补体C3a对人中巨噬细胞凋亡影响的实验研究

目的 探讨补体C3a对人巨噬细胞凋亡的影响.方法 采用流式细胞技术,检测人巨噬细胞被补体c3a作用后,其凋亡率随补体C3a的作用浓度及时问的变化.结果 随着补体C3a作用浓度的增加,人巨噬细胞凋亡率下降;随着补体C3a作用浓度增加和作用时间延长,其对人巨噬细胞凋亡的抑制作用有所增强.结论 补体C3a依浓度及时间依赖,抑制人巨噬细胞的凋亡.     

C3a、C5a及其受体在IgA肾病发病中的作用

目的:探讨C3a、C5a及其受体C3aR、C5aR在IgA肾病(IgAN)发病中的作用。方法:选取病理分级Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级(n=30、30、23)IgAN患者的肾组织标本83例作为病例组,同时选取肾脏肿瘤患者手术切除的正常肾组织10例作为对照,采用免疫组化方法分别检测C3a、C5a、C3aR及C5aR在肾组织中的表达;收集83例IgAN患者血清、尿液标本作为病例组,同时收集10例健康成人血清、尿液标本作为阴性对照,10例脓毒血症患者血清、尿液标本作为阳性对照,采用ELISA法检测各组血清、尿液中C3a、C5a水平。结果:C3a、C3aR在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级IgAN患者肾组织中阳性细胞百分比分别为(16.0±5.7)%、(12.3±3.5)%,(19.9±6.3)%、(20.9±3.7)%,(38.3±17.3)%、(30.6±4.3)%,高于正常对照组的(3.4±1.6)%、(1.7±1.6)%(F=32.606和190.792,P均<0.001)。C5a、C5aR在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级IgAN患者肾组织中阳性细胞百分比分别为(14.4±2.6)%、(14.8±3.6)%,(22.0±3.9)%、(20.2±5.0)%,(31.1±4.3)%、(41.4±8.5)%,高于正常对照组的(7.8±2.8)%、(6.1±1.6)%(F=143.992和140.237,P均<0.001)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级IgAN、脓毒血症患者和健康人血清中C3a、C5a水平分别为(2.20±0.30)、(3.60±0.70),(1.90±0.50)、(3.80±0.70),(1.90±0.80)、(3.40±0.70),(2.30±0.50)、(3.20±1.10),(0.90±0.50)、(0.06±0.04)μg/L(F=6.033和27.383,P均<0.05);尿液中C3a、C5a水平分别为(1.80±0.80)、(2.60±1.30),(4.80±2.00)、(4.80±1.50),(7.00±3.00)、(7.00±4.90),(3.30±1.90)、(3.00±0.90),(0.03±0.01)、(0.07±0.07)μg/L(F=20.913和11.892,P均<0.001)。结论:C3a、C5a参与IgAN的发生与发展,在IgAN病理损伤过程中起重要作用。     

补体在牙周炎发生发展过程中作用的研究进展

牙周炎导致的牙周组织破坏是牙周微生物与宿主免疫系统相互作用的结果。虽然牙周微生物是牙周炎发生发展的始动因子,但补体系统作为机体免疫系统的重要组成部分,在对抗病原微生物入侵的同时产生免疫炎症反应,在牙周炎的病理生理过程中扮演更重要的角色。因此,了解补体系统在牙周炎发生发展过程中的作用,不仅能深入理解牙周炎的发病机制,而且能为进一步以补体系统为靶点进行牙周炎的防治提供新的策略。现从补体系统的组成、补体的激活途径及补体的生理和病理作用,补体系统的多种成分（补体C3和C5a等）介导的免疫炎症反应在牙周炎发生发展中的作用及其机制,补体参与牙周炎发生发展的临床和组织学证据以及通过阻断补体的作用来治疗牙周炎的可行性,补体临床应用存在的挑战以及可能的解决方案等方面综述补体与牙周炎的关系,以便系统深入地探讨国内外相关研究的现状及存在的问题,为进一步研究提供新方向,为牙周炎防治提供合理规范的新方案和新思路。     

补体C3aR在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的表达

【摘要】 目的 观察脊髓缺血再灌注损伤(SCIR)过程中大鼠脊髓C3aR的表达水平及细胞定位,探讨C3a-C3aR 信号通路在SCIR病理过程中的作用。方法 使用体重为250g— 300g的雄性成年SD大鼠,参照Zivin法构建大鼠 SCIR模型。将54只大鼠随机分为假手术组(Sham组,n=9),单纯缺血组(I组,n=9)和缺血再灌注组(IR组,n=36), 缺血再灌注组又依据再灌注时间不同分为再灌注12h组(IR12H组,n=9)、再灌注24h组(IR24H组顶=9)、再灌注48h 组(IR48H组,n=9)和再灌注3d组(IR3d组,n=9) o观察动物行为学改变并进行运动功能评分,评估模型是否制备成 功;采用ELISA法检测SCIR过程中大鼠血浆C3a分子的表达水平;制备大鼠脊髓组织冰冻切片,采用双重标记的免疫 组织荧光染色法检测SCIR过程中大鼠脊髓组织C3aR的表达变化及细胞定位。结果 大鼠脊髓缺血lh及再灌注lh、 6h、12h、24h和48h后出现明显的运动功能障碍;IR组大鼠血浆C3a含量较Sham组显著升高(P<0.05),其中,IR24h 组大鼠血浆C3a含量最高;IR组大鼠脊髓组织C3aR表达上调,主要在神经元和小胶质细胞上表达。SCIR过程中脊髓组织小胶质细胞大量激活,小胶质细胞上高表达C3aR是C3aR表达上调的主要原因。结论 SCIR过程中C3a-C3aR信 号通路激活,C3a在血浆中表达升高,C3aR在脊髓组织中表达上调,C3a-C3aR信号通路可能在SCIR病理进程中发挥着 诱导炎症反应加重脊髓损伤等作用。     

结肠癌组织中补体C5a/C5aR通路活化上调FGL2的表达

目的 探讨补体C5a/C5aR通路在结肠癌发病中对纤维介素蛋白-2凝血酶原酶(fibrinogen-like protein 2,FGI2)的调节机制,明确补体系统在结肠癌发病中的功能和作用.方法 收集2013年12月至2015年7月第三军医大学西南医院普外科、新桥医院消化科15例经病理活检确诊的住院临床结肠癌患者癌及癌旁组织.采用免疫组织化学方法检测结肠癌患者癌及癌旁组织中补体活化片段C5b-9、活化C3及C5aR的表达,佐证补体系统在结肠癌中的活化状态;进一步通过体内外实验(Western blot)验证结肠癌患者癌及癌旁组织MAPK信号通路中P38的磷酸化水平及FGL2的沉积,明确结肠癌发病中补体C5a/C5aR通路与二者的调节关系.结果 免疫组织化学及Western blot实验证实结肠癌患者癌组织C5b-9、活化C3及C5aR的表达明显高于癌旁组织,FGL2的沉积亦显著高于癌旁组织;体外结果提示C5a能促进巨噬细胞系Raw264.7 MAPK通路中P38的磷酸化水平(P =0.0013)及FGL2的产生能力(P =0.0071),加入C5aR阻断剂之后,二者表达随之减弱.结论 C5a/C5aR通路能通过MAPK信号途径中的P38信号完成对FGL2的调节作用进而参与结肠癌的发病进程.     

牙周炎患者自身组织核酸对小鼠巨噬细胞中NLRP3 mRNA表达的影响及其意义

目的：检测牙周炎患者自身组织核酸刺激小鼠巨噬细胞后炎性相关因子NOD样受体蛋白3（NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶1（caspase-1）、白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素18（IL-18） mRNA表达水平,探讨牙周炎患者自身组织核酸对小鼠巨噬细胞中炎性相关因子的作用。方法：于慢性牙周炎患者翻瓣术中采集炎性牙周组织、于牙周组织健康患者冠延长术中采集健康牙周组织,分别提取组织总RNA逆转录成cDNA （cDNA质量浓度为1 mg·L^-1）。培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,分为对照组和实验组,分别加入上述提取的健康牙周组织cDNA （健康牙周组织）和炎症牙周组织cDNA （炎症牙周组织）共孵育。共孵育4、6和8h后,实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）法检测各组RAW264.7细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平。结果：显微镜下观察,小鼠巨噬细胞RAW264.7生长状态良好,细胞形态似圆形和多边形,胞浆透明,胞体丰满。与对照组比较,实验组在4、6和8h时RAW264.7细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）,6 h时实验组RAW264.7细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平最高。结论：牙周炎患者自身组织核酸可促进小鼠巨噬细胞中炎性相关因子mRNA表达,牙周炎患者自身组织核酸对小鼠巨噬细胞的活化具有免疫调节作用。     

免疫组化及原位杂交检测人肺组织中的C5a受体

目的 检测正常人肺组织细胞上C5aR的表达和分布，阐明急性肺损伤，ARDS等病理发生过程中C5aR可能的作用。方法 以小鼠抗内C5aR短肽单克隆抗体作为检测抗体，对人肺组织细胞作免疫组织化学ABC染色；pUC19-C5aH质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，得到910bp的片段，地高辛标记制作原位杂交的探针，对肺血管内皮细胞作原位杂位检测。结果 发现肺血管内皮细胞有C5aRmRNA。肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞，肺泡平滑肌细胞，血管内皮细胞以及巨噬细胞上均有C5aR表达。结论 C5a作为前炎症因子，与肺组织细胞上C5aR作用后，可能会介导急性肺损伤，ARDS等疾病的发生，说明这些疾病可能与C5a有关。     

补体3a受体第2胞外上174位硫化酪氨酸形成其配基结合位点

目的探讨酪氨酸硫化对补体第3成分片断a受体(C3aR)配基结合的意义.方法体外构建全长人野生型C3aR及其突变型的表达质粒,并测定开放读框序列.证实序列正确后,转染人肾胚胎上皮细胞(HEK)293T 24 h后用35S-蛋氨酸/半胱氨酸或35S-硫标记转染的HEK 293T细胞,48 h后再进行免疫沉降实验.转染的HEK 293T细胞在24h后分成两部分,一部分细胞转染后48 h用流式细胞仪检测受体的表达水平,另一部分用于碘-125标记配基结合实验.测定转染了C3aR及其突变体的犬胸腺上皮细胞(Cf2Th)在48 h后钙离子细胞内流.结果突变型C3aR的表达较野生型降低;C3aR第2胞外环的5个酪氨酸翻译后被硫化修饰;将184、188、317和318位酪氨酸突变为苯丙氨酸即可阻断酪氨酸硫化,且不影响配基结合和钙离子细胞内流;但将174位酪氨酸突变为苯丙氨酸后,则配基和受体的结合完全被阻断,并可有效抑制钙离子内流.结论证实了C3aR与配基的双位点结合模型,174位硫化的酪氨酸是其配基重要的结合位点.七次跨膜片断(7TMS)的G蛋白耦联受体(GPCR)胞外环区域的硫化酪氨酸对配基结合功能可能具有决定意义.     

低浓度补体C3对大脑皮层神经元生物活性及突起生长的影响

目的 探讨补体C3对大脑皮层神经元生物活性和突起生长的影响及可能机制. 方法 在原代培养的孕16 d大鼠胚胎皮层神经元中分别加入不同浓度的外源性C3蛋白、神经生长因子和C3a受体拮抗剂SB290157.WST-8 法测定神经元活性(细胞存活率).选用MAP2与β-tubulin免疫荧光细胞化学双标染色,荧光显微镜下观察并计算神经元纯度;应用神经元形态分析软件采集神经元树突、轴突长度及胞体面积等数据,分析不同浓度补体C3及C3a受体拮抗剂对突起生长的影响.以不含其他试剂的神经元细胞及其培养液作为正常对照组. 结果 皮层神经元存活率检测显示,高浓度 (10～100 μg/mL) C3组明显低于正常对照组(P<0.05),而低浓度(0.01～1 μg/mL)C3组与对照组无明显差异. 1 μg/mL 和5 μg/mL C3均促进皮层神经元突起生长,尤其是轴突的生长,其树突和轴突长度分别增长20% ～39%和40% ～61%,与正常对照组比较有显著差异(P<0.05和P<0.01);而加入C3a受体拮抗剂后,皮层神经元树突和轴突长度与对照组比较无明显差异. 结论 低浓度补体C3对皮层神经元轴突和树突生长有明显促进作用,而该作用可能由C3活性片段C3a受体介导.     

C5a/C5aR通路在硕大利什曼原虫易感小鼠免疫病理发生中的作用及其机制

目的研究C5a/C5aR通路在对硕大利什曼原虫(Leishmania major,L.major)易感的BALB/c小鼠免疫病理发生中的作用及机制探讨。方法以C5aR KO小鼠(BALB/c背景)为模型,观察比较了WT和C5aR KO的BALB/c小鼠在L.major感染后的病变情况,有限稀释法检测了各组感染小鼠体内寄生虫的负荷,并进一步通过FACS检测了相关细胞因子如IL-17和IL-4的产生,来探讨C5a/C5aR通路在L.major易感型BALB/c小鼠免疫病理发生中的作用机制。结果相比WT小鼠,C5aRKO小鼠感染L.major后的病变程度明显减轻(P<0.05),体内寄生虫负荷也显著降低(6.952±0.398vs 4.340±0.434,P<0.01);同时,FACS胞内染色结果表明CD4+IL-4+T细胞亚群百分比显著降低(0.960 0±0.148 3 vs0.314 0±0.042 6,P<0.01),但CD3+IL-17+T细胞亚群的百分比在两组之间无显著差异(0.792 0±0.051 3 vs 0.858 0±0.084 5,P=0.522 3)。结论 C5a/C5aR通路通过调节Th2细胞关键细胞因子IL-4的产生,在L.major易感小鼠的免疫病理发生中发挥作用。     

微卡（VACCAE）联合2H3R3Z3E3/4H3R3方案治疗初治涂阳肺结核的临床效果

目的应用微卡(VACCAE)联合常规抗结核药物2H3R3Z3E3/4H3R3治疗初治涂阳肺结核的临床疗效。方法选取100例初始涂阳肺结核患者,随机分为对照组50例和观察组50例,两组均采用"世界银行贷款+中国结核病控制项目"的2H3R3Z3E3/4H3R3方案治疗,观察组在上述常规化疗药基础上联用微卡22.50μg深部肌肉注射;观察两组的痰菌阴转率、病灶吸收率、空洞闭合率、临床症状改善情况、不良反应发生率。结果治疗1个月后,观察组临床症状完全消失率显著高于对照组(P<0.05)。观察组的痰菌转阴率、病灶吸收率、空洞闭合率均优于对照组(P<0.05)。微卡注射后无严重不良反应。结论微卡联合常规抗结核药物2H3R3Z3E3/4H3R3方案治疗初治涂阳肺结核能够快速缓解临床症状,且疗效显著不良反应小,具有临床应用价值。     

稳定表达神经营养素-3的NIH3T3细胞建立及鉴定

目的：建立稳定表达NT3的NIH3T3细胞株，通过体外共培养实验观察其对耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响．方法：以阳离子脂质体作为载体，将携带有外源性基因NT3的重组真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3转染小鼠成纤维细胞，进行RT-PCR，Western-blot分析及免疫组化鉴定，并与耳蜗螺旋神经节细胞进行共培养实验．结果：得到抗G-418的阳性细胞克隆；RT-PCR的产物约为744 bp；Western-blot可见一清晰的蛋白条带，与NT3的蛋白分子量相符合．NT3免疫组化染色结果显示转染NT3-cDNA的NIH3T3细胞胞质呈棕黄色着色．NT3转染组细胞与耳蜗螺旋神经节细胞共培养2wk后，与对照组相比，耳蜗螺旋神经节细胞无明显减少．结论：成功建立了稳定表达NT3的NIH3T3细胞株；该细胞对耳蜗螺旋神经节细胞有很好的营养支持作用．     

胱天蛋白酶3介导BAG3蛋白剪切的研究

  目的 解析胱天蛋白酶（caspase）3介导BCL2结合抗凋亡基因3（BAG3）酶切的具体作用靶点,明确caspase 3裂解对BAG3抗凋亡作用的影响。方法 采用生物信息学方法筛选BAG3蛋白序列中潜在胱天蛋白酶caspase酶切位点;采用定点突变法构建潜在胱天蛋白酶caspase酶切位点突变体;体外翻译野生型和突变体BAG3蛋白;利用重组胱天蛋白酶caspase对野生型或突变型重组BAG3蛋白进行体外剪切实验;构建BAG3裂解片段的真核表达载体,突变型或片段BAG3表达载体转染SW1990细胞;利用Western blot检测各组细胞中BAG3蛋白的裂解情况;利用流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率。结果 在BAG3蛋白序列中存在K344EVD347和L515EAD518 2个潜在胱天蛋白酶caspase酶切位点;胱天蛋白酶caspase3可有效剪切D518A突变型BAG3,而不能剪切D347A突变型BAG3;D518A突变型和野生型BAG3同等程度抑制MG132诱导的细胞凋亡,D347A突变型BAG3对细胞凋亡的保护作用高于D518A突变型或野生型BAG3,而N末端和C末端剪切片段BAG3对MG132诱导的细胞凋亡无作用。结论 胱天蛋白酶caspase3主要在D347位点裂解BAG3蛋白;BAG3在D347位点的剪切使其丧失了原有的抗凋亡作用。     

APA-3T3细胞微囊的深低温保存

目的:通过优选冻存液的成份和浓度,建立低温保存APA微囊化小鼠成纤维细胞(3T3细胞)的方法。方法:用海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊(APA)包裹3T3细胞制成APA-3T3细胞微囊。以高糖DMEM培养液为基础冻存液,分别加入不同浓度的二甲基亚砜(DMSO)或牛血清白蛋白(BSA)。分别将不同的冻存液加入APA-3T3中。按程序控制降温梯度,置于液氮中保存。快速复温后,光镜下观察APA-3T3的形态、细胞活率及膜通透性。结果:①10%DMSO组的微囊内细胞活率降低最少,细胞活率达(75.68±1.54)%,P<0.01。微囊完好率达到(94.48±0.90)%,P<0.01。②与其它组相比,4%BSA组的微囊内细胞活率降低程度最小,活率达(73±1.26)%,P<0.01。微囊完好率最高,为(85.1±0.82)%,P<0.01。③加入不同成份和浓度的冻存液对微囊的通透性没有明显影响。结论:在冻存液中加入10%DMSO和4%BSA,可在低温保存的过程中较好地保护细胞的存活及微囊的完整性。     

改进的"一锅煮"法合成3-氨基-3-芳基丙酸

目的:改进3-氨基-3-芳基丙酸的合成方法,提高化学产率.方法:以甲醇为反应溶剂,芳香醛和3当量醋酸铵反应生成希夫碱,再加入丙二酸,反应混合物剧烈回流16 h得目标产物.将产物用核磁共振仪进行光谱学鉴定.结果:合成出10种3-氨基-3-芳基丙酸,其中5种为新的β-氨基酸,产率为25%～79%,比文献报道产率提高约10%.结论:该合成法简单、易行,降低了反应成本,有很好的工业应用价值.     

血小板生长因子在NIH3T3成纤维细胞和MT3转化细胞应答中的作用

血小板生长因子(PDGF)通过促进细胞外Ca~(2 )内流,增加细胞内Ca~(2 )浓度,但在亲代NIH3T3成纤维细胞和转化的MT3细胞中,却表现出不同的作用。在亲代NIH3T3成纤维细胞中,PDGF能够抑制舒缓激肤介导的细胞内Ca~(2 )浓度增加,未能见到细胞内Ca~(2 )波动现象;而在转化的MT3细胞中,PDGF丧失了对舒缓激肽介导的细胞内Ca~(2 )浓度增加的抑制作用,常常引起细胞内Ca~(2 )波动现象。对于DNA的合成,PDGF在两种细胞中,也表现出有时程的差异。     

用远端功能化技术合成制备地塞米松的中间体3a,17a—二羟基—16a—甲基—5a—孕甾—9（11）—烯—20—酮

一般来说 ,用薯蓣皂素和替柯吉宁这样的原料合成地塞米松等高效皮质激素 ,至少有两部分的结构改造要用到微生物发酵反应 ,一是甾体Ａ环中Δ1,4 双烯的引入 ,另一是Ｃ环中 9,11位的改造。我们前一阶段对由替柯吉宁合成地塞米松的方法[1] 进行了改进 ,采用化学合成法高收率地引入了Δ1,4 双烯[2 ] 。而我们报道了在地塞米松 ( 6)合成中 ,用远端功能化技术[3～ 6] ,利用 3位引入的模板 ,高收率地引入 9( 11) 双键 ,使地塞米松的合成可以摆脱制约产量的微生物发酵法来进行(图 1)。该技术目前在国际上尚无完全相同的报道 ,例如 ,用远端功能化…     

3α—雄烷二醇对性腺发育不良小鼠附性腺生长的影响

目的：本文观察了给预(3α－diol)后,性腺功能低下（hpg)小鼠的前列腺,附睾和精囊腺生长变化,方法：用硅胶囊皮下埋植缓释给药,连续5周,设缓释给药hpg小鼠实验组（n=7),不给药hpg小鼠组（n=7)和正常腺功能小鼠对照组（n=10),给药结束后测定各附性的重量及前列腺腺管末梢的数目,结果：与hpg小鼠对照组相比,hpg小鼠给药实验组各附性腺的重量均明为增加（P＜0．001）,前列腺腺管形态发育趋于正常,但各附性腺的重量及前列腺腺管末梢榉数目仍于正常性腺功能小鼠对照组（P＜0．001）,结论：3α－diol能明显刺激hpg小鼠附性腺生长,发育。     

14—3—3蛋白

14-3-3是一个在真核生物中广泛表达的酸性蛋白家族，主要以同源／异源二聚体形式存在，通过磷酸化丝／苏氨酸作用与靶蛋白或靶蛋白的两个结构域结合。七种不同亚型的高度保守的14-3-3蛋白与人类细胞中多种不同的信号通路有着密切的关系。14-3-3通过调节靶蛋白间的相互作用在MAPK级联放大效应等信号转导途径中发挥调控作用。