SD大鼠骨髓基质细胞与多孔羟基磷灰石陶瓷支架体外粘附的实验研究

目的研究诱导培养的SD大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)在多孔羟基磷灰石陶瓷支架材料上的粘附和生长。方法SD大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)经矿化诱导培养、扩增后与多孔羟基磷灰石陶瓷支架体外复合培养,扫描电镜观察BMSCs在支架表面的贴附形态;同时以不同浓度细胞悬液接种多孔羟基磷灰石陶瓷支架材料,检测适宜的接种浓度及单位体积支架材料最多可粘附BMSCs数量。结果BMSCs在支架表面贴附良好,当接种浓度为2×106/ml时,单位体积的多孔羟基磷灰石陶瓷支架材料最多可粘附BMSCs数量为3.1×107cell/cm3。结论SD大鼠BMSCs在体外经矿化诱导培养可表达成骨细胞表型,诱导培养后的细胞与新型多孔羟基磷灰石陶瓷支架材料上具有良好的亲和能力。     

纯钛表面激光熔覆处理的进一步实验研究

目的 探讨激光熔覆后钛表面多孔形貌对细胞黏附、增殖和分化的影响.方法 在氩气保护环境中应用脉冲式掺钕钇铝石榴石晶体(Nd:YAG)对45 μm钛粉颗粒在钛片表面进行激光熔覆,采用场发射扫描电镜(SEM)观察钛片表面微观形貌,能量弥散X射线谱(EDS)检测钛片表面成分;采用小鼠骨髓基质干细胞BMSCs体外培养评价喷砂酸蚀组(A组)和激光熔覆组(B组)的生物相容性.SEM观察BM-SCs在钛表面的黏附状况,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测法和碱性磷酸酶(AKP)活性检测评价钛片对BMSCs增殖和分化的影响.结果 与A组比较,B组互相连通的多孔钛表面更有利于BMSCs的黏附,也有利于BMSCs细胞的增殖和分化.结论 激光熔覆处理钛片表面可促进BMSCs黏附、增殖及分化,有望成为一种有效有前景的钛表面处理方法.     

BMSCs复合CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料的生物相容性研究

目的:研究CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料的生物相容性,为骨组织工程提供一种新型复合支架材料。方法:制备CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料。将大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)与CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料联合培养,体外成骨诱导培养2周,扫描电镜观察细胞黏附情况,MTT法分析细胞增殖情况以评价其组织相容性。结果:扫描电镜示细胞在新型支架上吸附、生长良好。MTT示BMSCs在材料上和单纯诱导的细胞增殖能力基本相同。结论:CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料是一种具有良好生物相容性的支架材料,有望在骨组织工程中得到广泛应用。     

多孔金属材料镍钛合金与大鼠骨髓基质细胞的生物相容性研究

目的 研究多孔处理的新型镍钛合金材料与大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)的生物相容性,探索新型生物工程材料的生物学特性.方法 SD大鼠体外培养BMSCs,将细胞分别接种于致密、大孔、小孔组镍钛合金材料表面,建立体外共同培养.采用MTT法检测第3天BMSCs的增殖率;第7天采用Hoechst33342标记细胞,荧光显微镜下观察各材料组细胞数的差异:扫描电镜观察细胞在各组材料上的附着和生长情况.结果 大孔、小孔组材料表面的细胞在第3天细胞增殖率和致密组相比有显著性差异(P<0.05),第7天在荧光纤维镜下发现各组镍钛合金材料上均有细胞生长,大孔、小孔组细胞数和致密组相比有显著性差异(P<0.05),大孔、小孔材料之间细胞增殖率和细胞数无统计学意义(P>0.05).扫描电镜观察大孔、小孔组新型镍钛合金材料表面接种的BMSCs形态正常,增殖旺盛,黏附性良好.结论 多孔处理的新型镍钛合金材料在体外实验中有良好的生物相容性,可促进BMSCs黏附、聚集和增殖.     

BG/PHBV复合多孔支架材料与成骨细胞体外复合培养

目的用生物活性玻璃BG/聚羟基烷酸酯PHBV复合多孔支架材料与骨髓基质细胞来源的成骨细胞体外复合培养了解其生物相容性,为骨组织工程支架材料选择提供依据。方法:将体外培养的兔骨髓基质细胞诱导分化的成骨细胞,与BG/PHBV复合多孔支架材料体外复合培养,对复合体进行形态学、扫描电镜、细胞增长能力的测定,评价细胞与材料的相容性。结果:骨髓基质细胞有较强的向成骨细胞分化和繁殖能力成骨细胞与BG/PHBV复合多孔支架材料体外复合培养8d,分布于支架材料的成骨细胞迅速分化增殖,分泌细胞外基质并形成钙结节。结论:骨髓基质细胞是骨组织种子细胞的良好来源BG/PHBV复合多孔支架材料与成骨细胞具有良好的生物相容性,是构建组织工程骨的一种理想支架材料。     

透明质酸水凝胶体外促进骨髓间充质干细胞神经分化的研究

目的观察以透明质酸(hyaluronic acid,HA)水凝胶作细胞支架,骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在HA水凝胶中的生长、增殖和分化情况,探讨HA水凝胶支持、促进BMSCs分化为神经元细胞的作用。方法采用Percoll法从SD雄鼠的骨髓中分离纯化BMSCs,传代培养,倒置显微镜观察BMSCs的生长情况和形态变化。各组以不同的方法诱导BMSCs分化。采用免疫细胞化学法检测各组BMSCs在相应时间点神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝蛋白(NF)及巢蛋白(nestin)的阳性细胞数。RT-PCR检测各组BMSCs相应时间点的NSE mRNA、NF mRNA和nestin mRNA表达。结果传代后BMSCs形似纤维细胞。诱导后,HA水凝胶组(A组)和脑组织提取液组(B组)BMSCs分化为神经元样细胞:A组细胞黏附在HA水凝胶表面,长出较多突起和分支;B组细胞出现突起及少量分支。诱导后A组和B组NSE、NF阳性细胞增多(P<0.05)。诱导2d后及7d后A组和B组nestin阳性细胞均增多:2d后,A组高于B组(P<0.05);7d后,A组低于B组(P<0.05)。诱导7d后A组和B组的NSE mRNA、NF mRNA表达均增加,A组增加明显(P<0.05)。诱导2d后A组和B组的nestin mRNA表达增加,A组更显著(P<0.05);7d后A组和B组的nestin mRNA表达则降低,A组更明显(P<0.05)。结论 HA水凝胶有利于BMSCs的黏附,为BMSCs生长、增殖和分化提供了结构支持和适宜的微环境,促使BMSCs向神经元细胞分化、增殖并表达神经元特异性蛋白。     

恒河猴骨髓基质干细胞与新型可吸收羟基磷灰石及β-磷酸三钙体外相容性的观察

目的观察恒河猴骨髓基质干细胞(rBMSC)与新型可吸收羟基磷灰石(HA)及AO人工骨β-磷酸三钙(β-TCP)的体外相容性．为在灵长类动物体内构建组织工程化骨作材料方面的准备，方法取第三代恒河猴骨髓基质细胞与材料复合培养。实验分3组：A组将rBMSC与HA复合培养；B组rBMSC与β-TCP复合培养：C组为对照，只有细胞不加材料。倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞形态及增殖情况．MTT法半定量检测细胞增殖。结果倒置显微镜下见HA组细胞生长良好，与对照组无显著差异。β-TCP组有一些细小颗粒脱落散在分布于板底或细胞表面．有少量细胞脱落死亡。扫描电镜见HA组细胞贴附、增殖良好，β-TCP组细胞贴附率不高。MTT法显示HA组细胞增殖与对照组接近，而β-TCP组则显著低于对照组。结论新型HA与恒河猴BMSc生物相容性好，可用作恒河猴骨组织工程的支架材料．AO人工骨需要作性能上的改进。     

恒河猴骨髓基质干细胞与新型可吸收羟基磷灰石及β-磷酸三钙体外相容性的观察

目的 观察恒河猴骨髓基质干细胞(rBMSC)与新型可吸收羟基磷灰石(HA)及AO人工骨茁-磷酸三钙(茁-TCP)的体外相容性。为在灵长类动物体内构建组织工程化骨作材料方面的准备。方法 取第三代恒河猴骨髓基质细胞与材料复合培养。实验分3组:A组将rBMSC与HA复合培养;B组rBMSC与茁-TCP复合培养;C组为对照,只有细胞不加材料。倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞形态及增殖情况,MTT法半定量检测细胞增殖。结果 倒置显微镜下见HA组细胞生长良好,与对照组无显著差异。茁-TCP组有一些细小颗粒脱落散在分布于板底或细胞表面,有少量细胞脱落死亡。扫描电镜见HA组细胞贴附、增殖良好,茁-TCP组细胞贴附率不高。MTT法显示HA组细胞增殖与对照组接近,而茁-TCP组则显著低于对照组。结论 新型HA与恒河猴BMSc生物相容性好,可用作恒河猴骨组织工程的支架材料,AO人工骨需要作性能上的改进。     

RGD序列胶原缓释微球涂层生物活性多孔支架细胞相容性的研究

背景本课题组已经成功制备了硫酸钙与冻干骨复合多孔生物支架,设法提高其细胞相容性仍需继续探索。目的研究RGD缓释微球表面修饰的硫酸钙冻干骨新型生物支架的细胞相容性。方法首先利用煅烧和挂浆的方法制备RGD涂层生物活性多孔支架,通过倒置显微镜观察第三代成骨细胞在对照组(原支架)和实验组(表面修饰后的支架)复合培养的生长分布情况,然后利用扫描电镜观察新型涂层支架和复合培养后的表面情况。分别测定细胞与新型RGD复合直接培养后的细胞蛋白质和细胞黏附率来分析其增殖和分化的能力。结果经过复合培养和对照,新型RGD涂层生物支架组的细胞黏附率明显高于对照组,不同时期的细胞蛋白质也明显要高于对照组(P<0.05),并且新型RGD涂层生物支架的孔隙中有细胞长入的情况。结论 RGD序列缓释微球涂层表面修饰可以提高硫酸钙/冻干骨生物多孔支架的细胞相容性。     

兔骨髓源成骨细胞与多孔支架复合的实验研究

目的通过对兔骨髓基质干细胞的培养及诱导分化,并将细胞与新型复合型生物多孔支架联合培养,观察兔骨髓源成骨细胞在多孔支架表面的黏附及生长情况。方法兔骨髓基质干细胞经诱导分化为成骨细胞。将成骨细胞与处理过的多孔支架复合,在扫描电镜下观察细胞在支架表面的贴附情况。结果细胞接种后,在材料表面生长形态正常,属性与特征明显。结论新型复合型生物多孔支架与兔骨髓源成骨细胞具有良好的结合能力,可以进一步进行体内试验。     

兔骨髓基质细胞与聚DL-乳酸/羟基磷灰石生物相容性的实验研究

目的检测聚DL-乳酸/羟基磷灰石（PDLLA/HA）复合材料的特性,探讨骨髓基质细胞（BMSCs）与PDLLA/HA的生物相容性,为筛选骨组织工程的支架材料提供依据.方法将BMSCs与PDLLA/HA复合体外培养,通过形态学的观察、细胞增殖率及ALP活性的测定,观察PDLLA/HA对培养细胞的影响.结果复合培养时BMSCs能在PDLLA/HA上贴附、繁殖,其生长及功能不受影响.结论 PDLLA/HA具有良好的细胞相容性,能作为骨组织工程种子细胞的支架材料.     

粗糙钛表面纳米掺锶羟基磷灰石涂层对 BMSCs成骨分化的影响

目的研究粗糙钛表面纳米掺锶羟基磷灰石涂层对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM SCs)增殖、成骨分化的影响。方法采用电化学沉积技术在粗糙钛表面沉积薄层纳米掺锶羟基磷灰石、纳米羟基磷灰石,用场发射扫描电子显微镜观察其表征,分析锶元素修饰的纳米羟基磷灰石涂层对大鼠BM SCs增殖、碱性磷酸酶活性、矿化结节形成和成骨相关蛋白骨钙素分泌的影响。结果纳米掺锶羟基磷灰石涂层和纳米羟基磷灰石涂层不影响细胞增殖,与目前临床广泛应用的金属钛种植体粗糙表面一样具有良好的生物相容性。相较于纳米羟基磷灰石涂层和粗糙组,纳米掺锶羟基磷灰石涂层可增强BMSCs碱性磷酸酶活性,促进矿化结节形成,提高细胞骨钙素的分泌。纳米羟基磷灰石涂层亦表现了比粗糙组更好的生物活性。结论应用电化学沉积技术进行纳米掺锶羟基磷灰石涂层的制备,可以促进BMSCs成骨分化、种植体周围新骨早期形成,提高种植体骨组织结合率。     

血管内皮细胞生长因子基因转染诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为内皮细胞

目的：评价经腺病毒介导的血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染后的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导成内皮细胞的可行性。方法：从大鼠骨髓中分离培养获取BMSCs，分别经Adv-VEGF、Adv-GFP转染，Western印迹分析检测VEGF蛋白的表达情况．细胞生长曲线测定BMSCs增殖特性．同时进行免疫表型鉴定．并与未转染细胞组比较。结果：Adv-VEGF转染组BMSCs可分泌VEGF蛋白，而其杂两组不分泌VEGF蛋白。转染VEGF基因后,BMSCs生长速度变快．向内皮细胞分化。与Adv-VEGF转染组BMSCs相比．Adv-GFP转集细胞组、未转染细胞组的BMSCs生长速度较慢．未有向内皮细胞分化的证据。结论：腺病毒介导的VEGF基因转繁可诱导BMSCs分化成内皮细胞。     

BMP-7诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的初步研究

目的 探讨骨形态发生蛋白7(BMP-7)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元细胞分化的作用.方法 以全骨髓贴壁法分离、培养大鼠BMSCs;流式细胞仪检测细胞表型CD29、CD44及成脂诱导以鉴定大鼠BMSCs; MTT法检测浓度分别为25、50、75、100 ng/ml的BMP-7对大鼠BMSCs增殖的影响;第3代细胞贴壁后随机分为三组:阴性对照组、阳性对照组(β-巯基乙醇)、BMP-7诱导组;倒置相差显微镜下观察各组细胞形态学变化;诱导2 h后进行免疫细胞化学实验,检测各组细胞神经元标志物神经丝蛋白-200(NF-200)及神经突触素-1(SYN-1)的表达情况.结果 体外培养的第3代大鼠BMSCs形态呈长梭形,"鱼尾纹"状聚集生长;CD29、CD44阳性表达,阳性率分别为99.44％、 99. 17％;成脂诱导28 d后油红0染色阳性;不同浓度的 BMP-7均具有促进大鼠BMSCs增殖的作用,以75 ng/ml最为显著;75 ng/ml BMP-7诱导大鼠BMSCs 2 h后可见形态典型的神经元细胞,NF-200及SYN-1为阳性.结论 BMP-7体外具有诱导大鼠BMSCs向神经元细胞分化的作用.     

鹿茸多肽联合GDNF基因修饰的雪旺细胞对人骨髓间质干细胞体外增殖的影响

目的：探讨鹿茸多肽（PAP）联合胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）基因修饰的雪旺细胞对人骨髓间质干细胞（BMSCs）体外增殖的影响。方法：按常规方法抽取10 mL健康志愿者骨髓,接种于培养瓶中进行培养,原代培养细胞完全融合前进行传代,传至第3代时收获BMSCs,调整细胞浓度为5×10⁶ mL^-1备用。加入4 μL GDNF基因修饰的雪旺细胞为GDNF组,加入4 μL （10 mg·L^-1） PAP联合GDNF基因修饰的雪旺细胞作为联合组,对照组未加入任何药物仅加入等量的培养基。采用酶联免疫检测法检测各组细胞细胞增殖活力,ELISA法检测各组BMSCs中增殖细胞核抗原（PCNA）水平,AnnexinⅤ-FIFC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。结果：原代培养48 h后大部分细胞贴壁,形态转变为多角形,少数呈梭形。传代细胞几乎呈梭形,为BMSCs,且均为非造血干细胞。与对照组比较,GDNF组和联合组细胞增殖活力和BMSCs中PCNA水平升高（P<0.05）,细胞凋亡率降低（P<0.05）;与GDNF组比较,联合组细胞增殖活力和BMSCs中PCNA水平升高（P<0.05）,细胞凋亡率降低（P<0.05）。结论：PAP联合GDNF基因修饰的雪旺细胞对人BMSCs体外增殖具有明显的促进作用。     

骨髓间充质干细胞移植至血管性痴呆大鼠模型的初步研究

目的：建立体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,体外诱导BMSCs向神经元样细胞方向分化、鉴定并移植至血管性痴呆大鼠模型的方法.方法：体外分离培养SD大鼠BMSCs,采用贴壁筛选法分离纯化BMSCs,显微镜下观察不同时期BMSCs的细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物表达鉴定BMSCs,用含10 μg/L bFGF的L-DMEM及含200μmoVLBHA、2％ DMSO的无血清L-DMEM诱导BMSCs向神经元样细胞分化;免疫细胞化学检测分化细胞的巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达,以确定其分化特性;用尿嘧啶脱氧核苷（BrdU）标记分化好的细胞,移植到改良Pulsinelli＇s四血管复制的血管性痴呆（VaD）模型大鼠侧脑室内,免疫组织化学检测BrdU表达以反映移植BMSCs在大鼠脑内的生长情况,Moms水迷宫检测大鼠学习记忆能力.结果：大鼠BMSCs可通过贴壁筛选法成功分离并在体外大量扩增,流式细胞仪检测显示BMSCs第5代表面标志可达90％以上,细胞表型CD90、CD29、CD44表达阳性,CD45表达阴性;bFGF/BHA诱导BMSCs分化后有Nestin和NSE表达,分化细胞具有神经细胞的形态;与对照组相比,模型组大鼠逃避潜伏期明显延长,第1次穿越平台时间延长,穿越平台次数减少,差异有统计学意义（P ＜0.05）;BrdU成功标记诱导后的BMSCs,并可在移植大鼠脑内检测到BrdU标记阳性细胞.结论：体外成功分离、培养大鼠BMSCs,生长稳定、可多次传代,bFGF/BHA可诱导BMSCs分化为神经元细胞,BMSCs成功移植到VaD大鼠,BMSCs有望为神经疾病细胞移植治疗提供丰富、易得的细胞来源.     

骨髓间质干细胞移植治疗膝骨性关节炎的对比研究

目的对比非甾体类药物（NSAIDs）、透明质酸钠（HA）、骨髓间质干细胞（BMSCs）三种方法治疗膝骨关节炎各个时期的疗效。方法对60例关节镜下确诊为膝骨关节炎的病人随机分3组,分别用：（1）术后用NSAIDs治疗2—4周;（2）术后注射HA1～2疗程;（3）术后取髂脊骨髓进行分离培养出BMSCs再进行回植到膝关节中等3种方法治疗。分别在术后3个月、1年、3年的时间进行随访、并用WOMAC指数评分法对膝关节功能进行评价,两两对比组间的治疗效果。结果3个月随访显示3组在治疗结果方面差异无统计学意义（P〉0．05）;1年随访显示HA组和BMSCs组与NSAIDs组相比治疗结果差异有统计学显著意义（P〈0．05）;3年随访显示3组间治疗效果都有统计学显著差异。结论3种方法对骨关节炎的早期疗效都较好,但BMSCs的长期效果要优于其他2种方法。     

碱性成纤维细胞生长因子对羊骨髓间充质干细胞体外增殖和分化的影响

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外增殖与分化的影响。方法：体外分离培养的羊原代BMSCs分为实验组和对照组,实验组添加bFGF(2 μg•L^-1)于L-DMED培养液中,对照组使用L-DMED常规培养液。分别测定2组BMSCs生长曲线以及碱性磷酸酶（ALP）活性。应用诱导剂对2组细胞进行成骨、成脂肪诱导,分别在显微镜下观察其分化潜能。 结果：单个核细胞接种大约1周成纤维细胞样集落开始出现,2周后形成的集落数量增加,每个集落的体积变大。当第1代BMSCs细胞生长到汇合期时,实验组细胞数是对照组的2.5倍。于第16天实验组ALP活性比对照组明显降低（P＜0.05）。2组BMSCs经成骨诱导培养3周后,经Von Kossa染色,已经成骨的细胞内均可见钙盐沉积;已经成骨的细胞内油红-“O”染色显示,成脂肪诱导培养2周后,2组BMSCs均能分化形成脂肪细胞,2组每高倍视野下脂肪细胞计数差异无显著性（P>0.05）。 结论：bFGF能提高羊BMSCs集落形成数量及扩增效率,并抑制其ALP活性,同时保持了BMSCs向成骨细胞、脂肪细胞的分化潜能。