快速检测猪链球菌的环介导等温扩增方法

目的建立猪链球菌(S. suis)的环介导等温扩增方法(LAMP)。方法通过BLASTn序列比对确定较为保守的S. suis种特异基因,用软件PrimerExplorer V4设计针对靶基因的LAMP试验引物;分别用煮沸法和试剂盒提取法提取基因组做敏感性试验,并用62株非S. suis菌株评价了实验的特异性;再用100株分离自不同地区不同时间的S. suis菌株评价该方法的可靠性。结果确定了S. suis种特异性基因dnaN为靶基因,并针对该基因建立了检测S. suis的LAMP方法。敏感性实验中,每个反应的检测下限是31.25 fg纯DNA,相当于14个拷贝;煮沸法的检测下限是每个反应27 CFU。在对62株非S. suis菌株与有争议的S. suis菌株的特异性评价实验中,未发现有假阳性。结论成功建立了针对dnaN基因检测S. suis的LAMP方法。     

环介导等温扩增技术在致病菌检测中的应用

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术是近10年来发展起来的具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点的新的恒温核酸扩增技术,已被应用于致病菌检测的研究。LAMP技术需针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物,并采用链置换型DNA聚合酶,操作步骤少,不需要聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术复杂的设备。本文就LAMP技术在致病菌检测中的应用作一综述。     

环介导等温扩增技术在嗜水气单胞菌检测中的应用

目的 建立环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)对嗜水气单胞菌检测的方法,并用临床标本对该方法进行评价。方法 根据嗜水气单胞菌desA 基因的保守序列设计特异性引物,利用参考质粒评价该检测体系的灵敏度;用30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性;用粪便模拟样本以及临床样本评价该检测体系的临床检测的可行性。结果 LAMP检测体系对嗜水气单胞菌重组质粒的检测灵敏度为1×10²拷贝/反应体系;LAMP检测体系在检测30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现假阳性;LAMP检测体系在粪便模拟标本中的检测下限为5 × 10³ CFU/g;通过与qPCR技术相比较,LAMP具有更高的灵敏度以及更优秀的临床标本的检测能力。结论 本研究建立的LAMP方法是首次将LAMP技术运用到了嗜水气单胞菌的检测,所需仪器设备简单,可作为一种快速的筛查方法在临床检验和基层实验室应用。     

环介导等温扩增技术及其在食源性吸虫感染检测中的应用

随着人们生活水平的提高,土源性寄生虫病的感染率和发病率日趋下降,与之相反,食源性寄生虫病更加引人关注,而食源性吸虫病是其中的重要组成。据WHO统计,目前已知能感染人体的食源性吸虫有100多种,感染者超过4000万人,还有10%的人口面临感染食源性吸虫的风险。目前对于腔道内寄生的食源性吸虫通常采用病原学诊断方法,但对于深部组织内寄生的食源性吸虫则缺乏有效的诊断方法。环介导等温扩增(LAMP)技术是新近发展起来的一种方法,它具有简便快速、灵敏特异、经济实用、且易于普及等优点,有替代传统PCR之势。但国内对LAMP法的了解和应用不多,基于其在食源性吸虫感染方面的诊断价值,本文予以介绍,以供借鉴。     

环介导等温扩增技术用于寄生虫检测的研究进展

寄生虫病在我国分布广泛,严重危害着人们的身体健康.环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新的核酸扩增技术,具有敏感性高、特异性强和简便快速等优点,可用于寄生虫的快速诊断.该文就LAMP检测寄生虫的研究现状进行综述.     

应用环介导等温扩增技术检测弓形虫

目的 用环介导等温扩增（LAMP）技术检测弓形虫。 方法　 用酚-氯仿法提取弓形虫速殖子基因组 DNA,设计两对扩增弓形虫 B1基因的 LAMP 引物。以间日疟原虫、恶性疟原虫、卡氏肺孢子虫、日本血吸虫及小鼠白细胞作对照,进行LAMP反应,产物经 SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性。将弓形虫速殖子经倍比稀释为（2～3）×106个/ml至（2～3）×10-1个/ml 等8个浓度,进行LAMP反应,验证该方法的敏感性。 结果 LAMP反应结果显示,弓形虫速殖子检测管经显色后呈绿色,对照组均呈棕色。弓形虫的LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组均无扩增产物。LAMP技术可检测到的弓形虫速殖子最低浓度为2～3个/ml。 结论 LAMP技术在弓形虫检测中显示出较好的特异性与敏感性。     

重要虫媒病毒性传染病环介导等温扩增检测技术研究进展

登革热、基孔肯雅热、寨卡病毒热等重要虫媒病毒性传染病可引起人群发热、皮疹、关节痛和出血等主要临床症状,具有传播速度快特点,及时检测发现上述病例,采取疫情处置,对于遏制疫情蔓延具有重要意义。目前上述传染病常见的检测方法主要包括聚合酶链反应、二代测序、环介导等温扩增等分子鉴定技术,其中环介导等温扩增技术具有快速、简单、廉价、准确、灵敏度、特异性高特点,已广泛用于虫媒病毒传染病核酸分子检测。本文对上述重要虫媒病毒性传染病环介导等温扩增检测技术研究进展进行综述。     

环介导等温扩增技术及其在病原生物检测中的应用

环介导等温扩增(LAMP)技术是近年来发展起来的一种新型核酸扩增技术,具有操作简便、快速、特异性高、灵敏性高等特点,自2000年开发以来,在短短的十几年内被广泛应用于细菌、病毒和寄生虫等病原生物的检测,在即时检验和基层实验室推广中有重要意义。     

环介导等温扩增技术检测旋毛虫的研究

目的 用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术检测旋毛虫DNA. 方法 用酚-氯仿法提取旋毛虫基因组DNA,设计两对扩增旋毛虫18S rRNA基因的LAMP引物,以日本血吸虫DNA作对照,进行LAMP反应.将旋毛虫基因组DNA经梯度稀释,进行LAMP反应,验证该方法的敏感性.产物经SYBR Green I显色后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性. 结果 LAMP反应结果显示,旋毛虫基因检测管经显色后呈绿色,对照组均呈棕色.LAMP技术可检测到的旋毛虫最低浓度为415fg/μl. 结论 建立了检测旋毛虫DNA的LAMP技术.     

环介导等温扩增技术检测恶性疟原虫的研究

目的环介导等温扩增(LAMP)技术检测恶性疟原虫。方法酚氯仿法提取恶性疟原虫基因组DNA,设计四条扩增恶性疟原虫环子孢子蛋白基因的LAMP引物,以间日疟原虫、弓形虫、卡氏肺孢子虫、人全血DNA为对照,进行LAMP反应。LAMP产物经显色、电泳鉴定。将原虫血症为1.5%的恶性疟原虫血样用正常人血按1∶10倍比稀释为1.5×10-3、1.5×10-4、1.5×10-5、1.5×10-6、1.5×10-7、1.5×10-86个浓度后进行LAMP,检测其敏感性。结果恶性疟原虫检测管经显色后呈绿色(阳性),对照组均呈棕色(阴性)。恶性疟原虫LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组均无扩增产物。LAMP可检测恶性疟原虫的敏感度为1.5个疟原虫/107RBC。结论检测恶性疟原虫的LAMP方法特异、敏感及简便。     

环介导等温扩增技术检测钩端螺旋体的研究

目的 利用环介导等温扩增技术,建立检测钩端螺旋体的方法。方法 选取钩体LipL32基因,设计了LAMP引物。对27株钩体、25株非钩体样本予以检测,然后进行灵敏度和模拟样本的研究。结果 扩增27株钩体结果为阳性,扩增25株非钩体结果为阴性。灵敏度为200拷贝/μL,模拟样本检测下限为200条钩体/μL(煮沸法)和20条钩体/μL(试剂盒提取法)。结论 LAMP实验操作简单,对设备要求不高,可以作为钩体的快速检测方法。     

环媒恒温基因扩增法检测藤黄微球菌的研究

目的建立藤黄微球菌的环媒恒温基因扩增检测方法。方法基于藤黄微球菌23SrRNA基因部分序列设计1套（共4条）能够识别6个区域的特异性引物；优化扩增条件；评估该方法的特异性与敏感性。结果用7个参考株和大肠埃希菌等8种其他临床病原菌检验本检测法，成功地建立了环媒恒温基因扩增（LAMP）检测法。结论环媒恒温基因扩增法检测藤黄微球菌快速、灵敏高、特异性强。     

LAMP技术在动物病毒病原检测中的应用进展

环介导等温扩增技术(LAMP)是一种具有简单、快速、特异性强和扩增效率高的核酸检测技术,目前已在食品、卫生及疾病预防控制检验等领域得到了诸多应用。本文主要介绍了LAMP技术在实验及临床过程中检测肝炎病毒、流感病毒、HIV-1、狂犬病毒、乙脑病毒、冠状病毒、登革病毒等病毒病原感染的应用进展。     

逆转录环介导等温扩增技术在诺如病毒基因检测中的应用

目的建立逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)快速检测诺如病毒的方法。方法采用逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)扩增诺如克病毒特异性基因,并与RT-PCR方法比较。结果与RT-PCR技术相比,RT-LAMP法更加简便快速,能够在等温条件下进行,特异性好,具有更高的灵敏性。结论RT-LAMP方法具有灵敏度高,特异性强,操作简便快速,不需要复杂仪器设备等优点,为临床检测诺如病毒快速简便的新方法。     

Rapid detection of Streptococcus pneumoniae by real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification

Background and aim of study

A significant human pathogenic bacterium, Streptococcus pneumoniae was recognized as a major cause of pneumonia, and is the subject of many humoral immunity studies. Diagnosis is generally made based on clinical suspicion along with a positive culture from a sample from virtually any place in the body. But the testing time is too long. This study is to establish a rapid diagnostic method to identification of Streptococcus pneumoniae.

Methods

Our laboratory has recently developed a new platform called real-amp, which combines loop-mediated isothermal amplification (LAMP) with a portable tube scanner real-time isothermal instrument for the rapid detection of Streptococcus pneumonia. Two pairs of amplification primers required for this method were derived from a conserved DNA sequence unique to the Streptococcus pneumoniae. The amplification was carried out at 63 degree Celsius using SYBR Green for 60 minutes with the tube scanner set to collect fluorescence signals. Clinical samples of Streptococcus pneumoniae and other bacteria were used to determine the sensitivity and specificity of the primers by comparing with traditional culture method.

Results

The new set of primers consistently detected in laboratory-maintained isolates of Streptococcus pneumoniae from our hospital. The new primers also proved to be more sensitive than the published species-specific primers specifically developed for the LAMP method in detecting Streptococcus pneumoniae.

Conclusions

This study demonstrates that the Streptococcus pneumoniae LAMP primers developed here have the ability to accurately detect Streptococcus pneumoniae infections by real-time fluorescence LAMP.     

环介导等温扩增法在结核病诊断中的应用

目的研究环介导等温扩增法在不同临床样本中的结核病诊断价值。方法使用环介导等温扩增法检测肺泡灌洗液、局部穿刺液、腹水和脑脊液中的结核分枝杆菌复合群的特异性基因IS1081,并与实时荧光定量PCR进行比较。结果在荷菌量较高的肺泡灌洗液和局部穿刺液中,环介导等温扩增法敏感性比实时荧光定量PCR低(80%vs 92%);在荷菌量极低的腹水和脑脊液中,环介导等温扩增法敏感性比实时荧光定量PCR高(34.6%vs 15.4%),但特异性略有下降(80%vs 93.3%);综合计算所有样本的敏感性,环介导等温扩增法与实时荧光定量PCR无显著差别(56.9%vs 52.9%)。结论环介导等温扩增法具有较高敏感性和特异性,可以用于结核病诊断。     

反转录环介导等温扩增技术对丙型肝炎病毒可视化分型检测

目的 应用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)可视化检测丙型肝炎病毒(HCV)1b和2a基因型,为RT-LAMP技术应用于现场或基层医院提供初步探索经验。方法 首先,收集临床阳性样本并用荧光定量PCR分型检测,把样本基本分为1型和非1型。然后分别根据HCV 1b和2a基因型设计RT-LAMP引物并优化反应条件,通过互换模板实验验证这2套引物的特异性,并通过检测稀释的模板以验证引物的灵敏度。同时用钙黄绿素进行产物显色,使HCV分型检测可视化。最后用RT-LAMP方法检测临床样本,并计算阳性率,应用配对卡方检验比较RT-LAMP和荧光定量PCR的统计学差异。结果 优化好的RT-LAMP体系的特异性好,对HCV 1b型的检测灵敏度为10³ IU/mL,2a型的检测灵敏度为10⁴ IU/mL。另外,利用钙黄绿素进行产物检测的效果和电泳结果相当。通过对临床样本分型检测,HCV 1b型样本的RT-LAMP检测结果和荧光定量PCR差异无统计学意义(P>0.05),HCV 2a型样本的RT-LAMP检测结果和荧光定量PCR差异有统计学意义(P<0.05),但是未检出的样本中有2例为HCV 2b型。结论 RT-LAMP对HCV的可视化分型检测具有较好的特异性和灵敏度,操作简便,具有在现场或基层医院的应用前景。     

LAMP法检测儿童粪便中肠道腺病毒的建立

目的通过应用环介导等温扩增(LAMP)建立一种快速、简便的可视化检测儿童肠道腺病毒核酸的方法。方法登录GenBank网站下载腺病毒40和41基因型的六邻体序列,根据该区段的保守序列设计4条LAMP引物。将反应体系加入EP管,在恒温条件(65℃)扩增60min后,再以凝胶电泳和钙黄绿素染色评价LAMP法的特异性和灵敏度,并和PCR法的结果相比较。最后,同时用LAMP和PCR法对40份可疑临床样本进行检测,应用卡方检验进行统计学分析。结果 LAMP法能准确地使腺病毒40和41型得到扩增,酶切结果也正确,显示了LAMP法较好的特异性。LAMP的灵敏度比PCR高约10倍。经过对40份临床样本的检测,LAMP与PCR均没有发生非特异扩增,LAMP法和PCR法的一致性为92.5%(P0.05)且LAMP法没有漏检阳性样本。另外,使用钙黄绿素染色的方法更好地显示了产物检测的可视性和简便性。结论该研究初步建立了快速、简便、可视化检测肠道腺病毒的LAMP技术,在基层医疗机构有一定的实用价值。     

环介导等温扩增技术在结核性胸膜炎快速诊断中的应用

目的探讨针对hsp X基因设计引物的环介导等温扩增技术(LAMP)对结核性胸膜炎患者结核分枝杆菌的诊断价值。方法采用LAMP技术对结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA样品进行检测,评价LAMP技术的检测限;同时对8种非结核分枝杆菌菌株及阴沟肠杆菌和大肠埃希菌标准菌株进行鉴定,评价该方法的特异性。对58例结核性胸膜炎患者和32例肺癌患者胸腔积液样本结核分枝杆菌进行检测,评价LAMP技术的临床应用价值。结果 LAMP对倍比稀释的H37Rv的DNA样品检测结果为阳性,检测限为320a M。八种非结核分枝杆菌和2种普通菌菌株检测结果为阴性。LAMP对胸腔积液标本检测的灵敏度是75.8%(44/58),定量PCR为79.3%(46/58),无显著差别(χ2=0.25,P0.05);均显著高于涂片法39.6%(23/58),差异具有统计学意义(χ2=17.39,P0.01)。结论 LAMP技术是一种简单快速有效的等温扩增技术,由于其较高的灵敏度和特异度,可以对结核性胸膜炎患者胸腔积液标本快速鉴定。