癌胚抗原单链抗体—链亲和素融合蛋白的功能鉴定

目的：用ｐＥＴ２１原核表达系统表达癌胚抗原单链抗体－链亲和素融合蛋白。方法：融合表达载体转化大肠杆菌菌株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）,用１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导表达,表达产物行亲和印迹及免疫斑点分析。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明,融合蛋白分子质量约５７ｋｕ,亲和印迹及免疫斑点证实融合蛋白具有结合ＣＥＡ与生物素的双特异性。结论：原核表达系统可以表达具有双特异性的融合蛋白,该融合蛋白利用生物素标记的辣根过     

单链抗体及重组白介素-2双功能抗体融合蛋白的表达及其软件预测

目的利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质,并探讨分泌型抗成骨肉瘤单链双功能抗体基因的表达。方法采用聚合酶链式反应(PCR)将人工合成的抗体分泌信号肽序列加在抗成骨肉瘤单链抗体(scFv)基因5′端,其3′与白介素-2(IL-2)基因连接构成分泌型单链双功能抗体scFv-IL-2基因,将该基因克隆至逆转录病毒表达载体PLxSN,重组质粒pL(scFv-IL-2)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人成骨肉瘤细胞命名为OSC/scFv-IL-2,以PCR,RT-PCR以及Western blotting对scFv-IL-2基因修饰的OSC9901细胞进行鉴定。在构建融合蛋白之后,运用DNA分析软件DNAs-sist和蛋白质分析软件ANTHEPROTV5分析融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质。结果经酶切、PCR及Western blotting分析鉴定,成功地构建了融合基因表达载体pL(scFv-IL-2)SN,并获得高滴度产毒细胞株C26,scFv-IL-2融合蛋白通过DNAssist和ANTHEPROTV5软件分析获得了融合蛋白的二级结构及其理化性质。结论利用生物信息学网络资源进行分析预测融合蛋白的性质,为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据。     

单链抗体融合蛋白抗肿瘤的研究进展

单链抗体融合蛋白是一种通过重组质粒将单链抗体与蛋白质融合构建的新型蛋白,具有保持抗原抗体结合的稳定性和外部蛋白质生物活性功能,主要通过大肠杆菌与酵母两个表达系统进行表达.单链抗体融合蛋白的抗肿瘤机制包括阻滞肿瘤细胞周期、靶向杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、增强机体免疫应答等,现已主要应用于靶向治疗、影像诊...     

尘肺病噬菌体单链抗体库的构建及鉴定

目的:构建具有良好多样性的人尘肺病噬菌体单链抗体( ScFv)库.方法:收集25例尘肺病患者外周血标本共50 mL,密度梯度离心法分离淋巴细胞,Trizol法提取总RNA,逆转录后参考文献设计并合成半巢式PCR引物,扩增抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,Linker连接VH和VL,继而连接到噬菌体载体pCANT...     

ScFv及重组TNF-α双功能抗体融合蛋白的表达及其软件预测

目的:利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质,以及探讨分泌型抗成骨肉瘤单链双功能抗体基因的表达.方法:采用PCR方法将人工合成的抗体分泌信号肽序列加在抗成骨肉瘤ScFv基因5'端,其3'与人的肿瘤坏死因子TNF-α基因连接构成分泌型单链双功能抗体ScFv-TNF-α基因,将该基因克隆至逆转录病毒表达载体PLxSN,重组质粒pL(ScFv-TNF-α)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人成骨肉瘤细胞命名为OSC/ScFv-TNF-α, 以PCR, RT-PCR以及Western Blot对ScFv-TNF-α基因修饰的OSC9901细胞进行鉴定. 在构建融合蛋白之后,运用DNA分析软件(DNAssist)和蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)分析融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质.结果:经酶切分析鉴定,成功地构建了融合基因表达载体pL(ScFv-TNF-α)SN,以及Western Blot分析证明ScFv-TNF-α基因融合蛋白的表达. 运用DNAssist核酸序列分析软件分析ScFv-TNF-αDNA序列翻译并获得了氨基酸序列,运用蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)分析融合蛋白的二级结构及其理化性质.结论:利用生物信息学网络资源进行分析预测融合蛋白的性质,为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据.     

鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对分子质量单链尿激酶融合基因真核分泌表达载体的构建

目的 构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低相对单链尿激酶融合基因真核分泌表达载体。方法 应用重组ＤＮＡ技 术,将人工合成的尿激酶原信号肽基因与鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低相对分子质量单链尿激酶融合基因连接,并保 证在同一阅读框架,然后分别插科到pcＤＮＡ３和ＰＭＪＫ３两种真核表达载体中。结果构建成可以在真核细胞中分泌表 达鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低相对分子质量单链尿激酶融合蛋白的重组质粒pcＤＮＡ３－Ｄ１和ｐＭＪＫ３－Ｄ１。结论为建 立稳定分泌表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低相对分子质量单链尿激酶融合蛋白的细胞工程株奠定了基础。     

IN-1重组单链抗体表达载体的构建与融合表达

目的：设计并人工合成IN-1重组单链抗体（recombinant IN-1 single-chain antibody）的cDNA克隆，构建其表达载体，在原核系统中实现初步表达。方法：根据gene bank中发表的IN-1抗体的轻链重链序列，重新设计适于在大肠杆菌中表达的基因片段，该基因双链分35个小片段合成，经退火、复性连接成目的片段后，克隆到克隆载体pUC-18中，经全自动序列分析仪测序证实后，再亚克隆至表达载体pET-28a（ ），转化大肠杆菌BL21，诱导表达。结果：测序结果合成的基因序列与设计的仅差一个碱基；SDS-PAGE检测显示，表达出相对分子量31kd的融合蛋白。结论：IN-1重组单链抗体基因表达载体的构建和表达，为深入研究其生物活性奠定了基础。     

去唾液酸糖蛋白受体单链抗体与绿色荧光蛋白的融合表达及其靶向性观察

目的：表达和纯化去唾液酸糖蛋白受体单链抗体C1与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白．体外观察其肝癌细胞的特异性结合能力。方法：通过扩增构建成含C1与绿色荧光蛋白（GFP）融合基因的原核表达质粒GFPCI／pET-26b：测序验证后转化大肠杆菌BL21后以IPTG诱导表达，荧光显微镜下观察融合基因中GFP的表达情况：用Ni^2＋螯合柱亲和纯化融合蛋白GFPCI，SDS-PAGE检测融合基因的表达和纯化的融合蛋白GFPCI；纯化的融合蛋白GFPCI与HepG2细胞经体外孵育后在荧光显微镜下观察单链抗体Cl对肝癌细胞的靶向作用。结果：IPTG诱导表达后在荧光昆微镜下可以观察到大肠杆菌发出特异性的绿色荧光；SDS-PAGE显示表达的融合蛋白GFPCI，与预期的大小相一致，以包涵体的形式存在；通过变性条件下Ni^2＋亲和柱纯化获得较GFPCI重组融合蛋白，免疫荧光检测表明纯化的GFPCI可与HepG2细胞膜特异结合。结论：利用GFP作为标记分子．观察到去唾液酸糖蛋白受体单链抗体C1与HepG2细胞膜较强的结合能力．为应用Cl对肝癌进行靶向生物治疗奠定基础；构建成功的GFP／pET-26b原核表达系统为其他靶分子的研究提供了一个有力的工具。     

全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定

目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性?方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库?以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性?结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0 × 107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv?经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体?经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg?结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础?     

链霉亲和素-人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的制备与活性鉴定

目的:制备链霉亲和素(SA)连接的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)融合蛋白(SA-hGM-CSF),并对其生物学活性进行鉴定。方法:在NCBI数据库中查找SA和hGM-CSF序列,将序列合成后连接入Pet28表达载体中,构建SA-hGM-CSF-Pet28重组表达载体,在BL21(DE3)表达感受态中利用IPTG诱导剂诱导表达,经His镍柱纯化,尿素梯度复性,聚丙烯酰胺凝胶电泳法和蛋白质印迹法(WB)鉴定融合蛋白,通过TF-1细胞检测融合蛋白的生物学活性。结果:SA-hGM-CSF融合蛋白可在BL21(DE3)中高效诱导表达,经His镍柱纯化后该融合蛋白纯度较高。经尿素梯度复性后,细胞学实验验证该融合蛋白具有生物学活性。结论:成功表达具有生物活性的融合蛋白SA-hGM-CSF,该结果为SA-hGM-CSF表面锚定修饰的肿瘤细胞疫苗的研究提供了实验基础。     

抗前列腺癌/抗CD3双特异性单链抗体的构建及表达

目的 构建并表达抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体,观察其生物学活性及临床意义。方法 利用PCR方法及分子生物学基因克隆技术,构建抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体融合基因,测序正确后,利用EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,将融合基因亚克隆入真核表达载体进行表达,表达产物纯化后,利用流式细胞仪进行生物学活性测定。结果 经酶切、测序分析证实插入的基因片段大小为1．5kb,序列与设计完全一致;SDS-PAGE和Western印迹实验证明：表达产物分泌于细胞培养上清,相对分子质量为6l000;流式细胞仪结果显示：双特异性单链抗体与PBMC和PC-3细胞的阳性结合率分别为54．1％和53．7％。结论 抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体具有较好的生物学活性,为进一步的体内实验奠定了基础。     

抗前列腺特异抗原/抗CD3双特异性单链抗体四聚体的活性研究

目的:研究抗前列腺特异抗原(PSA)/抗CD3双特异性单链抗体四聚体的生物活性.方法:利用流式细胞仪和51Cr释放试验评价双特异性单链抗体四聚体的抗原亲和活性和体外介导杀伤靶细胞的效果. 利用裸鼠前列腺癌模型分析其在体内介导细胞毒T淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤的能力.结果:抗PSA/抗CD3双特异性单链抗体四聚体可以特异性结合表达前列腺癌细胞和CD3阳性的淋巴瘤细胞,阳性结合率分别为70.4%和81%. 在体外,有细胞毒T淋巴细胞存在时该四聚体可引起前列腺癌细胞的裂解,在抗体浓度固定组和效应细胞/靶细胞比例固定组,靶细胞裂解率分别随着效应细胞/靶细胞比例和抗体浓度的增加而增加,最高裂解率分别可以达到(80.3±5.2)%和(78.6±5.5)%. 与对照组比较,接种前列腺癌细胞的裸鼠在体内注射激活的细胞毒T淋巴细胞的同时接受该四聚体的治疗后,肿瘤生长明显受到抑制(P＜0.0001).结论:抗PSA/抗CD3双特异性单链抗体四聚体具有良好的生物学活性,具有体外杀伤肿瘤细胞和体内抑制肿瘤生长的作用.     

特异性抗肝癌单链抗体的表达及意义

目的优化表达条件，荻取有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体。方法以ITPG诱导大肠杆菌HB2151表达可溶性抗肝癌单链抗体；利用HiTrap Anti—E Tag素和层析拄对阳性克隆表达的单链抗体进行纯化；纯化后的单链抗体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，以Bradford检测法测定其浓度，ELISA法及免疫组化法鉴定其生物学活性；结果在培养基中加入0．4M蔗糖，以IPTG 1mmol／L于30℃诱导12h，抗肝癌scFv可溶性表达量较多，纯化后可溶性抗肝癌scFv含量为325μg／L。纯化的抗肝癌scFv与肝癌组织、肝癌细胞抗原特异性结合，与肝硬化、正常肝组织无阳性结合。结论成功获得具有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体，为肝癌靶向诊断及治疗的开发与应用奠定了基础。     

抗人卵巢癌COC183B2/抗CD3单链双特异抗体的构建和表达

目的:构建和表达一种可与卵巢癌细胞和淋巴细胞结合的双特异抗体.方法:利用PCR分别扩增抗人CD3单链抗体(single chain variable fragment, ScFv)重链可变区(variable region of the heavy chain, VH)和轻链可变区(variable region of the light chain, VL),重组抗人CD3 ScFv,经测序后将其克隆入有链间连接肽基因序列的载体pALM中,再将抗人卵巢癌COC183B2 ScFv克隆至紧邻链间连接肽前形成COC183B2/抗CD3单链双特异抗体(single-chain bispecific antibody, scBsAb)的重组.最后将COC183B2/抗CD3 scBsAb克隆入表达载体pTMFC中进行表达,同时分别表达抗人卵巢癌单抗COC183B2和抗人CD3单抗的ScFv作为对照组.用ELISA、流式细胞学方法和玫瑰花环实验对scBsAb进行免疫学活性测定.结果:成功构建抗人卵巢癌COC183B2/抗CD3 scBsAb;其表达的蛋白链相对分子质量约60;ELISA结果显示scBsAb可与抗原OC183B2结合,流式细胞学结果显示scBsAb可与抗原CD3结合,花环实验显示scBsAb在体外可引导效应细胞聚集在靶细胞周围.结论:构建和表达抗人卵巢癌COC183B2/抗CD3 scBsAb成功,且具有与抗原OC183B2、CD3结合的免疫学活性.     

分泌型单链双功能抗体分子间接头的设计及软件分析

目的:利用生物信息学软件分析分泌型抗骨肉瘤单链双功能抗体融合蛋白的二级结构及其理化性质.方法:构建融合蛋白时,先进行连接肽的设计,选用通用酶切位点序列,运用DNA分析软件(DNAssist)和蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)分析预测融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质.结果:在编码ScFv与TNF的碱基之间引入连接肽,通过酶切位点获得的DNA序列,运用DNAssist核酸序列软件获得了融合蛋白的二级结构,并运用蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)预测了融合蛋白的理化性质.结论:应该充分利用生物信息学软件分析生物学信息,并不断对软件本身进行改进,生物信息学软件可提高药物开发进程,可利用生物信息学和遗传学信息来寻找和开发以基因为基础的药物.     

抗血小板膜糖蛋白Ⅰbα/Ⅲa双特异单链抗体的构建及其功能研究

目的构建、表达抗血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰbα/GPⅢa双特异单链抗体,为其进一步研究、应用奠定基础.方法应用PCR技术,扩增出接头片段和SZ-21单链抗体基因,克隆入pUCm-T载体,测序分析.应用基因重组技术将接头片段、SZ-21单链抗体基因和SZ-2单链抗体基因重组拼接,构建SZ-2/SZ-21双特异单链抗体表达载体pET22-21-L-2scFv,并测序验证.导入大肠杆菌BL21(DE3)Plys,诱导表达.流式细胞术、ELISA、Western blot检测SZ-2/SZ-21双特异单链抗体与血小板结合能力,瑞斯托霉素、凝血酶和ADP诱导血小板聚集试验对表达产物功能进行研究.结果表达载体pET22-21-L-2scFv构建拼接正确;表达产物以包涵体形式为主,表达量占菌体总蛋白的14%;经变性、纯化、复性,表达产物具有与血小板以及血小板GPⅠbα和Ⅲa结合活性,可抑制瑞斯托霉素、凝血酶和ADP诱导的血小板聚集并呈剂量依赖性.结论成功表达了SZ-2/SZ-21双特异单链抗体,该抗体具有与相应2个靶抗原结合活性,并可抑制瑞斯托霉素、凝血酶和ADP诱导的血小板聚集.     

抗血小板膜糖蛋白Ⅰba／Ⅲa双特异单链抗体的构建及其功能研究

目的：构建、表达抗血小板膜糖蛋白（GP）Ibα/GPⅢa双特异单链抗体,为其进一步研究、应用奠定基础。方法：应用PCR技术,扩增出接头片段和SZ-21单链抗体基因,克隆入pUm-T载体,测序分析。应用基因重组技术将接头片段、SZ-21单链抗体基因和SZ-2单链抗体基因重组拼接,构建SZ-2/SZ-21双特异单链抗体表达载体pET22-21-L-2scFv,并测序验证。导入大肠杆菌BL21(DE3)Plys,诱导表达。流式细胞术、ELISA、Western印迹检测SZ-2/SZ-21双特异单链抗体与血小板结合能力,瑞斯托霉素、凝血酶和ASP诱导血小板聚集试验对表达产物功能进行研究。结果：表达载体pET22-21-L-2scFv构建拼接正确;表达产物以包涵体形式为主,表达量占菌体总蛋白的14％;表达产物具有与血小板以及血小板GP Ibα和Ⅲa结合的活性,可抑制瑞斯托霉素、凝血酶和ADP诱导的血小板聚集,此作用呈剂量依赖性。结论：成功表达了SZ-2/SZ-21双特异单链抗体,该抗体具有与相应2相靶抗原结合的活性,并可抑制瑞斯托霉素、凝血酶和ADP诱导的血小板聚集。