HMGB1启动子荧光素酶报告基因的构建及鉴定

目的：构建高迁移率族蛋白B1（HMGB1）启动子驱动的荧光素酶报告基因的真核表达载体pGL3-HMGB1P,转染肺泡上皮细胞（A549）后检测报告基因在机械牵张刺激中的转录活性.方法：以A549细胞基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增HMGB1启动子片段,测序正确后克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3,将重组质粒pGL3-HMGB1P导入A549细胞,检测不同强度机械牵张（分别为5%和20%）刺激下荧光素酶的活性变化.结果：PCR和测序结果表明扩增的HMGB1启动子序列正确,酶切检测证实重组真核表达载体pGL3-HMGB1P构建成功.在5%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的2.9倍（P〈0.05）;而在20%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的6.2倍（P〈0.01）.结论：利用荧光素酶报告基因系统证实机械牵张可诱导HMGB1转录表达增加,为深入研究HMGB1转录表达的调控机制提供了基础.     

白介素1-β对人肺腺癌细胞COX-2表达的作用及调节机制

目的 探讨细胞因子白介素-1β（IL-1β）对人肺腺癌细胞株A549细胞环氧合酶2（COX-2）表达的影响及调节机制。方法 A549细胞培养达80％融合后，用不同浓度的IL-1β（0、0.1、1、5和10ng／mL）干预或用5ng/mL IL-1β干预不同时间（0、3、6、9、12和24h）观察白介素-1β（IL-1β）对A549细胞COX-2表达的影响；用5ng／mL IL-1β与有丝分裂原激活的细胞外调节激酶（ERK）抑制剂PD098059、P38有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）抑制剂SB203580、蛋白激酶C（PKC）抑制剂H-7共同干预A549细胞观察IL-1β诱导A549细胞COX-2表达的信号传导途径；用COX-2系列报告基因质粒及对照质粒转染A549细胞后予以IL-1β干预，以不加IL-1β干预的细胞为对照组观察IL-1β对COX-2启动子的影响；westem blot检测COX-2蛋白表达，RT—PCR检测COX-2 mRNA表达。COX-2报告基因活性应用荧光素酶活性分析法测定。结果 A549细胞COX-2蛋白表达和mRNA表达呈IL-1β浓度依赖性表达增加，干预9h表达达高峰；SB203580、H-7可明显抑制IL-1β诱导A549细胞COX-2表达，PD098059对IL-1β诱导A549细胞COX-2表达无影响；IL-1β对COX-2报告基因无影响。结论 PKC途径和P38 MAPK途径参与IL-1β诱导A549细胞COX-2蛋白表达。     

hnRNP B1 siRNA对肺腺癌细胞A549 p53表达的影响

目的 探讨核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)B1调节肺腺癌细胞A549抑癌基因p53表达的作用.方法 采用前期研究已构建并通过体外实验证实具有较好干扰效果的两对hnRNP B1特异性的小干扰RNA(siRNA)真核细胞表达载体(重组质粒A和D)转染的人肺腺癌细胞株A549作为实验组,对照组为转染空质粒的A549细胞和未转染任何质粒的A549细胞.各组细胞均用10 μmol/L顺铂作用24 h收集细胞.实时荧光定量RT-PCR检测p53 mRNA的表达,Western blot检测P53及磷酸化P53蛋白表达的变化.结果 各组细胞p53 mRNA和蛋白表达量无明显差异,说明hnRNP B1特异性siRNA对A549细胞p53基因mRNA和蛋白表达无影响.转染hnRNP B1 siRNA细胞磷酸化P53蛋白表达率分别为0.87±0.06、0.75±0.06,与空质粒转染组(0.30±0.08) 和未转染组(0.21±0.04)相比明显增高(P<0.01).结论 hnRNP B1 siRNA可上调肺腺癌细胞A549 P53活性,参与肺癌的发生发展.     

肺腺癌细胞A549 hnRNP B1基因RNA干扰的体外研究

目的 体外研究特异的小干扰RNA(siRNA)对肺腺癌细胞A549 hnRNP B1 基因表达及生长的抑制作用. 方法设计和构建由H1启动子驱动产生的特异的hnRNP B1 siRNA 表达质粒,转染至A549细胞,荧光定量PCR法及Western blot检测hnRNP B1基因的表达,MTT法检测该表达质粒转染后对A549细胞生长的影响.结果 针对hnRNP B1 基因构建的重组质粒具有明显的干扰效果,受特异hnRNP B1 siRNA 干扰的A549细胞hnRNP B1 mRNA及蛋白表达下调,细胞生长受到抑制.结论 应用RNA干扰技术可阻止hnRNP B1基因的表达,有望成为肿瘤基因治疗新的研究方向.     

人支气管上皮细胞中苯并芘诱导TNF-α表达的分子机制

目的：构建肿瘤坏死因子-α（TNF-α）启动子双荧光素酶报告基因载体,研究苯并芘（B[a]P）暴露对TNF-α mRNA表达的调控机制。方法：采用Real time-PCR技术检测B[a]P暴露下,人支气管上皮细胞（Beas-2B）中TNF-α mRNA随时间的变化趋势。通过分子克隆技术构建TNF-α启动子双荧光素酶报告基因载体并检测其活性。进一步检测Beas-2B细胞和人肾上皮细胞293T细胞暴露于B[a]P环境下,TNF-α启动子活性的变化趋势。结果：Real time-PCR检测B[a]P暴露下,24 h内,Beas-2B细胞中TNF-α mRNA表达量随时间延长升高。且B[a]P刺激Beas-2B细胞24 h内,TNF-α启动子活性也呈升高趋势。B[a]P刺激293T细胞,TNF-α启动子活性也会升高。结论：成功构建了TNF-α启动子双荧光素酶报告基因载体。而且,B[a]P能够促进TNF-α mRNA的转录从而促进TNF-α mRNA的表达,且promoter1要比promoter2活性强,没有细胞特异性。     

HMGB1启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在机械牵张诱导下的活性检测

目的 构建高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)启动子的红色荧光蛋白报告基因载体.方法 采用基因重组技术构建含HMGB1启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRedl-1-HMGB1P.经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将重组载体转染HEK293细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞内的表达以及对机械牵张刺激的反应.以转染空载体pDsRedl-1的细胞作为对照.结果 PCR、酶切和DNA测序表明重组载体pDsRedl-1-HMGB1P的构建正确,该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平较低,经机械牵张刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光.转染空载体pDsRedl-1的细胞未见红色荧光.结论 成功构建了HMGB1启动子的红色荧光蛋白报告基因载体,对机械牵张刺激有很好的反应.     

改建型STAT1-CC基因慢病毒载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达

目的:构建携带STAT1基因和突变型STAT1-CC基因的慢病毒表达载体,转染肺癌A549细胞并检测STAT1和STAT1-CC基因在肺癌A549细胞内的表达.方法:采用PCR技术从质粒模板中扩增得到目的基因STAT1和STAT1-CC,将其接入含有CMV启动子和绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体中,构建慢病毒载体表达载体Lenti-STAT1和Lenti-STAT1-CC,双酶切和测序鉴定.分别将重组子Lenti-STAT1、LentiSTAT1-CC和包装质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,感染非小细胞肺癌细胞株A549.荧光显微镜观察A549细胞EGFP表达,Western Blotting验证STAT1在A549细胞株中的表达.结果:酶切及测序结果显示成功构建重组慢病毒表达载体Lenti-STAT1和Lenti-STAT1-CC,将慢病毒颗粒感染A549细胞48 h后,观察到宿主细胞内EGFP表达,Western Blotting证实STAT1蛋白在A549细胞中过表达.结论:本实验成功构建了携带STAT1基因和STAT1-CC基因的慢病毒表达载体,并在A549细胞中过表达STAT1基因.     

miR-152通过靶向FGF2抑制肺癌A549细胞系的增殖侵袭

目的:探讨miR-152通过靶向成纤维细胞生长因子2（FGF2）对肺癌A549细胞系的增殖和侵袭的作用机制。方法:通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测正常上皮细胞BEAS-2B和肺癌A549细胞中miR-152和FGF2的表达情况;采用转染技术,分别特异性表达肺癌A549细胞系中miR-152和FGF2基因的表达。将肺癌A549细胞系分为6组:miRNA 空转组（miR-NC组）、miR-152 过表达组（miR-152 mimics组）、miR-152 抑制组（miR-152 inhibitor组）、FGF2过表达空转组（pcDNA3.1-NC组）、FGF2过表达组（pcDNA3.1-FGF2组）和miR-152过表达+FGF2过表达组（miR-152+ pcDNA3.1-FGF2组）。通过qPCR检测A549细胞系中miR-152和FGF2的表达水平;细胞克隆和Transwell小室实验分别检测A549细胞系的增殖和侵袭能力;采用双荧光报告基因法验证miR-152与FGF2结合情况;Western印迹法检测A549细胞系中FGF2、自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）Ⅱ/Ⅰ、beclin1和p62的表达量。结果:qPCR结果显示,与正常上皮细胞BEAS-2B比较,肺癌A549细胞中miR-152的表达量显著降低（P＜0.01）,而FGF2的表达量显著增加（P＜0.01）。TargetScan生物信息学软件预测显示miR-152与FGF2的3′UTR结合,双荧光报告基因检测结果显示,miR-152与FGF2直接结合。细胞克隆和Transwell小室实验结果显示,与miR-NC组比较,miR-152 mimics组中的A549细胞系的增殖和侵袭能力显著减低（P＜0.05）,miR-152 inhibitor组的增殖和侵袭能力显著增加（P＜0.05）。与pcDNA3.1-NC组比较,pcDNA3.1-FGF2组中的A549细胞系的增殖和侵袭能力显著增加（P＜0.05）。与miR-152 mimics组比较,miR-152+ pcDNA3.1-FGF2组中A549细胞系的增殖和侵袭能力显著增加（P＜0.05）。Western印迹结果显示,与miR-NC组比较,miR-152 mimic组FGF2和p62蛋白表达显著降低（P＜0.05）,但LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1的表达量显著增加（P＜0.05）,而miR-152 inhibitor组结果与之相反。与pcDNA3.1-NC组比较,pcDNA3.1-FGF2组FGF2和p62蛋白表达显著增加（P＜0.05）,而LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1的表达量显著降低（P＜0.05）。与miR-152 mimics组比较,miR-152+ pcDNA3.1-FGF2组FGF2和p62蛋白表达显著增加（P＜0.05）,LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1蛋白表达量显著降低（P＜0.05）。结论:miR-152靶向FGF2抑制肺癌A549细胞系自噬,从而降低增殖侵袭能力,可成为肺癌临床治疗的新靶点。     

肿瘤细胞特异启动子hTERT介导的靶向mdr1基因的RNAi用于逆转卵巢癌细胞MDR的研究

目的:探索应用肿瘤细胞特异启动子hTERT介导靶向肿瘤多药耐药基因mdr1的siRNA在卵巢肿瘤细胞特异表达并逆转MDR的可行性。方法:应用携带luc报告基因的报告质粒验证了hTERT启动子在卵巢肿瘤细胞株A2780中的转录活性,构建由hTERT启动子引导的靶向mdr1基因的siRNA表达载体phTERTsiMDR1B,并与携带mdr1基因靶序列的报告质粒进行共转染抑制实验,进一步将phTERT-siMDR1B表达载体与mdr1基因表达载体共转染A2780细胞,检测细胞中mdr1基因的mRNA与P-gp蛋白的表达水平。以具有耐紫杉醇表型的A2780细胞作为靶细胞进行耐药评价实验。结果:hTERT启动子在卵巢肿瘤细胞株A2780中具有良好的转录活性,而在正常人二倍体细胞株MRC-5中无转录活性;hTERT启动子介导的siMDR1B具有良好的抑制效果与特异性;hTERT启动子介导的siMDR1B可显著抑制细胞中mdr1基因的mRNA与P-gp蛋白的表达水平;转染了hTERT启动子介导的siMDR1B表达元件的细胞对紫杉醇的耐药程度显著降低。结论:hTERT启动子介导的靶向mdr1基因的RNAi用于逆转卵巢癌细胞MDR是可行的,本研究结果可为进一步开展卵巢肿瘤MDR逆转研究提供重要基础。     

α平滑肌肌动蛋白红色荧光蛋白报告基因载体的构建及其在细胞中的表达

目的构建α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内α-SMA的基因表达调控提供重要工具。方法克隆并构建含α-SMA启动子区的红色荧光报告质粒pDsRed-SMAp;用脂质体瞬时转染上皮细胞A549,观察α-SMA启动子对转化生长因子（TGF-β1）刺激的反应。结果酶切和DNA测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是pDsRed-SMAp重组载体;该表达载体在上皮细胞静息状态下表达水平很低,经TGF-β1,刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光。结论成功构建了α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白报告质粒pDsRed-SMAp,对生理相关刺激有很好的反应,可有效地用于α-SMA基因表达调控机制的研究。     

缺氧/辐射双敏感性启动子的构建及其转录调控特性

目的: 构建缺氧/辐射双敏感性启动子,阐明其转录调控特性. 方法: 通过基因重组将缺氧反应元件(HREs)序列插入早期生长反应基因-1(Egr-1)启动子的上游,构成缺氧/辐射双敏感性HRE-Egr启动子及其报告载体pHEL,转染肺癌A549细胞. 在2, 4, 6, 8, 10 Gy照射(γ-射线)后及合并缺氧(氧浓度1, 5, 10, 25, 50 mL/L)时,检测转染细胞内报告基因荧光素酶(luciferase, Luc)表达活性,以及在6 Gy照射合并氧浓度10 mL/L时Luc表达的动态变化. 结果: 成功构建了HRE-Egr启动子及其报告载体,转染A549细胞,发现常氧下HRE-Egr启动子照射后表达活性迅速升高,呈辐射剂量依赖性,与Egr-1启动子相一致. 缺氧时,Egr-1启动子辐射诱导活性明显下降(P<0.05),而HRE-Egr启动子活性则显著升高(P<0.01),同时后者活性持续时间(32 h)明显长于前者(16 h). 结论: HRE-Egr启动子具有辐射/缺氧双重敏感性,在缺氧条件下其辐射诱导活性和持续时间明显增强和延长.     

抑肺饮抑制肺癌转移的机制研究

【目的】观察抑肺饮对肺癌细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)-核转录因子kappaB(NF-κB)信号通路以及细胞上皮间质转化(EMT)的影响,探讨抑肺饮对肺癌细胞生长和转移的抑制作用及机制。【方法】制备抑肺饮含药血清,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)实验、侵袭实验和迁移实验观察抑肺饮对肺癌细胞A549增殖、侵袭和迁移能力的影响。以TNF-α诱导A549细胞建立细胞EMT模型,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)法观察抑肺饮对细胞EMT的影响,采用蛋白免疫印迹(Western Blot)法观察抑肺饮对A549细胞中EMT标志物蛋白表达水平及NF-κB p65磷酸化水平的影响,采用荧光素酶报告基因实验观察抑肺饮对NF-κB启动子活性的影响。建立Lewis肺癌移植瘤小鼠模型,称瘤体质量,观察肺脏转移灶情况,采用免疫组织化学法检测瘤组织磷酸化NF-κB p65的表达水平,荧光定量PCR法检测瘤组织B细胞淋巴瘤-xL(Bcl-xL)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的mRNA表达水平。【结果】(1)抑肺饮含药血清能够抑制肺癌A549细胞的增殖、侵袭、迁移能力;(2)抑肺饮含药血清能够上调上皮细胞标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达水平,下调间质细胞标志物波形蛋白(Vimentin)的表达水平,抑制NF-κB p65磷酸化水平和NF-κB启动子活性;(3)体内研究结果显示,抑肺饮高剂量组的瘤质量和肺转移率,瘤组织中NF-κB p65磷酸化表达水平,靶基因Bcl-xL、CyclinD1的mRNA表达水平显著低于模型组,且抑肺饮联合顺铂使用时抑制效果最佳。【结论】抑肺饮可能通过干预TNF-α-NF-κB信号通路,调节细胞EMT,从而发挥抑制肺癌细胞增殖和转移的作用。     

microRNA-149在顺铂耐药非小细胞肺癌细胞中的表达变化及相关机制研究

目的探讨microRNA-149(miR-149)在顺铂耐药A549细胞(A549/DDP)中的表达规律及作用机制。方法生物信息学方法分析顺铂耐药A549细胞中的microRNA表达变化。体外培养A549细胞并诱导对顺铂耐药的A549/DDP细胞系,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-149在两种细胞系中的表达差异。CCK-8试验及流式细胞术检测单纯miR-149过表达以及miR-149和ABCC1同时过表达对细胞顺铂敏感性的影响。qRT-PCR及Western blot检测A549及A549/DDP细胞中ABCC1的表达差异,双荧光素酶报告试验检测miR-149以ABCC1之间的靶向关系,并利用qRT-PCR及Western blot加以证实。结果 A549/DDP细胞中的miR-149表达较低,与A549细胞相比,差异具有统计学意义(t=-4.65,P0.05)。miR-149过表达可以降低顺铂处理后A549/DDP细胞的活力但增加其凋亡率,与阴性转染对照细胞相比,差异具有统计学意义(P均0.05)。与A549细胞相比ABCC1在A549/DDP细胞中存在mRNA及蛋白水平的高表达,差异具有统计学意义(t=8.44、5.14,P均0.05)。过表达miR-149可以降低A549/DDP细胞中ABCC1的mRNA及蛋白水平,与阴性转染对照细胞相比,差异具有统计学意义(t=-3.14、-4.54,P0.05)。双荧光报告酶分析显示miR-149可直接与ABCC1 mRNA的3’UTR结合。miR-149与ABCC1同时过表达的A549/DDP细胞与单纯miR-149过表达的细胞相比,顺铂处理后细胞活力增加,凋亡减少,差异具有统计学意义(P均0.05)。结论 miR-149表达不足可能引起A549细胞对顺铂的耐药,该机制与miR-149对ABCC1的抑制作用有关。     

纳米氧化锌对人呼吸道上皮细胞白细胞介素-8表达的影响

目的:探讨纳米氧化锌对人支气管上皮细胞(BEAS-2B)及肺泡上皮细胞(A549)内炎症相关因子白细胞介素-8(IL-8)表达的影响.方法:以BEAS-2B及A549细胞作为靶细胞,应用荧光定量PCR技术及ELISA法检测分析不同剂量纳米氧化锌(0、1、2和4μg/cm2)对细胞内IL-8 mRNA和蛋白表达的影响.结果:纳米氧化锌作用2、4 h,BEAS-2B细胞中IL-8 mRNA及蛋白的表达随纳米氧化锌作用剂量的升高而升高(mRNA:F分别为31.985、54.648,P均＜0.001;蛋白:F分别为128.686、65.486,P均＜0.001);A549细胞中IL-8 mRNA及蛋白的表达亦随纳米氧化锌作用剂量的升高而升高(mRNA:F分别为37.652、9.173,P均＜0.01;蛋白:F分别为l27.299、76.354,P均＜0.001).结论:纳米氧化锌可提高人支气管和肺泡上皮细胞内IL-8 mRNA及蛋白的表达水平.     

S100A8启动子的克隆及转录活性检测

目的 构建小鼠S100A8基因启动子序列的报告基因载体,通过报告基因技术检测在静息、脂多糖(LPS)、PolyI:C及NaASO2等刺激下该段启动子的转录活性.方法 采用PCR从小鼠脾组织基因组DNA扩增S100A8启动子序列(-826～+468);将其克隆至pDsRed1-1载体上,重组质粒经过PCR、酶切及测序分析正确无误后转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,荧光显微镜下观察静息、LPS、PolyI:C和NaASO2刺激下红色荧光蛋白表达.结果 正确扩增出小鼠S100A8启动子片段(-826～+468);成功构建其红色荧光蛋白报告基因载体,证实该质粒转染RAW 264.7细胞后静息状态下仅可见少量而微弱的红色荧光,经LPS、PolyI:C和NaASO2刺激后,红色荧光强度和亮度明显增加.结论 小鼠S100A8启动子(-826～+468)在静息状态下即具有转录活性,炎性、氧化应激刺激后S100A8表达增强;该启动子的成功克隆和其报告基因载体的构建,为进一步研究S100A8的基因表达调控机制打下了良好的基础.     

结核杆菌耐热抗原对A549细胞分泌SP-B和凋亡的影响

目的 探讨结核杆菌耐热抗原(Mtb-HAg)刺激诱导人肺腺癌细胞系(A549)细胞后对其肺泡表面活性物质相关蛋白B(SP-B)的分泌和凋亡的影响.方法 用不同浓度的Mtb-HAg分别刺激诱导A549细胞,相同条件分别培养24、48 h,同时设置空白对照组(对照组1和对照组2)和阳性对照组[脂多糖(LPS)组和姜黄素组].运用ELISA法检测对照组1、LPS组和实验组1(2、3μg/ml Mtb-HAg分别诱导A549细胞培养24 h和48 h)培养上清液中的SP-B表达量;使用实时荧光定量PCR法检测对照组1、LPS组和实验组1中基因SFTPB的相对表达量;采用流式细胞技术检测对照组2、姜黄素组和实验组2(2、3 μg/ml Mtb-HAg分别诱导A549细胞培养24 h)中A549细胞的凋亡率.结果 刺激诱导相同时间,实验组1的SP-B表达量低于对照组1,差异有统计学意义(P ＜0.05);相同浓度刺激诱导随时间的延长,实验组1中SP-B表达量降低的不显著.相同培养时间,随着Mtb-HAg浓度的增加实验组1表达SP-B的基因SFTPB的相对表达量显著低于对照组1,差异有统计学意义(P＜0.05);而在相同有效刺激浓度下,其相对表达量随作用时间变化不显著.姜黄素组和实验组2中的A549细胞凋亡率显著高于对照组2(P ＜0.05).结论 Mtb-HAg对A549细胞表达SP-B的抑制作用明显,并能诱导A549细胞发生凋亡.     

熊果酸对脂多糖作用下肺上皮细胞炎症因子表达的影响及机制研究

目的:熊果酸(ursolic acid,UA)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用下人肺上皮细胞来源的A549细胞的生物学活性影响及潜在机制.方法:CCK-8检测不同浓度(10、50、100、150、200 μg/mL)UA对A549细胞增殖的影响.此外,检测浓度为10 μg/mL的UA作用于A549细胞不同时间点对细胞的增殖影响.荧光定量PCR检测UA对LPS作用下A549细胞的白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的mRNA表达.ELISA检测ERK、p38、JNK抑制剂对UA对LPS作用下A549细胞的IL-1β表达的影响,结果采用单因素方差分析.结果:UA能够显著抑制A549细胞的活性且呈浓度依赖性.CCK-8检测结果显示,UA作用A549细胞24h后,10 μg/mL的UA能够明显抑制A549细胞的活性(P＜0.05).此外,UA能够明显抑制LPS诱导的TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达(P＜0.05).其中,对LPS诱导的IL-1β抑制作用最为明显.ELISA结果显示,ERK、JNK信号通路抑制剂作用下并不能影响UA抑制炎症的效果,但p38信号通路抑制剂能显著逆转UA对LPS诱导的IL-1β的抑制作用(P＜0.05).p38信号通路的激活剂却可以逆转这种抑制作用(P＜0.05).结论:UA能够抑制LPS诱导的IL-1β,且通过p38信号通路作用.     

siRNAi沉默DNMT1基因对肺癌细胞WIF-1启动子甲基化的影响

目的 探讨DNA甲基转移酶(DNMT1)siRNAi对人肺癌A549细胞内抑癌基因wnt抑制因子-1(WIF-1)基因启动子高甲基化的影响.方法 利用pSilencer 4.1-CMV neo载体,通过siRNAi表达载体法制备DNMT1 siRNAi.将DNMT1 siRNAi转染肺癌A549细胞,采用RT-PCR和Western blot检测观察转染前后肺癌A549细胞DNMT1内DNMT1基因的表达改变,并利用甲基化PCR,直接测序法检测WIF-1基因启动子甲基化水平.结果 构建的DNMT1 siRNAi转染肺癌A549细胞后,明显抑制DNMT1基因的表达,mRNA表达下降75%,蛋白表达下调82%;同时,WIF-1基因启动子序列较转染前甲基化水平明显降低.结论 靶向DNMT1的siRNAi可明显下调靶基因DNMT1的表达,并逆转WIF-1基因启动子高甲基化水平.     

组蛋白赖氨酸甲基转移酶Setd7促进Ngn1基因的表达

目的 构建小鼠组蛋白赖氨酸甲基转移酶Setd7真核表达载体并初步探讨其对神经细胞分化的影响.方法 采用基因工程技术,克隆小鼠Setd7基因并将其插入真核表达载体pCMV-3tag-6中,之后转染HEK 293T细胞,Western blot验证其表达;利用实时荧光定量PCR技术检测在神经分化模型(全反式维甲酸诱导P19神经分化)中,Setd7对神经分化关键基因Ngn1的调控;利用双荧光素酶报告系统检测Setd7对Ngn1启动子活性的影响;构建小鼠Setd7 siRNA干扰质粒,利用实时荧光定量PCR技术检测其抑制效果以及对 Ngn1 mRNA表达的影响.结果 成功构建了小鼠Setd7基因的真核表达载体,可在HEK 293T细胞中有效表达;Setd7可促进Ngn1 mRNA表达;Setd7能够促进Ngn1启动子活性; 降低Setd7抑制Ngn1 mRNA 表达.结论 组蛋白赖氨酸甲基转移酶Setd7能够促进神经分化关键基因Ngn1的转录.     

AP-2α对人肺腺癌细胞COX-2表达的作用研究

目的探讨核转录因子激活蛋白2α（AP-2α）对A549细胞环氧合酶2（COX-2）表达的作用。方法将AP-2仅腺病毒载体转染入A549细胞，观察AP-2仅对A549细胞COX-2表达及白介素1β（IL-1β）诱导A549细胞COX-2表达的影响。将AP-2突变质粒载体转染入A549细胞，观察AP-2突变体对IL-1β诱导A549细胞COX-2表达的影响。用Western印迹检测COX-2蛋白的表达。结果AP-2仅增加A549细胞COX-2表达及IL一1β诱导的A549细胞COX-2表达。AP-2突变体降低IL-1β诱导的A549细胞COX-2表达。结论AP-2仅上调A549细胞COX-2的表达。