铜绿假单胞菌mexA基因原核表达载体的构建

目的 构建mexA基因的原核载体,为进一步表达MexA蛋白奠定基础.方法 从临床分离多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexAl基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再以PUC/mexA1质粒为模板PCR扩增mexA目的 基因,克隆至质粒pQE30中,构建表达质粒pQE30/mexA,构建的表达质粒pQE30/mexA转化大肠杆菌M15,培养后提取纯化重组质粒pQE30/mexA酶切鉴定.结果 获得长约1.5 kbPCR mexA1产物,酶切结果显示所构建的重组质粒PUC/mexA1已成功地克隆了mexA1(1.5 kb)基因,序列分析结果与PA01/mexA1序列相同,构建的表达质粒pQE30/mexA酶切鉴定,与插入pQE30的目的基因mexA(1.2 kb)片段相符.结论 含mexA(1.2 kb)基因的原核表达载体构建成功,为进一步表达MexA蛋白奠定了基础.     

铜绿假单胞菌氯霉素耐药相关基因研究

目的了解铜绿假单胞菌（PAE）氯霉素耐药相关基因的携带状况。方法采用K-B法分别对山东（A院）、江苏（B院）二家医院PAE菌临床分离株进行抗菌药物的敏感试验。采用聚合酶链反应法（PCR）对氯霉素耐药相关基因（catB、cmlA）进行检测,并对相关基因进行序列分析。结果A院30株PAE对16种抗菌药物多药耐药;B院20株PAE对16种抗菌药物均耐药;二家医院PAE对氯霉素均不敏感。A医院30株多药耐药PAE菌catB、cmlA基因均阴性;B医院20株泛耐药PAE菌cmlA基因阳性18株（阳性率90．0％）,并经测序证实;catB基因均阴性。结论不同医院PAE氯霉素耐药机制可不相同,氯霉素耐药率高的原因需进一步研究。     

铜绿假单胞菌消毒剂耐药基因检测

目的 调查铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerllginosa，Pa)的耐消毒剂相关基因存在状况。方法 用聚合酶链反应(PCR)法对分离自湖北省襄樊地区住院病人的35株Pa菌对胺类(如新洁尔灭)、胍类(如洗必泰)耐药相关基因——qacE基因进行检测。结果 35株Pa菌中19株qacE基因阳性。Pa菌qacE基因携带率为54．3％。结论 多数所分离的Pa菌已携带耐消毒剂基因。     

一株携带多种耐药基因的铜绿假单胞菌研究

目的了解铜绿假单胞菌的多重耐药情况和有关机理。方法聚合酶链反应（PCR）法对多重耐药的铜绿假单胞菌进行β-内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶（AMEs）基因、耐消毒剂和磺胺基因（qacE△1—sul1）的检测。并对CARB基因进行了测序。结果PCR显示CARB、TEM型β-内酰胺酶基因，aac（6’）-Ⅰ、aac（6’）-Ⅱ、ant（2″）-Ⅰ、ant（3″）-Ⅰ AMEs基因、qacE△1-sul1耐消毒剂基因和耐磺胺基因扩增阳性，oprD2基因扩增检测呈缺失型。CARB基因扩增产物测序，经BLAST程序分析（WWW．ncbi．nlm．nih．gov）为CARB-3型。结论铜绿假单胞菌存在多重耐药基因，管壁涂有季胺类、双胍类消毒剂和磺胺的Ⅱ代导管的抑菌效果需重新评价。     

铜绿假单胞菌消毒剂磺胺耐药基因研究

目的 探讨铜绿假单胞菌（PA）消毒剂磺胺耐药基因存在状况。方法 对临床分离的96株铜绿假单胞菌采用PCR检测消毒剂磺胺耐药基因（qacE△1-sulⅠ）。结果 96株PAqacE△1-sulⅠ阳性42株（阳性率43．8％）。结论 铜绿假单胞菌qacE△l-sulⅠ携带率很高。     

铜绿假单胞菌获得性金属β-内酰胺酶及其相关基因研究

目的 了解该院铜绿假单胞菌(Pae)金属酶的产生及其相关基因携带情况.方法 采用多种方法进行Pae金属酶初筛、确证试验,并检测4种金属酶基因.结果 产金属酶菌株初筛阳性率为53.5%,用头孢他啶(CAZ)/乙二胺四乙酸(EDTA)、CAZ/2-巯基丙酸(2-MPA)、亚胺培南(IMP)/EDTA、IMP/2-MPA检测阳性率分别为13.95%、15.12%、17.44%、18.60%.PCR扩增结果仅IMP-1出现阳性,阳性率达16.28%,其余3种金属酶基因均为阴性.结论 不同方法对金属酶检测结果不尽相同;携带IMP-1金属酶基因是该院Pae耐碳青霉烯类等多种药物的主要原因.     

1株泛耐药铜绿假单胞菌耐药基因研究

目的了解1株泛耐药铜绿假单胞菌（PDRPA）耐药基因携带状况。方法采用PCR检测该株PDRPA菌44种基因。结果该株PDRPA菌携带TEM-1、OXA．10、PER-1、aac（3）-Ⅱ、aac（6’）-Ⅱ、ant（3”）-Ⅰ、rmtB、sull、cmlA、intⅠ1、merA基因,且伴有oprD2缺失。结论该株PDRPA菌携带多种耐药基因是泛耐药原因。     

多重耐药铜绿假单胞菌相关耐药基因的研究

目的探讨临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌β-内酰胺酶相关耐药基因及氨基糖苷类修饰酶基因。方法采用MicroScan40微生物全自动鉴定系统微量肉汤稀释法测定菌株的耐药性。采用聚合酶链反应(PCR)方法检测β-内酰胺酶基因型及氨基糖苷类修饰酶基因型。结果 32株铜绿假单胞菌除对哌拉西林/他唑巴坦和替卡西林/克拉维酸耐药率分别为75.9%和93.1%外,对其余抗菌药物耐药率均为100%。氨基糖苷类修饰酶基因检出30株(93.7%),aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6)-Ⅰ、aac(6)-Ⅱ、ant(3)-Ⅰ和ant(2)-Ⅰ基因阳性率分别为9.3%、90.6%、12.5%、90.6%、90.6%和0,检出β-内酰胺酶基因28株(87.5%),TEM、DHA、OXA和IMP基因阳性率分别为62.5%、43.7、21.8%和3.1%,未检出VIM、SHV和CTX-M-9,检出OprD2基因缺失23株(71.8%)。结论广州地区多重耐药铜绿假单胞菌携带多种氨基糖苷类修饰酶基因和β-内酰胺酶基因。     

ICU呼吸道铜绿假单胞菌耐药性及其耐药基因分型研究

目的 探讨重症监护室(intensive care unit,ICU)中铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)感染的耐药情况和耐药基因分型特点,为临床治疗提供参考依据.方法 收集邢台医学高等专科学校第二附属医院ICU病房送检的临床标本中分离的PA,药物敏感性试验检测PA对抗菌药物的敏感性,聚...     

铜绿假单胞菌耐药基因及其检测

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)为条件致病菌。Pa菌广泛分布于自然界及健康人的皮肤、肠道和呼吸道。正常情况下，Pa菌并不感染人体的任何组织。但当人体免疫力降低时(如：长期应用激素、肿瘤化疗、器官移植应用免疫抑制剂、AIDS患者)或严重创伤(如：烧伤、严重复合伤、大型手术)或医疗操作(如：气管切开、尿道插管和肾透析)后，Pa菌几乎可以感染人体的任何组织。临床可表现为局部化脓性炎症和全身性感染，其中呼吸道感染、心内膜炎、脑膜炎和败血症等常危及患者生命。     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OprH基因扩增、融合、克隆及原核表达

目的 在大肠杆菌中串联表达铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OprH，获得重组融合蛋白OprF／H，为抗铜绿假单胞菌的疫苗研究打下基础。方法 从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA，设计PCR引物扩增出OprF和OprH基因，扩增片段经过酶切、连接和PCR扩增后，割胶回收PCR产物并将其克隆至克隆质粒，测序后构建表达质粒pGEX-F／H，并转化大肠杆菌BL21。结果 重组表达质粒经IPTG诱导后表达融合外膜蛋白OprF／H。结论 成功构建融合外膜蛋白OprF／H的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达成功。     

钩端螺旋体外膜抗原基因OMPL1在卡介苗中的克隆和初步表达

采用ＰＣＲ技术直接从致病性钩端螺旋体（简称钩体）赖型０１７菌株基因组中扩增钩体外膜蛋白基因ＯｍｐＬ１,并克隆到大肠杆菌—卡介苗穿梭质粒载体ｐＹ６００２中,重组质粒经电转化导入卡介苗。斑点杂交筛选重组卡介苗,再通过免疫印迹对其表达进行初步研究。在所得６个重组卡介苗中,有３个表达了ＯｍｐＬ１基因产物,其中一个表达较强。该研究为发展新一代高效广谱的钩体基因工程疫苗打下了基础。     

慢性重型肝炎患者泛耐铜绿假单胞菌40种耐药相关基因的研究

目的研究慢性重型肝炎患者泛耐铜绿假单胞菌40种耐药相关基因。方法应用法国梅里埃公司的API鉴定条／PSE5．0药敏条和美国BD公司的Phoenix NMIC／ID-109鉴定／药敏板鉴定和细菌药敏试验,应用PCR法检测1株泛耐铜绿假单胞菌临床分离株29种β-内酰胺酶相关基因、外膜蛋白D2基因（oprD2）、6种氨基糖甙类修饰酶基因（AMEs）、消毒剂／磺胺耐药基因（qacE△1-sull）、3种整合子基因（intI1、2、3）等40种耐药相关基因,分析其分布情况。结果在本株菌,6种耐药相关基因阳性（二种β-内酰胺酶基因（blaTEM、blaOXA10）、二种氨基糖甙类修饰酶基因（aac（6′）-Ⅱ、aac（3）-Ⅱ）、qacE△1-sull和Ⅰ类整合子基因（intI1））,同时oprD2缺失;其它27种β-内酰胺酶基因、4种氨基糖甙类修饰酶基因（aac（6′）-Ⅰb、aac（3）-Ⅰ、ant（3″）-Ⅰ、ant（2″）-Ⅰ）和2种整合子基因（intI2、intI3）均为阴性。结论本株泛耐菌耐药机制为多重机制,主要与7种耐药相关基因（blaTEM、blaOXA10、oprD2缺失、aac（6′）-Ⅱ、aac（3）-Ⅱ、qacE△1-sul1和Ⅰ类整合子）有关。经检索中文生物医学期刊文献数据库（CMCC）和medline数据库,本研究是泛耐铜绿假单胞菌检测耐药相关基因最多的报道。     

人同种异体移植炎症因子-1的基因克隆及其在小鼠成纤维细胞中的表达

目的构建人同种异体移植炎症因子-1(allograft inflammatory factor-1,AIF-1)基因的真核表达载体并在小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)中表达,为进一步研究AIF-1蛋白的功能奠定基础。方法利用基因重组技术,构建带有AIF-1基因的2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1。利用脂质体法将2种重组质粒分别转染NIH3T3细胞,用荧光倒置显微镜及Western blot方法观察及鉴定AIF-1在细胞中的稳定表达及瞬时表达。结果酶切分析及DNA序列测定证实,AIF-1基因片段被分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)与pEGFP-C1。荧光显微镜观察到NIH3T3细胞中有绿色荧光分布。Western blot结果表明,转染重组质粒的NIH3T3细胞中,AIF-1表达量明显增高。结论成功构建了2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1,经转染NIH3T3细胞株获得了AIF-1蛋白的瞬时表达及稳定表达。     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在前列腺癌细胞中的表达

目的:构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体,并检测其在前列腺癌细胞株(PC-3)中的表达。方法:将目的基因m4-1BBL全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),获得m4-1BBL定向插入重组子pcDNA3.1(+)m4-1BBL,采用限制性内切酶和测序鉴定是否成功构建。用脂质体法将重组质粒转入PC-3细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测m4-1BBL在PC-3中的表达。结果:酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有小鼠4-1BBL全长cDNA编码序列,转染实验表明m4-1BBL基因能在PC-3细胞中表达。结论:小鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在PC-3细胞中的表达均获成功,为进一步研究莫定了基础。     

多巴胺D1、D3受体敲除及双基因敲除对小鼠体重的影响

目的：研究多巴胺受体介导的神经及生理活动。方法引进多巴胺D1和D3受体敲除小鼠,繁育出多巴胺D1D3受体双敲除小鼠。选择D1受体敲除、D3受体敲除、D1D3双基因敲除与WT四种基因型雄鼠各7只,对其30d、50d、70d小鼠24h内的进食量、饮水量及体重进行测量,探讨多巴胺D1受体、D3受体敲除小鼠及D1D3受体双基因敲除小鼠与野生型进食、饮水、体重增长的比较。结果多巴胺D1、D3受体基因对小鼠21d和35d的体重增长有一个较为显著的影响,直到90d时,各基因型小鼠体重间无统计学差异。结论多巴胺可能通过调节HPA轴的活性,从而调控仔鼠的觅食与饱腹感,最终影响仔鼠初生重及泌乳期体重。同时,多巴胺D1、D3受体基因的敲除可能通过干扰泌乳等母性行为而影响小鼠的体重。研究结果为利用基因敲除小鼠研究多巴胺D1、D3受体的功能及它们之间的相互作用奠定坚实的基础。     

肺癌细胞株EGFR和MRP基因mRNA表达相关性研究

目的 研究肺癌细胞株表皮生长因子受体基因（EGFR gene)mRNA与多药耐药性相关蛋白基因－MRP基因（MRPgene)mRNA表达相关性。方法 原位分子杂交技术检测耐药性／非耐药性肺癌细胞株EGFR、MRP基因mRNA表达。结果 耐药性／非耐药性肺癌细胞株均有不同程度EGFR、MRP基因mRNA表达,其表达与肺癌细胞株耐药性相关,且EGFR和MRP基因mRNA表达有明显相关性。结论 EGFR基因MRP基因密切相关并影响肺癌细胞耐药性。     

癌胚抗原重组痘病毒治疗CEA阳性肿瘤的机制及其CEA基因表达的研究

目的：探讨癌胚抗原重组痘病毒（carcinoembryonic antigen recombinant vaccinia virus,CEA-rV)治疗CEA阳性肿瘤的作用部位及其CEA基因表达的情况。方法：采用PCR法探测CEA-rV的作用部位，RT-PCR检测接种CEA-rV鼠腹腔Mφ内CEA的基因表达，免疫组化法检测各组小鼠腹腔MφCEA的蛋白表达，结果：腹腔接种的CEA-rA主要感染腹腔Mφ；皮下接种的CEA-rV主要感染皮肤局部组织，CEA-rV腹腔接种小鼠，其腹腔Mφ有CEAmRNA表达及CEA蛋白表达。结论：推测无论通过腹腔接种还是通过皮肤局部接种，GEA-rV一般多在注射局部表达，CEA-rV不仅可以进入Mφ，而且其CEA基因可以有效地表达，并可使Mφ表面分子MHC-Ⅱ与B7-2表达增强，然后递呈CEA给Th淋巴细胞，使之分泌足够的IL-2，激活Tc细胞分化为CTL，杀伤肿瘤细胞。     

食管癌中P^53基因突变和蛋白表达的研究

采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ－ＥＢ染色法及免疫组化技术检测１４例食管癌手术切除组织中Ｐ＾５３基因５－８外显子基因突变及Ｐ＾５３蛋白的表达。结果：其中７例免疫组化结果阳性,６例检出Ｐ＾５３基因突变。基因及Ｐ＾５３突变。Ｐ＾５３的基因突变和过度表达在食管癌的发生发展中发挥重要作用,Ｐ＾５３基因突变／过度表达可以作为判断食管发生及预后的一个指标。     

HIV-1 Tat真核表达载体的构建及在内皮细胞的表达

目的:构建HIV-1 Tat真核表达质粒,为研究Tat在HIV-1致病机制中的作用奠定实验基础。方法:以pCV1(tat and rev)质粒为模板,用PCR方法扩增HIV-1 Tat基因,克隆至p cDNA3.1( )表达载体,酶切及测序鉴定重组体。重组质粒转染ECV304细胞,用RT-PCR、转染HIV-1 LTR荧光报告基因的方法检测tat基因的表达及活性。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建pcDNA3.1( )-Tat重组质粒。重组体转染ECV304细胞,建立稳定表达细胞株,应用RT-PCR可检测到Tat基因mRNA的表达;荧光仪检测Tat蛋白可明显促进荧光素酶在ECV304细胞内的表达。结论:成功构建HIV-1Tat真核表达载体,并建立了HIV-1 Tat内皮细胞稳定表达细胞株。