一步交配,得到F2小鼠。PCR法鉴定和筛选F3小鼠基因型,免疫组化分析双转基因动物模型蛋白表达;体外实验使用gp120蛋白和α7 nAChR抑制剂处理小胶质细胞,ELISA检测各组IL-1β与TNF-α表达情况。结 果 F3小鼠的PCR结果符合预期,其中有2只双基因编辑成功的小鼠。免疫组化结果显示双基因编辑小鼠（α7R-/-/gp120+）的脑组织缺乏α7 nAChR的同时高表达gp120蛋白。体外实验结果表明Gp120可促进小胶质细胞分泌IL-1β与TNF-α,而抑制α 7nAChR后IL-1β与TNF-α表达明显降低（P<0.001）。结论 α7R-/-/gp120+双基因修饰小鼠成功构建,且具有稳定遗传的特点,可为后续探索α7 nAChR介导gp120中枢神经毒性的作用和机制提供重要的动物模型。     

作用于HIV-1 gp120小分子HIV进入抑制剂NC-2 的虚拟筛选及其作用机制

目的基于中和抗体VRC01与HIV-1 gp120的结合模式,利用计算机虚拟筛选,从IBS天然产物数据库中筛选靶向HIV-1
gp120的小分子HIV-1进入抑制剂,并对其抗病毒活性和机制进行研究。方法运用MM-PBSA方法计算候选化合物与HIV-1
gp120结合后自由能的变化;利用HIV-1假病毒、活病毒技术及细胞融合实验,检测化合物抑制HIV-1感染的活性;XTT比色法
检测化合物对细胞的毒性;采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）研究化合物体外抗病毒活性的机理。结果利用计算机从40 000
个化合物中虚拟筛选出19个与gp120结合后自由能降低较大的小分子化合物,其中NC-2具有抑制HIV-1感染和细胞融合的活
性,其抑制HIV-1实验株IIIB的IC50是1.95±0.44 μmol/L,抑制HIV-1JRFL假病毒的IC50是10.58±0.13 μmol/L。酶联免疫吸附法结
果表明NC-2体外能抑制HIV-1 gp120与CD4的结合,但不抑制HIV-1 gp41六螺旋的形成。结论该计算机虚拟筛选的方法可
为开发作用于HIV-1 gp120的小分子进入抑制剂提供参考。同时,通过计算机辅助设计加病毒活性筛选的方法,得到一个新颖
结构的HIV进入抑制剂NC-2。
     

以gp120、CD4和CXCR4为靶点的HIV小分子进入抑制剂研究进展

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的一种烈性传染病,危害极大.病毒的包膜蛋白gp120及其受体CD4、辅助受体CXCR4在病毒感染中起着重要的作用.其中,gp120的Phe43口袋结构和Arg59是其与CD4分子相互作用的重要部位.HIV小分子进入抑制剂因能在HIV感染细胞前即发挥抑制病毒的作用,成为近年来抗HIV药物研究的热点.Phe43口袋结构是小分子进入抑制剂的重要靶点,目前研究热点化合物主要有BMS-378806、BMS-488043及其类似物、NBD-556及其类似物.靶向CXCR4也是研究HIV小分子进入抑制剂的一个重要方向.     

甘露糖结合凝集素与艾滋病相关性的研究

甘露糖结合凝集素(mannose binding lectin or mannan binding lectin;MBL)是一种存在于血清中的C型凝集素.MBL通过结合病原生物表面的甘露糖等糖基受体而直接介导调理吞噬作用和/或通过MBL途径激活补体,在机体的固有性免疫防御中发挥重要作用.HIV-1的表面包膜蛋白gp120/gp41为机体固有免疫系统通过MBL的攻击提供了潜在位点.MBL主要通过四个环节在艾滋病中发挥作用:补体活化、中和作用、调理作用和封闭DC细胞特异的ICAM3结合的非整合素.对于MBL在艾滋病的疾病进展和疾病传播中的作用认识不一,有待进一步研究.     

嘉兴地区无偿献血者人类免疫缺陷病毒感染状况分析

目的 分析嘉兴地区无偿献血者人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）确证阳性的结果,为无偿献血的招募策略和HIV感染防治工作提供参考数据。方法 收集嘉兴地区2011～2021年无偿献血者中确证HIV-1抗体阳性的病例,比较各人群分布特征,采用多因素Logistic回归分析探讨嘉兴地区HIV-1抗体阳性人群的特征,并进行蛋白质印迹法条带分析。结果 2011～2021年嘉兴地区共检测559 331例无偿献血者标本,最终HIV-1抗体确证阳性51例,阳性率为9.12/10万,其中2021年阳性率最低,为1.54/10万。确证HIV-1抗体阳性的无偿献血者的性别、年龄、职业、文化程度、献血频次比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。多因素Logistic回归分析结果显示,男性、18～30岁、自由职业和其他、初中文化程度均是感染HIV的主要特征（P<0.05）。HIV-1抗体阳性病例p17、p24、p31、p51、p55、p66、Gp41、Gp120、Gp160全带表达者占比27.45%;Gp160、Gp41、p24三条带100%表达。结...