McAb共刺激PBLs介导肝癌细胞凋亡与CPP32基因表达的关系

1994年Teresa等克隆出人的CPP32(caspase-3)cDNA,并证实CPP32基因与细胞凋亡有密切关系[1];CD28和CD80 McAb共刺激PBLs作用于培养的肝癌细胞能引起肝癌细胞凋亡[2];为了探讨其机制,本文进行了相关的研究.     

McAb共刺激PBLs介导肝癌细胞凋亡

用ＭｃＡｂ，抗ＣＤ３，ＣＤ３＾＋ＣＤ２８和ＣＤ２８＾＋ＣＤ８０激活健康人ＰＢＬｓ，作用于肝癌细胞，透射电镜观察其超微结构，发现除抗ＣＤ３可引起部分淋巴细胞诱导性凋亡外，其他组都可介导肝癌细胞凋亡。     

McAb共激活T细胞介导肝癌细胞前后的膜分子与TCR Vβ基因的 …

Ｔ淋巴细胞活化是一个涉及多种膜表面分子和受体以及一系列相关多肽的复杂过程，为了使Ｔ细胞发挥更好的识别和杀伤癌细胞的功能，采用抗ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ２、ＣＤ５８ＭｃＡｂ分别刺激健康人ＰＢＬｓ后作用肝癌细胞，对作用前后ＰＢＬｓ用ＦＡＣＳ进行表型分析，结果发现：作用后ＣＤ３和ＣＤ８分子表达比作用前明显增高，而ＣＤ４分子无显著变化，同时基因家族采用ＲＴ－ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹     

McAb共激活T细胞介导肝癌细胞前后的膜分子与TCRVβ基因的表达

Ｔ淋巴细胞活化是一个涉及多种膜表面分子和受体以及一系列相关多肽的复杂过程，为了使Ｔ细胞发挥更好的识别和杀伤癌细胞的功能，采用抗ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８０（Ｂ７１）、ＣＤ２、ＣＤ５８ＭｃＡｂ分别刺激健康人ＰＢＬｓ后作用肝癌细胞，对作用前后ＰＢＬｓ用ＦＡＣＳ进行表型分析，结果发现：作用后ＣＤ３和ＣＤ８分子表达比作用前明显增高，而ＣＤ４分子无显著变化，同时基因家族采用ＲＴＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ印迹分析ＴＣＲＶβ基因１～２０亚家族表达水平与特征，健康人ＰＢＬｓ分别加入ＩＬ２、ＰＨＡ、抗ＣＤ３和ＣＤ３＋ＣＤ２８、ＣＤ２８＋ＣＤ８０、ＣＤ２＋ＣＤ５８作用肝癌细胞（ＢＥＬ７４０２）前表达水平平均约为５％，作用ＢＥＬ７４０２后表达水平约为１３％～２５％，其特征为Ｖβ７增高，这提示在癌抗原的参与下ＭｃＡｂ共刺激的Ｔ细胞活化，ＴＣＲ接受ＡＰＣ相应抗原的刺激，具有该ＴＣＲ的淋巴细胞迅速增殖而成为针对抗原的Ｔ细胞克隆，发挥其识别和杀伤癌细胞的作用，这将为肿瘤生物治疗的研究提供分子免疫学依据。     

共刺激分子与类风湿性关节炎患者T细胞的平衡失控

共刺激分子和凋亡受体CD95(Fas)分子的异常表达与T细胞的异常活化及其亚群平衡偏移密切相关，本研究拟通过对类风湿性关节炎(RA)患者T细胞亚群上表面CD30和CD95分子表达的检测，探讨细胞信号分子在参与RA免疫紊乱中的作用。     

肺脏树突状细胞表面共刺激分子在小鼠哮喘模型中的表达

目的 通过检测哮喘小鼠肺组织中树突状细胞(dendritic cells,DC)表面共刺激分子的表达以及细胞因子分泌的能力,探讨哮喘发生免疫耐受缺陷的原因.方法 Balb/c小鼠60只,分为3组(每组20只):哮喘组、磷酸盐缓冲液(PBS)对照组、健康对照组.对3组小鼠取肺组织做病理观察,行支气管肺泡灌洗液(BALF)计数细胞并分类,ELISA检测血清特异性IgE(sIgE)及BALF中细胞因子的水平.分离、培养肺脏DC,用流式细胞仪(FACS)测CD11c表达,并进一步用FACS分析哮喘小鼠DC表面共刺激分子CD11cCD80、CD11cCD86表达的变化.结果 哮喘小鼠肺组织表现为以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润为主的炎症改变,BALF中嗜酸性粒细胞计数显著增加(P＜0.01),血清sIgE水平显著升高(P＜0.01).与PBS对照组比较,哮喘小鼠CD11cCD80、CD11cCD86表达上调(P＜0.01),其分泌IL-10细胞因子的水平明显下降.结论 肺脏DC可能通过上调CD11cCD80、CD11cCD86在哮喘的免疫耐受缺陷中发挥作用.     

共刺激分子配体B7-DC基因真核表达载体和转基因细胞的构建

目的：克隆小鼠B7-DC基因，并构建含该基因的真核表达载体pEF6／-B7-DC-V5His，证明该基因在CHO细胞中的表达方式，为建立B7-DC的转基因小鼠打下基础。方法：从小鼠胸腺中抽提总RNA为模板，通过RT—PCR技术，扩增出B7-DC编码区片段。按常规方法克隆进pEF6V5His载体中，重组质粒经鉴定后采用脂质体法转染CHO细胞，48小时后进行间接免疫荧光实验，72小时后用blasticidin进行筛选，挑选出能稳定表达B7-DC的细胞株。结果：已成功克隆小鼠B7-DC基因并构建了用于表达B7-DC基因的真核表达载体，经间接免疫荧光实验（IFA）证明，该基因在CHO细胞中得到表达。经Western blot检测表明筛选出的转基因细胞稳定表达了B7-DC基因。结论：构建了用于表达B7-DC基因的真核表达载体pEF6／-B7-DC-VSHis，并能在CHO细胞中稳定表达目的基因，为该基因功能的后续研究奠定了基础。     

抗CD28＋B7.1单抗共刺激PBLs诱导肝癌细胞凋亡的蛋白激酶信号转导

目的 研究Ｔ淋巴细胞活化、增殖、介导肝癌细胞凋亡过程中其蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）和酪氨酸蛋白激酶（ＴＰＫ）的活性变化。方法 用抗ＣＤ２８＋Ｂ７．１（ＣＤ８０）单克隆抗体共刺激正常人外周血淋巴细胞（ＰＢＬｓ）后作用于肝癌细胞（ＢＥＬ－７４０２）。结果 激活的Ｔ细胞中ＰＫＣ、ＴＰＫ活性明显增强,并与肝癌细胞凋亡程度呈正相关。结论 ＰＫＣ、ＴＰＫ在Ｔ细胞活化、增殖及诱导肝癌细胞凋亡的信号转导中起重要作用。     

罗勒多糖对人树突细胞抗原摄取功能及共刺激分子表达的影响

目的探讨罗勒多糖对人外周血单核细胞来源的树突细胞（dendritic cells，DC）抗原摄取功能以及共刺激分子表达的影响。方法从正常人外周血单核细胞诱导未成熟和成熟的DC，实验组加入罗勒多糖（150μg/ml），对照组加入PBS，分别培养24h，收获未成熟的DC，与OVA—FTTC（100μg/ml）共同孵育，流式细胞仪检测DC的抗原摄取能力。同时收获成熟DC，流式细胞仪检测DC表面共刺激分子CD80、CD86的表达情况。结果与对照组比较，罗勒多糖作用组DC的抗原摄取能力显著提高，同时成熟DC表面共刺激分子CD80、CD86的表达也明显升高。结论罗勒多糖可显著增强DC的抗原摄取能力，并且能够提高细胞表面共刺激分子的表达，这可能是罗勒多糖发挥抗肿瘤免疫的机制之一。     

烟草烟雾提取物促进髓样树突状细胞共刺激分子的表达

目的通过体外实验研究烟草烟雾提取物(CSE)对小鼠髓样树突状细胞(mDC)成熟的影响及可能的机制。方法小鼠骨髓来源的单个核细胞加入粒-单集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)和含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液诱导出可供实验用的高纯度的未成熟DC(iDC),分空白对照组和CSE刺激组;CSE刺激组按15 mL/L的终浓度加入CSE,两组继续培养24 h,流式细胞检测技术检测mDC的共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达。结果空白对照组的mDC低表达CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ;CSE刺激后mDC表达CD40、CD80和MHC-Ⅱ比空白对照组明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。结论烟草烟雾提取物促进小鼠骨髓来源的mDC的CD40、CD80和MHC-Ⅱ的表达。     

反义DcR3 RNA转染诱导肝癌细胞凋亡的作用

目的研究DcR3反义mRNA在肝癌细胞凋亡中的作用。方法构建pVAXⅠ-as-DcR3反义表达载体，转染肝癌细胞，Western blot法观察DcR3蛋白合成有无降低，流式细胞术、TUNEL等方法观察凋亡变化。结果Western blot证实反义重组体可有效阻滞DcR3表达，同时转染了pVAXⅠ-as-DcR3的肝癌细胞凋亡较对照组增多。结论DcR3反义RNA可使肝癌细胞凋亡增多。     

抗CD28＋B7．1单抗共刺激T细胞诱导肝癌细胞凋亡的第二信使系统研究

目的：探讨T淋巴细胞活化、增殖、诱导肝癌细胞凋亡过程中第二信使系统的调控机制。方法：用CD28＋B7．1（CD80）单克隆抗体共刺激T淋巴细胞诱导肝癌细胞（BLE－7402）凋亡,测定不同诱导时间T细胞内cAMP,cGMP和Ca^2 的浓度改变及肝癌细胞凋亡情况。结果：活化的T淋巴细胞中,cAMP浓度在初期短暂升高,继而快速下降,作用于肝癌细胞后逐步回升至1－2倍,而细胞内cGMP的浓度急剧升高6－7倍,Ca^2 浓度也显著增加2－3倍,且均在第4天达最高值,与癌细胞的凋亡呈正相关,结论：T淋巴细胞内第二信使系统cAMP、cGMP和Ca^2 的水平与细胞的活化增殖、杀伤效应密切相关。     

TRAIL诱导HBV转染肝癌细胞BEL-7402凋亡的作用及机制研究

目的　研究肝癌细胞BEL- 74 0 2感染HBV前后,TRAIL诱导其凋亡的敏感度变化及作用机制。方法　构建含1.1倍HBV全基因组的真核表达载体pcDNA3 1.1HBV ,转染人肝癌细胞BEL -74 0 2 ,G4 18稳定筛选,建立HBVadr亚型体外转染的细胞模型。原位末端标记(TUNEL)检测TRAIL诱导的凋亡反应,并通过设立TRAIL联合其可溶性受体sDR5 (sDR5与TRAIL结合后,可特异性阻断TRAIL诱导凋亡) ,以证实该凋亡是由TRAIL特异性诱导的。琼脂糖凝胶电泳(DNAladder)检测染色体DNA的断裂情况。流式细胞术、半定量逆转录聚合酶链反应检测HBV感染前后细胞表面TRAIL各受体的表达。双荧光素酶报告基因系统检测抑制凋亡的核转录因子NF κB的活性。结果　成功构建了包含HBV全基因组的真核表达载体pcDNA3 1.1HBV ,转染BEL 74 0 2、经G4 18稳定筛选后得到HBVadr亚型转染的细胞模型BEL 74 0 2 1.1HBV。TRAIL诱导BEL 74 0 2、BEL 74 0 2 pcDNA3及BEL 74 0 2 1.1HBV的凋亡率分别为30 .5 %、2 9.8%和76 % (P <0 .0 1) ;经sDR5特异性阻断后,凋亡率分别为0 .9%、0 .8%和0 .9% ,证明凋亡是由TRAIL特异性诱导的。TRAIL作用2 4h后,琼脂糖凝胶电泳可见BEL- 74 0 2 1.1H-BV较BEL- 74 0 2、BEL 74 0 2 pcDNA3染色体DNA断裂的现象更为明显。无论RNA水平还     

抗人肝癌基因工程嵌合抗体的构建及在Sp2/0细胞的稳定表达

目的　构建抗人肝癌嵌合抗体 ,并在Sp2 0细胞中进行稳定高效表达。方法　分别将HAb18轻、重链可变区基因克隆入真核表达载体pDHL构建重组载体pDHL chHAb18。酶切及测序鉴定后 ,转染Sp2 0细胞 ,经甲氨蝶蛉 (MTX)筛选获得抗性克隆。采用有限稀释法单克隆化后持续MTX加压培养。通过ELISA筛选高效表达的单克隆细胞株。表达产物纯化后 ,进行SDS PAGE和Westernblot检测 ,同时采用ELISA和免疫荧光法检测其抗原结合特异性。结果　成功构建了重组嵌合IgG抗体chHAb18的真核表达载体pDHL chHAb18。转化Sp2 0细胞后 ,初步筛选得到了高效表达chHAb18的细胞株。经MTX加压培养 ,1株细胞的chHAb18表达量达到 10mg L。SDS PAGE和Westernblot检测结果表明 :目的蛋白分子质量约为 16 0× 10 3,还原后为 2条带 ,分子质量约为 5 2× 10 3和 2 7× 10 3。上述蛋白条带均与羊抗人IgG抗体特异结合。结论　成功构建了抗人肝癌基因工程嵌合抗体chHAb18,并在骨髓瘤细胞中获得高效表达。为其进一步的应用研究奠定了基础。     

The role of apoptosis in growing and stationary rat ascites hepatoma,Yoshida AH-130

The occurence of apoptosis and its contribution to growth-phase transitions in the rat ascites hepatoma Yoshida AH-130 have been evaluated. Apoptosis was observed by light microscopy in both exponentially-growing and stationary tumours as characteristic chromatin condensation and compacting of the cytoplasm, but the frequency of apoptotic bodies (apoptotic index) was four-fold higher in stationary than in logarithmic-growing tumours. Apoptosing cells exhibited strong immunocytochemical reactivity for ‘tissue’ transglutaminase, and transglutaminase activity was higher in stationary tumour cells. A ladder pattern of DNA fragmentation was revealed by agarose gel electrophoresis which was more pronounced in stationary tumours. The apoptotic bodies were either free or contained in vacuoles within otherwise normal tumour cells, suggesting active engulfment of dead cells by viable homologous cells. Such ‘homophagic’ disposal of the apoptotic bodies probably accounted for a component of the enhanced cell protein degradation previously observed in stationary AH-130 tumours (Tessitore L, Bonelli G, Cecchini G, Amenta JS, Baccino FM, Arch Biochem Biophys 1987; 255: 372–384). The data indicate that, in concurrence with changes in the cell proliferation rate, modulations of apoptosis play a substantial role in determining the net growth rate of such an anaplastic tumour as the Yoshida AH-130 hepatoma.     

胶质瘤bcd—2基因表达水平与其细胞增殖和凋亡关系的研究

目的 探讨胶质瘤细胞ｂｃｌ－２基因表达水平与肿瘤恶性程度、细胞增殖活性及凋亡程度的关系。方法 以６９例不同级别的人胶质瘤组织为研究对象,用原位杂交及免疫组化染色ＡＢＣ法分别检测ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ、ｂｃｌ－２蛋白和增殖细胞核抗原（细胞增殖活性标记物）的表达,并用３’末标记法做原位细胞凋亡检测。结果 ６４例（９２．８％）表达ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ,６０例（８７．０％）表达ｂｃｌ－２蛋白,两者的表达水平呈正     

猪鼻支原体抗原体外对白血病细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨猪鼻支原体抗原对白血病细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法 以MTT法测定猪鼻支原体抗原对白血病细胞系NB4、HL-60及K562增殖的影响；琼脂糖凝胶电泳检测K562细胞凋亡；TUNEL法及二苯胺法定量检测细胞凋亡；同时观察猪鼻支原体抗原对K562细胞Bcl-2／Bax表达的影响。结果 猪鼻支原体抗原呈浓度依赖性抑制3种白血病细胞的增殖；在有效浓度的抗原作用下，DNA ladder显示K562细胞以凋亡方式死亡；TUNEL法获得凋亡率为38．65％，显著高于正常对照组(10．23％)；二苯胺法获得凋亡率为25．01％，显著高于正常对照组(16．49％，)；与对照组比较，Bcl-2表达降低，Bax表达升高，Bcl-2／Bax比值下降(为0．6591)。结论 猪鼻支原体抗原呈浓度依赖性抑制白血病细胞的增殖；猪鼻支原体抗原通过诱导K562细胞凋亡的方式抑制其增殖，可能是通过降低Bcl-2、升高Bax而实现的。     

二甲双胍对人肝癌细胞Bel-7402增殖与凋亡的影响

目的:研究二甲双胍抑制人肝癌细胞Bel-7402增殖及调亡的影响,并初步探讨其机制。方法:体外培养人肝癌细胞株Bel-7402,以不同浓度的二甲双胍(10mM、20mM、40mM)干预细胞48h。采用MTT法检测药物对细胞增殖的影响;采用Hoechst 33258荧光染色法和流式细胞术检测细胞凋亡;Real-time PCR检测caspase-3、bax和bcl-2的mRNA水平表达。结果:与对照组相比,不同浓度的二甲双胍作用于Bel-7402细胞48h后,MTT结果显示对细胞增殖有明显抑制作用(P0.05);Hoechst 33258荧光染色法显示凋亡细胞明显增多;流式细胞术分析显示二甲双胍可明显诱导Bel-7402细胞凋亡,晚期凋亡率分别为3.76%,8.96%和18.67%;caspase-3、bax和bcl-2的mRNA表达水平均上调(P0.05);以上结果均具有浓度依赖性。结论:二甲双胍能抑制Bel-7402细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与caspase-3、bax和bcl-2的mRNA表达水平改变有关。