两种实时定量ＰＣＲ 技术检测肺泡灌洗液中

摘要：目的　比较结核分枝杆菌及利福平耐药快速检测技术（简称ＸｐｅｒｔＭＴＢ／ＲＩＦ）和达安实时定量ＰＣＲ检测肺泡灌洗液中的结核杆菌ＤＮＡ 对肺结核的诊断和卫生经济学价值。方法　招募２０１４年３月～２０１５年１１月进入第四军医大学西京医院就诊的疑似肺结核的连续病例１１２例,收集肺泡灌洗液样本同时进行抗酸染色、ＭＧＩＴ９６０液体培养和药敏试验、ＸｐｅｒｔＭＴＢ／ＲＩＦ 和达安实时定量ＰＣＲ 检测。结果　１１２例纳入的研究对象中经培养确诊的肺结核患者有５３例,疑似的肺结核患者１５例,非结核患者４４例。以ＭＧＩＴ９６０液体培养为金标准,Ｘｐｅｒｔ ＭＴＢ／ＲＩＦ 与达安实时定量ＰＣＲ 的灵敏度差异无统计学意义（９８．１１％ 狏狊９０．５７％,犘＝０．２０５）,两者的灵敏度均高于抗酸染色灵敏度５８．４９％ （犘＜０．００１）;而若以临床诊断为参考标准,ＸｐｅｒｔＭＴＢ／ＲＩＦ的灵敏度则高于达安实时定量ＰＣＲ,且差异有统计学意义（犘＝０．０４５）。而抗酸染色、达安实时定量ＰＣＲ 和ＸｐｅｒｔＭＴＢ／ＲＩＦ 的特异性分别为９９．７３％、８８．６４％ 和９５．４５％,差异无统计学意义（犘＝０．１８４）。进行成本 效果分析,每检出１例肺结核行１次ＸｐｅｒｔＭＴＢ／ＲＩＦ 的费用为１０３３．８５元,远远高于达安实时定量ＰＣＲ 费用１９６．４９元。结论　ＸｐｅｒｔＭＴＢ／ＲＩＦ灵敏度高,操作更加简便快速且易于开展,并能同时检测利福平耐药性,可作为检测肺泡灌洗液中结核分枝杆菌ＤＮＡ 的首选方法。但达安实时定量ＰＣＲ 的检测成本较低,更加适用于低收入人群。关键词：肺泡灌洗液;ＸｐｅｒｔＭＴＢ／ＲＩＦ;实时定量ＰＣＲ;灵敏度;特异性;成本中图分类号：Ｒ３３０．２４　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９ ６６３９ （２０１６）０６ ０４３７ ０５     

实时荧光定量PCR技术在结核分枝杆菌研究中的应用

<正>核酸扩增技术特别是聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR)可对不同来源的核酸进行定性检测,但需在PCR反应终止后对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,这不仅无法准确定量,而且还容易发生交叉污染,产生假阳性。     

Taqman聚合酶链反应检测支气管灌洗液中结核分枝杆菌DNA的临床应用

肺结核病是一种危害性十分严重的传染性疾病,全球约有1／3人口感染结核分枝杆菌,每年约有800万～1000万新发病例及300万人死于该病。因此,尽早发现新发病例,明确诊断非常重要。由于结核分枝杆菌体外生长缓慢、培养要求高,临床上一般难以用细菌培养的方法来确诊结核分枝杆菌感染。痰液涂片抗酸检查特异检出率均不高,存在较高的漏检率。基于Taqman技术的荧光探针聚合酶链反应（FQ—PCR）检测结核分枝杆菌DNA具有高灵敏性、高特异性等优点。同时克服了常规PCR容易受污染产生假阳性的缺点,是一种理想的检测方法。而采用支气管肺泡灌洗液（BALF）作为检测标本比痰液标本具有更高的阳性检出率,克服了痰液标本留取不规范带来的阳性检出率不高的问题。我们应用该技术检测112例BALF标本中结核分技杆菌DNA,现报告如     

结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法建立

目的 探讨结核分枝杆菌实时定量检测方法并进行评价.方法针对结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)16S rDNA基因设计引物,应用SYBR Green I建立荧光定量PCR( FQ-PCR)反应体系;提取Mtb基因组DNA,PCR扩增16S rDNA片段,构建重组质粒pMD-TB16S;检测11份肺结核患者痰标本;以甲型链球菌、大肠杆菌等基因组DNA作对照,检验方法特异性,对同一份Mtb DNA模板进行批内和批间检测,计算变异系数(CV).结果靶向Mtb 16S rDNA基因引物能够特异扩增Mtb 16S rDNA基因,对照组细菌基因未见扩增,灵敏度为(Mtb基因组DNA) 1.2 pg/μL,即(38.9 +3.54)拷贝/μL的16S rDNA基因,批内和批间Ct值变异系数分别为0.27％和1.26％.结论以16S rDNA为靶基因的FQ-PCR技术,能够对Mtb进行快速、敏感而特异的定量检测.     

荧光定量PCR对血及痰培养物中结核分枝杆菌DNA的检测

目的 评价荧光定量PCR(FQ-PCR)检测血及痰培养物中结核分枝杆菌的临床价值.方法 81例临床诊断为结核病的痰涂片阴性患者中,单纯肺结核40例(肺结核组),合并HIV感染的患者41例(合并感染组).患者的血、痰样本分别进行结核分枝杆菌及其L型培养,采用FQ-PCR技术检测血及痰培养液中结核分枝杆菌DNA.结果 肺结核组结核分枝杆菌痰培养FQ-PCR阳性率为54.1%(20/37);血培养阳性率为27.5%(11/40),血培养FQ-PCR阳性率为22.5%(9/40),血培养及其FQ-PCR总阳性率42.5%(17/40).合并感染组10例痰样本培养后2例FQ-PCR阳性;血培养阳性率为7.3%(3/41),血培养FQ-PCR阳性率为17.1%(7/41).合并感染组血培养物FQ-PCR阳性率(17.1%)与肺结核组(22.5%)相比,差异无统计学意义(P>0.05).两组痰与血培养物FQ-PCR总阳性率分别为65.0%(26/40)和22.0%(9/41),差异有统计学意义(χ2=15.305,P<0.01).结论 痰或血培养物FQ-PCR检测有助于提高结核或结核合并艾滋病患者的诊断,同时显著提高了痰涂片阴性肺结核患者的诊断.     

荧光定量PCR对血及痰培养物中结核分枝杆菌DNA的检测

Objective To evaluate if fluorescence quantitative PCR (FQ-PCR) detection for Mycobacterium tuberculosis in blood or sputum culture can help tuberculosis (TB) diagnosis. Methods A total of 81 patients with a clinical diagnosis of tuberculosis but sputum negative were enrolled, 40 were tuberculosis group and 41 coexisting HIV were HIV-TB group. Blood and sputum were cultured for bacilli or L-forms of Mycobacterium tuberculosis, and FQ-PCR was used to detected bacilli DNA. Results For pulmonary tuberculosis group, 54.1 %(20/37) were positive for bacilli or Informs of Mycobacterium tuberculosis in sputum by FQ-PCR, 27.5% (11/40) were positive in blood culture, 22.5%(9/40) were positive in blood by FQ-PCR, and the total positive rate of blood was 42.5% (17/40). But for HIV-TB group, only 2 positive cultures were found in 10 sputum, the positive rate of blood culture was 7.3% (3/41), and the positive rate of blood was 17.1%(7/41) by FQ-PCR. There was no significant difference between two groups in the positive rate of Mycobacterium tuberculosis by FQ-PCR after blood cultures (P > 0.05). The total positive rates detected by FQ-PCR of sputum or blood cultures were 65.0% (26/40) and 22.0% (9/41) respectively, and there was significant difference between two groups( χ2 = 15.305, P < 0.01). Conclusions FQ-PCR for blood or sputum culture detection appears to be a useful method to diagnose TB in persons with or without HIV infection. The use of FQ-PCR significantly enhance the efficiency of the etiological diagnosis of sputum negative pulmonary tuberculosis.     

荧光定量PCR对血及痰培养物中结核分枝杆菌DNA的检测

Objective To evaluate if fluorescence quantitative PCR (FQ-PCR) detection for Mycobacterium tuberculosis in blood or sputum culture can help tuberculosis (TB) diagnosis. Methods A total of 81 patients with a clinical diagnosis of tuberculosis but sputum negative were enrolled, 40 were tuberculosis group and 41 coexisting HIV were HIV-TB group. Blood and sputum were cultured for bacilli or L-forms of Mycobacterium tuberculosis, and FQ-PCR was used to detected bacilli DNA. Results For pulmonary tuberculosis group, 54.1 %(20/37) were positive for bacilli or Informs of Mycobacterium tuberculosis in sputum by FQ-PCR, 27.5% (11/40) were positive in blood culture, 22.5%(9/40) were positive in blood by FQ-PCR, and the total positive rate of blood was 42.5% (17/40). But for HIV-TB group, only 2 positive cultures were found in 10 sputum, the positive rate of blood culture was 7.3% (3/41), and the positive rate of blood was 17.1%(7/41) by FQ-PCR. There was no significant difference between two groups in the positive rate of Mycobacterium tuberculosis by FQ-PCR after blood cultures (P > 0.05). The total positive rates detected by FQ-PCR of sputum or blood cultures were 65.0% (26/40) and 22.0% (9/41) respectively, and there was significant difference between two groups( χ2 = 15.305, P < 0.01). Conclusions FQ-PCR for blood or sputum culture detection appears to be a useful method to diagnose TB in persons with or without HIV infection. The use of FQ-PCR significantly enhance the efficiency of the etiological diagnosis of sputum negative pulmonary tuberculosis.     

检测结核分枝杆菌两种不同方法的比较

目的比较实时荧光定量PCR法与细菌培养法检验结核分枝杆菌的能力。方法收集2013-2014年天津市某三甲医院痰涂片抗酸染色阳性肺结核患者的痰液标本200份,分别应用细菌培养法与实时荧光定量PCR法,对上述患者的痰标本进行检测。结果痰涂片抗酸染色阳性结核病患者的痰标本中,应用实时荧光定量PCR法检测结核分枝杆菌的阳性率为58.5%,应用结核分枝杆菌培养法检测的阳性率为42.0%,差异有统计学意义(P0.05)。结论荧光定量PCR技术与细菌培养法尚不能取代痰涂片抗酸染色检测结核分枝杆菌。     

两种结核分枝杆菌快速检测方法的比较

目的比较荧光定量PCR检测和直接扩增检测两种方法对结核分枝杆菌检测的敏感性、特异性,及在国境口岸卫生检疫工作中的应用前景。方法应用结核分枝杆菌荧光定量PCR和直接扩增检测47份疑似或确诊活动性肺结核空腹痰标本,并与液体培养结果进行比较。结果荧光定量PCR法与直接扩增法对结核分枝杆菌检测敏感性分别为46.7%和100%,特异性分别为81.2%和84.4%。结论结核分枝杆菌直接扩增检测是一种较为敏感而特异的快速检测方法,在国境口岸卫生检疫部门具有重要的应用价值。     

实时荧光PCR方法检测结核分枝杆菌mRNA的研究

目的建立检测结核分枝杆菌mRNA表达水平的实时荧光PCR反应体系,快速鉴定结核分枝杆菌。方法设计合成结核分枝杆菌mRNA相应引物和探针,探针标记以JOE为报告基团,BHQ1为猝灭基团。优化反应条件,建立结核分枝杆菌mRNA的实时荧光PCR检测方法。通过检测22份肺结核患者痰液、10份健康无症状人群痰液、结核分枝杆菌标准菌株和偶然分枝杆菌菌株培养菌落,检验方法的特异性、重复性和灵敏度。结果肺结核患者痰液检测均出现典型扩增曲线,CT均值31.35,标准差4.31。健康无症状人群痰液及偶然分枝杆菌未出现扩展曲线。对痰液标本及稀释RNA重复检测的变异系数在2.54%以下,检测CT值与痰涂片抗酸染色分枝杆菌的数量呈良好相关性。结论建立了一种快速实时检测结核分枝杆菌mRNA基因的荧光PCR方法,具有良好的敏感性和特异性。     

实时荧光定量PCR检测耐药结核分枝杆菌中耐药相关基因whiB7的表达

目的探讨结核分枝杆菌耐药性与whiB7基因表达水平之间的关系。方法以耐受利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇和氟喹诺酮的结核分枝杆菌临床分离株为研究对象,利用实时定量PCR的方法,检测药物刺激结核分枝杆菌后whiB7基因表达水平的变化。结果除利福平刺激相应的菌株后,whiB7基因的表达水平变化不明显外,其余药物的刺激均会引起结核分枝杆菌耐药株的whiB7基因表达水平发生显著变化。结论结核分枝杆菌的whiB7基因是对多种抗生素刺激发生反应的基因,推测whiB7的表达参与结核分枝杆菌的耐药过程。     

核酸纯化对蝎型探针定量PCR准确检测结核分枝杆菌DNA的必要性研究

目的探讨经煮沸、Chelex100树脂处理、核酸纯化三种方法平行处理的标本在进行结核分枝杆菌蝎型探针荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测中的有效性,以得到标本的最佳处理效果。方法收集42例结核确诊患者的多种标本和14例非肺结核患者的痰标本,对其分别用上述3种方法平行处理后,采用蝎型探针荧光定量PCR法进行检测,并分析其结果。结果核酸纯化法处理的标本阳性检出率为100%,明显高于煮沸法57.14%和Chelex100树脂法52.38%(分别为P=0.0103,P=0.0233);尤其是外观呈血性和菌阴性的标本,采用核酸纯化法处理标本后检测所得结核DNA量较其他方法处理所得量高约1~2个数量级。结论标本的处理对于结核分枝杆菌蝎型探针荧光定量PCR检测十分重要,煮沸(裂解)法和Chelex100树脂法不适合用以处理临床标本,而应使用核酸纯化法。     

荧光定量PCR在结核分枝杆菌检测中的应用价值

目的比较荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)与抗酸染色、改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异性,探讨FQ-PCR检测痰标本中结核分枝杆菌的应用价值。方法对311例临床确诊的肺结核病患者和40例非结核呼吸系统疾病患者的痰标本应用FQ-PCR法、痰涂片抗酸染色法、改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌。结果FQ-PCR、抗酸染色法、改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌的阳性率分别为47.0%(146/311)、28.3%(88/311)、35.4%(110/311),特异性分别为100.0%、100.0%、95.2%,以FQ-PCR检测的阳性率最高。结论FQ-PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法,在临床上有重要应用价值。     

TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测结核分枝杆菌北京基因型的研究

目的探讨TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测结核分枝杆菌北京基因型菌株的效果。方法对杭州地区136株结核分枝杆菌临床分离株水煮法提取DNA,分别用TaqMan-MGB探针实时荧光PCR与间隔区寡核苷酸(Spoligotyping)基因分型方法进行北京基因型菌株鉴定,比较2种方法的一致性,同时评价TaqMan-MGB探针实时荧光PCR的最低检测限。结果以Spoligotyping基因分型方法为标准,136株结核分枝杆菌中,检测到北京基因型结核分枝杆菌105株,占77.21%。TaqMan-MGB探针实时PCR方法与Spoligotyping基因分型方法鉴定北京基因型菌株结果完全一致。TaqMan-MGB探针实时荧光PCR对北京基因型最低检出限为0.488 pg/μl。结论与Spoligotyping基因分型方法相比,TaqMan-MGB探针实时PCR方法检测北京基因型操作简单,耗时短,灵敏度高,可以快速地区分北京基因型与非北京基因型结核分枝杆菌。     

RNA恒温扩增实时检测技术与荧光定量PCR联合检测肺泡灌洗液对痰涂阴性肺结核的快速诊断价值

目的通过采用RNA恒温扩增实时检测技术(FQ-PCR)两种不同类型靶标核酸检测方法联合检测支气管肺泡灌洗液(BALF)标本,评估联合应用对痰涂阴性肺结核的诊断价值。方法采集2014年11月-2016年5月医院收治的疑诊为肺结核并且痰涂片至少3次阴性的1 155例患者灌洗液标本,剔除295例未明确诊断病例,肺结核确诊患者672例纳入肺结核组,其他肺部疾病188例(包括43例非结核分枝杆菌疾病)纳入对照组,以临床诊断为金标准,计算SAT-TB与FQ-PCR联合检测的各类评价指标,并与单一SAT-TB、FQ-PCR、结核分枝杆菌快速培养(Bactec MGIT 960)、抗酸杆菌染色进行比较,绘制受试者工作特征曲线(ROC)进行分析比较。结果以临床诊断为"金标准",分别以AFS、MIGT960、SAT-TB、FQ-PCR、SAT-TB与FQ-PCR联合检测平行试验(单阳)、系列试验(双阳)为检验变量时,ROC曲线下面积(AUC)依次为0.507、0.501、0.670、0.660、0.734、0.658,准确性依次为29.45%、33.64%、58.67%、58.32%、67.40%、49.82%,SAT-TB和FQ-PCR单独检测或者联合检测其诊断价值均有统计学意义(P<0.001);对痰涂阴性肺结核病诊断价值比较,平行试验>SAT-TB>FQ-PCR>系列试验>涂片>MIGT960。结论与细菌学检测方法比较,SAT-TB与FQ-PCR联合检测痰涂阴性肺结核病诊断具有快速、敏感、鉴别结核分枝杆菌(MTB)与非结核分枝杆菌(NTM)等优势,缩短了确诊时间,提高准确率,给痰涂阴性肺结核患者提供一种有效辅助手段,值得临床推广应用。     

结核分枝杆菌两种培养方法比较

为了更快、更准地检测结核分枝杆菌,并且能客观评估肺结核化疗效果与控制效果,使用Bact/ALERT 3D液体培养技术是一个较好的结核杆菌培养方法,有利于早发现耐药患者^[1]。     

结核分枝杆菌插入序列6110DNA实时定量检测及其对结核病诊断价值的探讨

目的　建立一种实时定量检测结核分枝杆菌插入序列 6110 (IS6110 )DNA的方法 ,并探讨其在结核病诊断中的价值。方法　采用Taqman技术和Lightcycler定量PCR仪对结核分枝杆菌IS6110DNA进行实时定量检测。结果　对 2 13例临床送检的各类标本进行检测 ,3 2例阳性 ,阳性率为 15 0 2 %,阳性标本的定量结果范围为 3 1～ 7 2× 10 6copies/ml,对结核病诊断的灵敏度为82 76%,特异性为 95 65 %。结论　结核分枝杆菌IS6110DNA实时定量检测是一种快速有效的结核病诊断的方法     

三种方法检测涂阴肺结核患者痰液和灌洗液结核分枝杆菌结果分析

目的比较三种不同检测方法对涂阴肺结核患者痰液和支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌检测结果,探讨如何提高涂阴患者的病原学阳性率。方法选取2015年7月至2017年6月,衢州市人民医院住院患者117例,分别采用浓缩涂片抗酸染色、液体培养和Xpert MTB/RIF法检测痰液和肺泡灌洗液结核分枝杆菌,比较同种样本不同检测方法的阳性率。结果 117例涂阴患者痰液样本Xpert MTB/RIF检测、浓缩涂片抗酸染色、分枝杆菌液体培养阳性率分别为23.08%(27/117)、4.27%(5/117)、21.37%(25/117),117例涂阴患者肺泡灌洗液样本Xpert MTB/RIF检测、浓缩涂片抗酸染色、分枝杆菌液体培养阳性率分别为45.30%(53/117)、17.09%(20/117)、44.44%(52/117)。同种样本比较Xpert MTB/RIF和液体培养法阳性率高于浓缩涂片法,差异有统计学意义(χ~2=5.96,P0.05)。不同种类样本比较,肺泡灌洗液3种方法阳性检出率均高于痰液同种方法,差异有统计学意义(χ~2=5.13,P0.05)。结论对涂阴患者的样本进行液体培养和Xpert MTB/RIF检测可提高病原学阳性率。肺泡灌洗液检测能进一步提高阳性检出率。     

3种方法检测结核分枝杆菌检测的比较

目的分析比较结核患者痰标本结核杆菌检验痰涂片、痰培养及分子生物学检测方法的检测效果。方法选取2017年1月1日~6月30日开封市结核病防治所住院的606例疑似肺结核者的痰标本,同时进行荧光定量PCR、痰培养和痰涂片抗酸染色检测。结果例肺结核患者PCR检查、罗氏改良培养、痰液直接厚涂片检查检测法检测阳性率分别为33.0%、27.9%、20.1%;PCR技术与罗氏培养和直接涂片之间的灵敏度分别为86.98%和86.98%;特异性分别为88.56%和84.50%。结论肺结核患者经由荧光定量PCR检查检验痰结核杆菌准确率较高,建议进一步在临床应用及推广。     

两种培养技术在结核分枝杆菌培养中的比较

目的比较1Bact/ALERT 3D血培养仪液体培养和固体罗氏培养差异。方法对治疗2个月后150例初、复治涂阳肺结核患者的2个月末的痰标本进行前处理后,分别用上述两种方法进行培养。结果 150例中,两种方法的阳性率分别为62.67%、11.33%,P0.001(其中涂片阳性37例,两种方法的阳性率分别为72.97%、35.14%,P0.01;涂片阴性113例,两种方法的阳性率分别为57.52%、3.54%,P0.001)。阳性平均报告时间分别为20.5 d、90 d;污染率分别为0、4.7%。结论 Bact/ALERT 3D液体快速培养法检测结核分枝杆菌,具有阳性率高,能缩短报告时间,污染率低,安全可靠,自动化自动化程度高,在耐药结核病早期诊断中具有应用价值。