IRS-PCR在分析不动杆菌DNA异质性中的应用

目的采用低频限制性位点聚合酶链反应技术（IRS-PCR）,对20株临床分离的不动杆菌DNA进行异质性分析。方法通过PCR扩增稀有限制区附近DNA序列,对20株临床分离的不动杆菌进行基因分型,并与RAPD方法的分型及生化表型结果进行比较分析。结果20株不动杆菌因生化性状不同分为溶血不动杆菌（10株）,洛菲不动杆菌（7株）及其他（3株）;IRS-PCR将该溶血不动杆菌分为5个基因型,洛菲不动杆菌分为4个基因型,其他不动杆菌分为2个基因型;RAPD方法,引物1扩增结果将溶血不动杆菌分为6个基因型,洛菲不动杆菌分为4个基因型,其他不动杆菌分为2个基因型;引物2扩增结果将溶血不动杆菌分为9个基因型,洛菲不动杆菌分为5个基因型,其他不动杆菌分为2个基因型。结论IRS-PCR可用于不动杆菌DNA异质性的分析,且较生化表型精细、准确,与RAPD技术比较两者分辨率相当,但IRS-PCR具有较好的稳定性和重复性,值得临床推广。     

IRS-PCR对重症监护病房患者标本分离鲍曼不动杆菌的分型研究

目的运用稀有限制区多聚酶链式反应(infrequent-restriction-site polymerase chain reaction,IRS-PCR)对鲍曼不动杆菌进行基因分型.方法通过PCR扩增稀有限制区旁的DNA序列,对15株鲍曼不动杆菌进行分型,并与药敏结果和生物学分型进行比较.结果用IRS-PCR方法将鲍曼不动杆菌分为5种基因型,生物学分型有3种,抗生素表型有4种.结论IRS-PCR分型方法敏感性强,分辨力高,重复性好,易操作,值得推广.     

非鲍曼的不动杆菌的临床分布特征及耐药机制分析

目的 分析临床分离的非鲍曼不动杆菌的临床分布特征及药敏情况;检测其金属β-内酰胺酶和整合酶基因。 方法 用K-B法对安徽省2家教学医院病房及门诊收集的各种标本分离出的非鲍曼不动杆菌进行药物敏感试验,按CLSI 2016版判断结果。用聚合酶链式反应(PCR)对其进行扩增金属β-内酰胺酶基因及Ⅰ~Ⅲ类整合子的整合酶基因,分析结果。 结果 44株非鲍曼不动杆菌(洛菲不动杆菌29株、琼氏不动杆菌9株、醋酸钙不动杆菌3株、溶血不动杆菌2株及不动杆菌基因型13TU 1株),来源于心内科、呼吸内科等临床科室,分离于痰液、尿液、分泌物及其他标本。其中3株为多药耐药菌株(2株洛菲不动杆菌及1株溶血不动杆菌),17株仅对β-内酰胺类抗生素耐药,余24株为完全敏感菌株。金属β-内酰胺酶SIM-1阳性率为20.45%(7株洛菲不动杆菌、2株琼氏不动杆菌);VIM-2阳性率为9.09%(2株洛菲不动杆菌、1株溶血不动杆菌及1株琼氏不动杆菌);IMP-4、NDM-1均未检测出。IntI-1阳性率为11.36%(3株洛菲不动杆菌、1株溶血不动杆菌及1株琼氏不动杆菌);IntI-2阳性率为13.64%(3株洛菲不动杆菌、1株溶血不动杆菌及2株琼氏不动杆菌);IntI-3未检测出。 结论 非鲍曼不动杆菌的耐药率相对较低,但已经发现多药耐药菌株;其耐药机制可能与金属β-内酰胺酶及整合酶有关。      

ICU机械通气性鲍曼氏不动杆菌感染的同源性分析

目的:了解鲍曼氏不动杆菌引起机械通气性肺炎主要克隆株及流行状况。方法:运用随机引物扩增PCR(RAPD)技术对32株鲍曼氏不动杆菌进行指纹图谱与聚类分析。结果:32株鲍曼氏不动杆菌经RAPD分为5个基因型,Ⅰ至Ⅴ型分别占16株、1株、2株、4株和9株。结论:鲍曼氏不动杆菌在医院内存在克隆传播,Ⅰ型与Ⅴ型鲍曼氏不动杆菌是我院ICU病房机械通气性肺炎的主要基因型,临床应加强对这2型鲍曼氏不动杆菌的监控,以防止院内感染与爆发流行。     

多重耐药鲍曼不动杆菌的基因分型及感染治疗分析

目的:建立鲍曼不动杆菌随机扩增DNA多态性(RAPD)分型方法,用于鉴定临床分离菌株,了解其流行病学特点,总结治疗经验.方法:从某外科普通病房分离出13株鲍曼不动杆菌,进行抗生素敏感性实验的同时对其中10株菌株提取DNA后进行RAPD分型,结合临床抗菌药物治疗效果进行分析.结果:抗生素敏感实验结果表明13株鲍曼不动杆菌均为仅对泰能、倍能等少数抗生素敏感的多重耐药菌株.其中10株进行RAPD基因分型的菌株可分为3种类型,其中8株为A型,1株为B型,1株为C型.结论:RAPD分型方法分型率高、简便、快速.应加强普通病房的消毒隔离措施,防止交叉感染.     

HAP鲍曼不动杆菌耐药谱型与IRS-PCR基因型关联性研究

目的:探讨医院获得性肺炎(HAP)鲍曼不动杆菌耐药谱型、DNA基因型及两者关联性。方法:收集HAP患者痰液培养病原菌,分离鲍曼不动杆菌,根据此菌对7种抗生素耐药特征进行耐药谱分型;建立标准IRS-PCR体系,对鲍曼不动杆菌DNA进行基因分型;对照分析耐药谱型和基因型之间的对应关系。结果:本组176例,分离鲍曼不动杆菌21株,根据其对氨苄西林、头孢噻肟、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、阿米卡星和左氧氟沙星7种抗生素多重耐药情况分为Ⅰ～Ⅹ10个耐药谱型;根据IRS-PCR分为A、B、C、D4个DNA基因型;关联性研究显示A型与Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型有关,B型与Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ型有关,C型与Ⅶ、Ⅸ型有关,D型与Ⅵ、Ⅷ、Ⅹ型有关。结论:鲍曼不动杆菌多重耐药谱型与DNA基因型具有较高的关联性。     

Application of REP-PCR in genotyping of Candida glabrata

目的 评估重复序列PCR (REP-PCR)技术在光滑假丝酵母菌基因分型中的作用.方法 收集深部真菌感染患者体内分离的光滑假丝酵母菌34株,以API 20C AUX酵母菌鉴定板条鉴定菌种及生化表型.采用REP-PCR对34株光滑假丝酵母菌进行基因分型:提取真菌基因组DNA,以Care-2重复元件设计引物,PCR扩增产物电泳后运用NTSYS软件进行聚类分析,聚类树状图相似系数(SI)≥97％且无明显条带差异定为同一基因型,SI≥97％且仅相差一条条带定为亚型.比较REP-PCR分型与多位点序列分型(MLST)的辨别力指数(DP),分析具有不同生化表型光滑假丝酵母菌的REP-PCR基因分型情况.结果 REP-PCR基因分型结果显示:34株光滑假丝酵母菌分为17个基因型,其中A型8株,B型6株,C、D型各3株,E型2株,F～Q型各1株,未发现亚型.REP-PCR和MLST基因分型的DP (95％ CI)分别为0.911(0.770～0.980)和0.369(0.220～0.560),两者比较差异有统计学意义(x2 =21.68,P＜0.01).34株光滑假丝酵母菌有两种生化表型,生化表型代码分别为2000040(32株)和6000040(2株),生化表型代码为60000402的2株经REP-PCR分型结果分别为D型和K型(SI =0.43).结论 REP-PCR对光滑假丝酵母菌基因分型的辨别力较强且操作简便,适用于临床实验室对光滑假丝酵母菌的流行病学研究.     

鲍曼不动杆菌基因同源性研究

目的分析鲍曼不动杆菌的基因同源性,并对其进行分子分型。方法采用重复序列聚合酶链反应技术（rep—PCR）,分别以基因外重复回文序列（REP）和肠杆菌基因间重复一致序列（ERIC）为引物,对122株鲍曼不动杆菌基因组DNA进行扩增并分型。结果REP—PCR将鲍曼不动杆菌分为14种基因型（A～N）。其中H型含98株,为主要的流行型别,并可分为6个亚型;ERIC—PCR将菌株分为13种基因型（A’～M’）,其中L’型100株,为主要的流行型别,并可分为5个亚型。其余菌株在其他基因型中均为零星分布。结论在鲍曼不动杆菌基因同源性分析中,REP—PCR的分辨率较ERIC—PCR高;同时表明我院存在着某一基因型鲍曼不动杆菌的感染流行,估计该型菌株可能以克隆株的形式播散。     

鲍曼不动杆菌的同源性及碳青霉烯酶基因分析

目的:研究临床分离鲍曼不动杆菌的耐药性演变、同源性、产碳青霉烯酶类型及碳青霉烯酶基因型.方法:收集临床分离的72株鲍曼不动杆菌,采用VITEK-Ⅱ药敏分析系统对72株鲍曼不动杆菌进行18种抗菌药物的敏感性检测.采用肠杆菌科基因间一致重复序列聚合酶链技术(ERIC-PCR)进行基因分型和同源性比对.用改良Hodge试验检测杆菌的产碳青霉烯酶表型,对碳青霉烯酶基因blaOXA-23,blaOXA-40和blaOXA-58进行PCR扩增及序列分析.结果:72株鲍曼不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦的耐药率最低,为8.33％,其次是阿米卡星,对其余抗菌药物的耐药率均高达70％以上.ERIC-PCR技术将其分为7个基因型,同源性分析显示其中4个基因型在医院内流行.产碳青霉烯酶的菌株有56株,blaOXA-23扩增阳性的有61株,blaOXA-58扩增阳性的有1株.结论:鲍曼不动杆菌耐药严重,且存在院内感染传播的现象;产碳青霉烯酶的菌株较多,主要的碳青霉烯酶基因型为blaOXA-23;湖南省存在blaOXA-58阳性鲍曼不动杆菌株.     

1716株不动杆菌的鉴定及药敏分析

目的 研究不动杆菌分布特点及对常用抗生素的药敏分析，指导临床合理用药。方法 用MicroSean Walk—Away—40全自动微生物鉴定和药敏系统对1716株临床分离不动杆菌进行鉴定和药敏试验。结果 1716株不动杆菌，鲍曼不动杆菌占79．2％，洛菲不动杆菌占17．5％，醋酸钙不动杆菌占2．1％，溶血不动杆菌占1、2％。标本来源以痰标本为主，其次为伤口分泌物和尿。临床分布主要是ICU、呼吸内科、老年科、胸心外科、血液内科、神经内科和管科。1359株鲍曼不动杆菌除对亚胺培南敏感率低外，对其他多种杭生素耐药率较高；而301株洛菲不动杆菌的耐药率较低。结论 临床不动杆菌分离以痰标本为主，菌种组成以鲍曼不动杆菌为主，菌株的耐药性与菌种有关，鲍曼不动杆菌呈现多重耐药，而洛菲不动杆菌则较为敏感。     

重复片段引物PCR用于鲍曼不动杆菌分型研究

目的 运用重复片段引物PCR的分析方法对鲍曼不动杆菌进行分子分型研究。方法 选用肠杆菌科基因间的重复序列（ERIC）为引物进行PCR扩增，对22株鲍曼不动杆菌进行分型研究，并与生物学分型及抗生素耐药结果进行比较。结果 经重复片段引物PCR的方法，分离出6种不同基因型的鲍曼不动杆菌，而生物学分型只有2种，且与抗生素谱较为相关。该方法简便易行，且重复性好，适合于医院感染流行病学研究。     

DNA amplification fingerprinting (DAF) applied to the investigation ofAcinetobacter baumanii isolated from intensive care unit patients

Acinetobacter are important emerging nosocomial pathogens. In this paper thirteenAcinetobacter baumanii from intensive care patients were isolated. These were initially typed using the API-20 NE biotyping system and antibiogram analysis. Results obtained using these methods failed to convincingly characterise the organisms. In this report a method to characterise theseAcinetobacter baumanii isolates is described, which utilises a modified polymerase chain reaction (PCR), capable of generating genomic fingerprints, known as DNA amplification fingerprinting (DAF). Purified chromosomal DNA of cultured clinical isolates ofAcinetobacter baumanii were subjected to DAF using the M13 universal sequencing primer. Polymorphic DNA bands produced, were visualised after agarose gel electrophoresis and ethiduim bromide staining. Results demonstrated that six of the thirteen clinical isolates represented one group and a second group of two isolates displayed identical fingerprint patterns. The remaining four organisms were all unique. This genotype based method is rapid, simple, reproducible and may have potential as a means of specifically typingAcinetobacter spp. allowing the route(s) of nosocomial transmission to be identified and to assess the efficiency of instituted infection control measures.     

鲍曼不动杆菌耐药基因的克隆与特征

目的对临床分离鲍曼不动杆菌进行耐药基因克隆。方法利用已知Acinetobacter sp.ADP1全序列设计引物,通过PCR扩增,进行耐药基因的克隆;对重组菌株进行药敏分析。结果克隆出一个耐药基因,该基因编码的蛋白对氯霉素、四环素和链霉素等抗生素及溴化乙锭、罗丹明6G、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠等抗菌剂具有很强耐药性。结论克隆到的耐药基因为一多重耐药基因。     

ICU病区泛耐药的鲍曼不动杆菌碳青霉烯类药物耐药基因分析

目的研究ICU区病区分离的泛耐药(pandrug-resistant,PDR)鲍曼不动杆菌的耐药机制,检测菌株所含的主要基因型别及其流行情况,指导临床合理用药。方法收集2009～2010年两年分离自ICU病区的PDR鲍曼不动杆菌20株,用浓度梯度法(E-试条法)检测15种抗菌药物的耐药率,用PCR法检测blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51、blaOXA-58、blaVIM、blaNDM-1和blaIMP 7种基因型别。结果 20株PDR鲍曼不动杆菌,对常规的14种抗菌药物耐药率阿米卡星55%,米诺环素70%,复方新诺明80%,其他药物均100%;对多黏菌素B的耐药率为0;PCR检测结果显示,检测到3种耐药基因,blaOXA-23、blaVIM和blaIMP;其中14株细菌blaOXA-23阳性,2株blaVIM阳性,1株blaIMP阳性,总阳性率85.5%。结论 PDR-AB对绝大多数常规药物均有较高的耐药性,其耐药机制复杂,对碳青霉烯类耐药的耐药基因主要为blaOXA-23,亟待我们积极深入地探索研究。     

LAMP与FQ—PCR技术检测HBVDNA的特异性和灵敏度比较

目的 采用环介导等温扩增反应（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术与实时荧光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR）技术检测 HBV DNA,并对 LAMP 方法的反应条件进行优化,比较两种方法检测 HBV DNA 的灵敏度及特异性。方法 选取经医院确诊的乙肝患者的血清,提取血清中的 HBV DNA 作为扩增模板,同时,对 LAMP 方法的各种条件进行优化,并分别采用 LAMP 和 FQ-PCR 两种方法对同一 HBV DNA 模板做 10 倍梯度稀释的标本进行 HBV DNA 的检测,比较其灵敏度;且分别用两种方法对乳头瘤病毒（HPV）、EB 病毒、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及正常人血清基因组 DNA 在相同条件下进行实验,观察两种方法在检测中是否出现假阳性结果,以确定两种方法的特异性。结果 对同一 HBV DNA 模板进行 10 倍梯度稀释后,FQ-PCR 技术在待测血清标本（2.38×107copy/ml）被稀释到 10-5,就难以进行准确检测了,而 LAMP 方法在待测血清标本被稀释到 10-7时,仍然能够获得较好的扩增结果;对 HPV、EB 病毒、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及正常人血清基因组 DNA 进行 LAMP 和 FQ-PCR 检测,结果均为阴性。结论 采用 LAMP方法可以成功、快速、高效、特异的扩增 HBV DNA,与 FQ-PCR 方法比较,都能特异地检测 HBV DNA,但 LAMP 方法具有更高的灵敏性,操作更为简单、方便,而且不需要昂贵的仪器,更适合基层检测机构的推广使用。     

布鲁氏菌分型研究进展

布鲁氏菌是严重危害人畜健康的病原菌之一,其分型技术主要有生物分型、脂肪酸分型和基因分型等.前者是传统的分型法,得到广泛应用,后二者是近年来研究的重点.其中,基因分型法作为布鲁氏菌溯源的主要方法,目前以多位点可变数量串联重复序列分型(MLVA)受到国内外的普遍关注,其他基因分型技术如Rep-PCR分型、扩增片段长度多态性分型(AFLP)、随机扩增多态性分型、染色体DNA的酶切脉冲场凝胶电泳法(PFGE)、核酸探针及多位点序列分型(MLST)也得到应用,本文综述了布鲁氏菌分型的研究进展.     

碳青霉烯酶OXA 72在毕赤酵母中的表达和纯化

目的对我国临床分离的第一株鲍曼不动杆菌产生的碳青霉烯酶OXA 72在毕赤酵母表达系统中进行重组表达及分离纯化。方法提取临床分离的鲍曼不动杆菌菌株40的基因组DNA,PCR扩增oxa 72全基因;将oxa 72基因双酶切回收后与毕赤酵母表达载体连接,重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定;电转化法将线性化的重组表达DNA转导入GS115感受态细胞,在Zeocin平板上筛选阳性转化子,并通过PCR和Western进行验证;对阳性克隆进行头孢硝噻吩实验,检测表达OXA 72的活性。用镍柱分离纯化OXA 72。结果以该株鲍曼不动杆菌的基因组DNA为模板,用目的引物进行PCR可获得843?bp的特异扩增条带;DNA测序证明核苷酸序列与Genbank公布的oxa 72基因序列100%一致;电转化后经Zeocin平板筛选得到一株阳性克隆,SDS PAGE表明重组蛋白的相对分子量在34～43?kDa之间,Westem blot分析显示,重组蛋白能特异地与抗His Tag抗体结合。头孢硝噻吩试验为阳性。纯化得到纯度为95%的重组蛋白,纯化回收率达40%。结论成功构建了OXA 72的表达载体,在毕赤酵母中成功地表达并分离纯化了具有酶活性的OXA 72。     

鲍曼不动杆菌生物被膜形成能力与基因型关系的研究

目的 研究鲍曼不动杆菌生物被膜形成能力与基因型的关系.方法 采用组织平板法对42株鲍曼不动杆菌临床分离株的生物被膜形成能力进行半定量检测,并以肠杆菌基因间重复序列为引物的聚合酶链反应(enter-obacterial repetitive consensus PCR,ERIC-PCR)技术对其进行基因分型.结果 42株...