ADAM17-shRNA通过Akt/GSK3β信号通路促进HT29结肠癌细胞的凋亡

目的探讨沉默解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)基因的表达对HT29结肠癌细胞增殖和凋亡的抑制作用及其可能机制。方法将HT29结肠癌细胞分为干扰组、阴性对照组和空白对照组,干扰组细胞转染重组慢病毒载体以沉默ADAM17基因的表达,阴性对照组细胞转染阴性对照重组慢病毒载体,空白对照组细胞加入等量的PBS溶液。采用实时荧光定量PCR法(real-time PCR)检测ADAM17 mRNA的表达,采用Western blot法检测ADAM17、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase3)、磷酸化蛋白激酶B(P-Akt)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(P-GSK3β)及糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)蛋白的表达,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测细胞增殖能力的变化,采用Annexin-V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡情况。结果与阴性对照组和空白对照组比较,干扰组细胞中ADAM17 mRNA及其蛋白的表达水平均较低,同时点(培养24、48及72 h)的吸光度值(A值)也较低,细胞凋亡率较高,caspase3蛋白的表达水平较高,P-Akt和P-GSK3β蛋白的表达水平均较低,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 ADAM17基因沉默可能通过抑制Akt/GSK3β通路的激活,发挥抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。     

TNF-α重组慢病毒对胃癌细胞自分泌杀伤作用的实验研究

目的探讨TNF-α重组慢病毒对胃癌细胞自分泌杀伤作用。方法 TNF-α重组慢病毒感染SGC-7901胃癌细胞为实验组,并设立阴性对照组以及空白对照组,采用RT-PCR检测3组细胞中TNF-αmR NA的表达情况,ELISA检测3组细胞上清液中TNF-α蛋白含量,流式细胞术检测3组细胞凋亡情况。结果 PCR实验观察到TNF-αmR NA荧光条带24h后稳定表达。测得三组培养液中TNF-α含量,实验组[(2.6926±0.7563)ng/ml]明显高于阴性对照组[(0.9326±0.3091)ng/ml]和空白对照组[(0.8552±0.2768)ng/ml],且差异均有统计学意义(P均0.01),而阴性对照组和空白对照组之间差别无统计学意义(P0.05)。在流式细胞实验中,实验组细胞凋亡率明显高于其他组,差异有统计学意义(P0.05),而阴性对照组和空白对照组差别无统计学意义(P0.05)。结论TNF-α重组慢病毒可以感染SGC-7901胃癌细胞,并在胃癌细胞中稳定表达并自分泌TNF-α,诱导杀伤胃癌细胞。     

LncRNA PCGEM1对结肠癌SW480细胞增殖与侵袭的影响

目的 :探讨lncRNA PCGEM1对结肠癌SW480细胞的增殖与侵袭的影响。方法 :培养人结肠癌SW480细胞,将结肠癌细胞系SW480细胞分成3组进行处理,即空白对照组:不转染慢病毒;阴性对照组:转染无序序列慢病毒载体;试验组:转染沉默lncRNA PCGEM1序列慢病毒载体。荧光定量PCR(RT-PCR)检测RNA表达,CCK-8试剂盒、Transwell和AV-PI试剂盒检测增殖、侵袭与凋亡。结果:lncRNA PCGEM1沉默表达慢病毒载体的滴度为1×10~8TU/mL。RT-PCR结果显示:试验组与阴性对照组相比,lncRNA PCGEM mRNA表达较低,差异有统计学意义(q=8.141,P0.05);Caspase-3 mRNA和Caspase-9 mRNA的表达具有同样的表达趋势(P0.05)。Transwell实验结果显示,3组之间差异有统计学意义(F=21.982,P0.05),试验组和阴性对照组比较差异有统计学意义(q=4.223,P0.05)。CCK-8检测结果显示,3组差异有统计学意义(F=21.214,P0.05),试验组与阴性对照组比较差异有统计学意义(q=5.272,P0.05)。AV-PI检测结果显示,3组比较差异有统计学意义(F=31.009,P0.05),试验组与空白载体病毒组比较差异有统计学意义(q=9.131,P0.05)。结论:lncRNA PCGEM1在结肠癌细胞中高表达。沉默lncRNA PCGEM1表达可以抑制结肠癌细胞增殖和侵袭,促进凋亡。     

SHH信号通路参与FOXQ1基因对胃癌细胞凋亡诱导作用的实验研究

目的 :探讨Sonic Hedgehog(SHH)信号通路是否参与转录因子叉头框Q1(FOXQ1)基因诱导的胃癌细胞凋亡。方法:采用q RT-PCR检测永生化胃黏膜上皮细胞及不同胃癌细胞系中FOXQ1的表达情况,FOXQ1 siRNA转染人胃癌SGC-7901细胞设为si-FOXQ1组,同时设置转染正常对照组(Normal)和阴性对照组(si-Control),q RT-PCR和Western blot检测FOXQ1基因和蛋白表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blot检测Bax和Cleaved Caspase3蛋白及SHH信号通路相关蛋白SHH、Smo及下游分子Gli1和Gli3蛋白表达水平。结果:FOXQ1在胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达显著低于胃癌细胞(P0.05),胃癌SGC-7901细胞中FOXQ1的表达最高,作为后续实验研究对象。转染FOXQ1 siRNA后SGC-7901细胞中FOXQ1的表达显著下降(P0.05)。si-FOXQ1组凋亡率及Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达显著高于si-Control组(P0.05),而SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达显著低于si-Control组(P0.05)。Normal组和si-Control组间以上各指标差异无统计学意义(P0.05)。SHH特异性激活剂purmorphamine能够逆转转染FOXQ1 siRNA诱导的SGC-7901细胞凋亡。结论:FOXQ1基因在胃癌细胞中呈高表达,SHH信号通路参与FOXQ1基因对胃癌SGC-7901细胞凋亡的诱导作用,通过上调Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达来实现。     

靶向RNA干扰骨桥蛋白基因的慢病毒载体对血管平滑肌细胞增殖凋亡的影响

目的 构建大鼠骨桥蛋白(OPN)基因的shRNA慢病毒表达载体,并观察其对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和凋亡的影响.方法 针对OPN基因的不同部位设计3对shRNA的寡核苷酸片段,克隆到慢病毒载体PLKO.1中,构建靶向OPN基因的慢病毒载体PLKO.1-OPN-shRNA,检测并筛选最佳抑制效率的shRNA干扰载体.并将其转染大鼠血管平滑肌细胞,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测VSMCs OPN mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测VSMC OPN蛋白表达水平;噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞仪检测沉默OPN基因后对VSMC增殖和凋亡能力的影响.结果 靶向OPN慢病毒表达载体构建成功.重组慢病毒载体PLKO.1-OPN-shRNA转染后可显著抑制VSMCs的OPN mRNA及蛋白的表达水平,OPN蛋白表达明显下降,其中以PLKO.1-OPN2-shRNA最为明显,达到90％以上;转染PLKO.1-OPN2-shRNA后72 h的细胞增殖能力[吸光度(A)值=0.365 ±0.011]明显低于未处理组(A值=0.941±0.028)和阴性对照组细胞(A值=0.941±0.040,P＜0.05);而早期细胞凋亡率(20.44±2.69)％和晚期细胞凋亡率(16.79±1.01)％均明显高于未转染组和阴性对照组(P＜0.01).结论 成功构建并筛选最佳抑制效率的靶向OPN慢病毒表达载体PLKO.1-OPN2-shRNA,该载体能有效抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖,并促进细胞凋亡.     

靶向慢病毒载体RNA干扰小鼠血管内皮细胞异种抗原的研究

目的 使用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)方法抑制小鼠血管内皮细胞异种抗原半乳糖α1,3-半乳糖(Galα1,3-Gal)的表达.方法 经体外设计合成针对α1,3-半乳糖基转移酶(α1,3-GT)mRNA的序列特异性小发夹RNA(shRNA),并构建携带α1,3-GT shRNA的重组慢病毒载体,以慢病毒感染小鼠血管瘤内皮细胞系EOMA细胞.采用荧光实时定量聚合酶链反应检测转染后的EOMA细胞α1,3-GT mRNA表达水平的变化;免疫荧光法和流式细胞术检测转染后的EOMA细胞异种抗原Galα1,3-Gal表达水平的变化.并将转染后的EOMA细胞与人血清混合培养,用四甲基偶氮唑盐比色法测定细胞存活率.结果 成功获得携带α1,3-GT shRNA的成熟重组慢病毒颗粒,转染EOMA细胞效率可达75%.与空白对照组、空转染组以及阴性siRNA对照组比较,重组慢病毒转染EOMA细胞后,能有效抑制α1,3-GT的表达,抑制率为88%(P＜0.05);Galα1,3-Gal抗原表达水平明显降低(P＜0.05);而空白对照组、空转染组和阴性siRNA对照组间的差异无统计学意义(P＞0.05).重组慢病毒转染后的EOMA细胞与人血清混合培养后的存活率较各对照组明显提高(P＜0.05).结论 成功构建靶向α1,3-GT基因的重组慢病毒载体,通过RNAi沉默α1,3-GT基因,抑制EOMA细胞异种抗原Galα1,3-Gal的表达,在体外实验中可减轻异种超急性排斥反应.     

RNA干扰阻断OX40/OX40L共刺激通路对CD4+CD25+T调节细胞的影响

目的 探讨慢病毒介导的RNA干扰技术诱导小鼠树突状细胞OX40L基因沉默对调节性T细胞的影响. 方法 设计针对小鼠OX40L基因的RNA于扰序列,通过外源筛靶筛选出干扰效果最佳的序列.以293T为包装细胞,制备含OX40L的siRNA序列的慢病毒载体OX40L-RNAi-LV和阴性对照载体NC-GFP-LV.采用磁式分选器分离培养骨髓来源的小鼠树突状细胞(DCs),以MOI为25进行转染,分别将转染OX40L-RNAi-LV(实验组)、转染NC-GFP-LV(阴性对照组)和未转染(空白对照组)的DCs与磁式分选器分选得到的CD4+CD25+T调节细胞共培养,6 d后通过流式细胞仪检测T调节细胞的增殖和凋亡情况. 结果外源筛靶筛选出干扰效果最佳的RNA干扰序列(靶序列为GCTCATACAAGAATGAGTA),OX40L蛋白表达的抑制率为73.1%.感染复数为25时,慢病毒载体感染DCs的效率为86.4%.DCs与CD4+CD25+T调节细胞共培养后,实验组的凋亡细胞比例为8.7%,显著低于阴性对照组(20.1%)和空白对照组(19.8%),F=244.22,P=0.000;而增殖细胞前体频率为38.3%,明显高于阴性对照组(24.5%)和空白对照组(22.9%),F=95.40,P=0.000.结论 小鼠OX40L的siRNA慢病毒载体可以有效降低树突状细胞OX40L的表达,对体外培养的CD4+CD25+T调节细胞具有显著地促进增殖、减少凋亡的作用.     

Beclin-1分子在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨Beclin-l基因与胰腺癌发生发展的关系。方法 (1)回顾性收集2009年4月至2009年11月期间四川大学华西医院行手术切除的胰腺癌标本25例及正常胰腺组织20例,采用实时荧光定量PCR和免疫组化染色方法分别检测胰腺癌组织及正常胰腺组织中Beclin-1 m RNA及其蛋白的表达水平,并分析胰腺癌组织中Beclin-1蛋白的表达水平与患者临床病理学特征之间的关系。(2)将PANC-1细胞分为2组,转染组细胞转染PLen O-WPI-Beclin-1重组慢病毒载体,未转染组细胞未进行重组慢病毒载体转染,分别于共培养24及48 h时采用PCR法检测Beclin-1 m RNA的表达水平。(3)将PANC-1细胞分为3组,转染组加入PLen O-WPI-Beclin-1重组慢病毒载体,空载体组加入PLen O-WPI载体,空白对照组未加入任何载体,各组细胞于培养1~7 d期间每天采用MTT法检测细胞增殖情况。结果 (1)人胰腺癌中Beclin-1 m RNA及其蛋白的表达水平均低于正常胰腺组织(P0.05)。在胰腺癌患者中,Beclin-1蛋白的表达水平与患者的年龄、性别、肿瘤直径及分化程度均无关(P0.05),而与TNM分期及淋巴结转移有关,TNMⅢ期和Ⅳ期患者的Beclin-1蛋白的表达水平低于Ⅰ期或Ⅱ期患者(P0.05);淋巴结转移阳性患者的Beclin-1蛋白的表达水平低于阴性患者(P=0.011)。(2)转染24 h和48 h时,同时点转染组细胞中Beclin-1 m RNA的表达水平高于未转染组(P0.05)。(3)MTT实验结果显示,转染1、2及3 d时,转染组、空载体组和空白对照组细胞的OD值比较差异均无统计学意义(P0.05);从转染4 d开始,至转染7 d期间,同时点转染组细胞的OD值较空白对照组和空载体组均较低(P0.05)。结论 Beclin-1基因及其蛋白在胰腺癌组织中的表达均下调,其可能是胰腺癌发生发展的原因之一。将Beclin-1基因导入PANC-1细胞后,细胞的增殖能力降低,提示Beclin-1基因可能是胰腺癌基因治疗的目标基因。     

siRNA抑制S100A4蛋白对人胃腺癌细胞增殖和凋亡及化疗敏感性的影响

目的 研究应用小干扰RNA沉默S100A4蛋白后对人胃腺癌细胞BGC-823增殖、凋亡及化疗敏感性的影响.方法 人胃腺癌BGC-823细胞系转染siRNA,RT-PCR检测转染效果后将对数期胃腺癌细胞分为干扰组、阴性对照组、正常对照组,MTT检测不同浓度奥沙利铂对胃腺癌细胞中效浓度IC50值;绘制细胞生长曲线;TUNEL法检测细胞凋亡;RT-PCR检测各组细胞mRNA变化;Western blot检测蛋白水平的变化,计量资料选用t检验,SPSS17.0分析RT-PCR检测各组细胞mRNA的变化,Western blot检测蛋白水平的变化,细胞生长曲线描述细胞增殖,TUNEL法检测细胞凋亡,MTT法检测不同浓度奥沙利铂对胃腺癌细胞中效浓度IC50值.计量资料以((x)±s)表示,多个样本比较采用单因素方差分析和LSD检验方法.P＜0.05为差异有统计学意义.结果 RT-PCR结果显示BGC-823细胞转染S100A4siRNA 48 h后,S100A4mRNA的表达量分别为:(0.674±0.011)、(0.652±0.021)、(0.345±0.040),正常对照组与干扰组相比差异有统计学意义(P =0.012,P＜0.05),阴性对照组与干扰组差异均有统计学意义(P =0.000,P＜0.05),正常对照组与阴性对照组差异无统计学意义(P =0.380,P＞0.05);Western blot结果显示BGC-823细胞转染S100A4 48 h后表达量明显下调分别为:(0.654±0.025)、(0.642 +0.014)、(0.317 +0.061),正常对照组与干扰组相比差异有统计学意义(P=0.01,P＜0.05),阴性对照组与干扰组差异均有统计学意义(P=0.000,P＜0.05),正常对照组与阴性对照组无统计学差异(P =0.341,P＞0.05).S100A4siRNA转染后人胃腺癌BGC-823细胞增殖下降;TUNEL法结果显示转染后凋亡明显增加;MTT结果表明人胃腺癌BGC-823单用奥沙利铂中效浓度IC50分别为56.31 μmol/L,转染后奥沙利铂中效浓度IC50为0.654 μmol/L.结论 本研究结果表明,siRNA沉默S100A4蛋白后抑制胃腺癌细胞增殖、诱导凋亡并提高奥沙利铂化疗敏感性,提示S100A4可能是治疗胃腺癌的有效靶点.     

靶向沉默维生素D受体基因对前列腺癌细胞迁移及侵袭性的影响

目的:探讨小干扰RNA靶向沉默维生素D受体(VDR)对前列腺癌PC-3细胞生物学行为的影响。方法:构建VDR-shRNA慢病毒载体,用RT-PCR和Western印迹法分别检测VDR的mRNA和蛋白表达水平;通过细胞划痕愈合实验和Transwell小室检测VDR被沉默后的PC-3细胞迁移能力和侵袭性的变化。结果:VDR-shRNA质粒显著干扰VDR表达,并成功筛选VDR-shRNA干扰稳定的细胞株;细胞划痕实验结果显示划痕愈合率VDR干扰组为59%明显低于空白对照组73.6%和LV3阴性对照组的77.8%,组间差异有显著性(P0.05),空白对照组和LV3阴性对照组组间差异无显著性(P0.05)。Transwell小室实验显示VDR干扰组透膜细胞数量明显低于空白对照组和LV3阴性对照组约为50%,细胞组间差异有显著性(P0.05),空白对照组和LV3阴性对照组组间差异无显著性(P0.05)。VDR干扰组细胞的迁移和侵袭能力明显低于对照组细胞。结论:VDR基因表达水平能影响前列腺癌细胞的迁移及侵袭能力,VDR低表达可致前列腺癌细胞迁移及侵袭能力下降。     

shRNA-Piezo1对异常机械牵张应力作用下髓核细胞凋亡的影响及相关机制

目的 :探讨短发夹RNA沉默压电离子蛋白1编码基因(shRNA-Piezo1)对异常机械牵张应力作用下髓核细胞凋亡的影响及相关机制。方法:取8例腰椎间突出症患者术中摘取的椎间盘组织(改良Pfirrmann分级为Ⅱ级或Ⅲ级),分别分离培养髓核细胞,取第2代髓核细胞构建体外机械牵张应力模型;利用293T细胞作为慢病毒感染靶细胞,检测最适慢病毒滴度,用最适滴度慢病毒感染髓核细胞;应用RT-PCR和Western-Blot法筛选出有效干扰序列,利用shRNA干扰技术构建shRNA-Piezo1干扰质粒;根据预实验处理结果,将细胞分成4组:空白对照组(取第2代髓核细胞不做机械牵张应力处理),牵张应力组(取第2代髓核细胞机械牵张应力处理24h),sh RNA阴性对照组(空白载体质粒+第2代髓核细胞机械牵张应力处理24h),shRNA干扰组(shRNAPiezo1干扰质粒+第2代髓核细胞机械牵张应力处理24h),应用Fluo3-AM试剂盒检测4组细胞的细胞质Ca~(2+)水平;Cell Meter检测试剂盒检测4组细胞中线粒体膜电位的变化;AnnexinV-FITC试剂盒检测4组细胞的凋亡率。结果:(1)分离培养的细胞Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan蛋白表达阳性,符合髓核细胞特征。(2)当髓核细胞转染复数(MOI)=50时,慢病毒滴度为1×10~8TU/ml转染效率最高。(3)homo-3201序列为shRNA-Piezo1的有效序列。(4)4组髓核细胞细胞质Ca~(2+)含量、线粒体膜电位翻转比例和细胞凋亡率有显著性差异(P0.05),空白组与shRNA阴性对照组比较无显著性差异(P0.05);shRNA干扰组与牵张应力组和shRNA阴性对照组比较均显著性减少(P0.05),与空白对照组比较无显著性差异(P0.05)。结论:shRNA-Piezo1可以抑制异常机械牵张应力作用下髓核细胞的过度凋亡,而且是通过抑制细胞质Ca~(2+)水平和线粒体膜电位翻转来实现的。     

HIF-1α基因沉默对人肝癌SMMC-7721细胞VEGF和MMP-2基因表达的影响

目的探讨缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)基因沉默对人肝癌SMMC-7721细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)基因表达的影响。方法构建HIF-1α基因的RNA干扰(RNAi)表达载体(HIF-1α-shRNA-pGenesil-1)和阴性对照载体(shRNA-HK-pGenesil-1),并将其与质粒结合。将人肝癌SMMC-7721细胞分为沉默组、阴性对照组和空白对照组,分别转染HIF-1α-shRNA-pGenesil-1重组载体、shRNA-HK-pGenesil-1重组载体和空载体pGenesil-1。转染细胞经浓度为500μg/mL的G418溶液筛选后获得带有转染重组载体的细胞克隆,分别于常氧、低氧6 h、低氧12 h及低氧24 h条件下培养,再采用实时定量逆转录聚合链式反应(RT-PCR)检测细胞中HIF-1α mRNA、VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达。结果常氧条件下,沉默组、阴性对照组和空白对照组细胞中均无HIF-1α mRNA的表达,且3组细胞中VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达水平比较差异均无统计学意义(P0.05)。低氧培养6、12及24 h时,沉默组细胞中HIF-1α mRNA、VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达水平均低于同时点空白对照组和阴性对照组(P0.05),但同时点空白对照组和阴性对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。与常氧条件对应组别比较,沉默组、阴性对照组和空白对照组各低氧条件组细胞中HIF-1α mRNA、VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达水平均较高(P0.05);低氧条件下,3组细胞中HIF-1α mRNA、VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达水平均呈下降趋势,同组内3个时点间两两比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论利用RNAi技术有效沉默人肝癌SMMC-7721细胞中HIF-1α基因的表达后,VEGF mRNA和MMP-2 mRNA的表达水平均降低,提示沉默HIF-1α基因可抑制原发性肝癌的浸润和转移。     

氧化还原酶基因对甲状腺乳头状癌细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨氧化还原酶基因(WWOX)对甲状腺癌细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 将携有WWOX基因的真核表达载体体外转染甲状腺乳头状癌细胞株K1(重组质粒组),筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染空载质粒(空质粒组)及未经转染(空白对照组)的K1细胞作为对照.合成针对WWOX的靶向小干扰RNA(WWOX siRNA组)转染甲状腺乳头状癌细胞株TPC-1,以空白细胞(空白对照组)和转染脂质体试剂(脂质体对照组)作为对照组.采用实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测转染前后WWOX基因mRNA水平.采用Western blot法分析WWOX基因对甲状腺乳头状癌凋亡相关蛋白的影响.结果 重组质粒组细胞中WWOX mRNA能稳定表达,是空质粒组及空白对照组细胞WWOX mRNA表达的4.5倍(P＜0.05).WWOX siRNA组WWOX mRNA表达明显下降,是对照组的0.2倍(P＜0.05).重组质粒组较空质粒组及空白对照组凋亡相关蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).相反,WWOX siRNA组与对照组比较,细胞凋亡相关蛋白表达明显下降(P＜0.05).结论 WWOX基因能促进甲状腺癌细胞的凋亡,其机制可能与激活线粒体凋亡信号通路有关.     

下调泛素蛋白连接酶E3A表达对三阴性乳腺癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨降低泛素蛋白连接酶E3A(UBE3A)的表达对三阴性乳腺癌细胞生物学行为的影响。方法:采用慢病毒载体分别将构建的3条UBE3A shRNA序列转染人三阴性乳腺癌细胞株MDAMB-231,检测干扰效率后,筛选出干扰效率最高的序列用于实验。分别采用CCK8法、Transwell小室实验、流式细胞术观察MDA-MB-231细胞经所选用的UBE3A shRNA序列转染后侵袭能力、增殖能力与细胞周期的变化,以转染阴性对照组序列和无处理的MDA-MB-231细胞作为阴性对照及空白对照。结果:成功构建UBE3A shRNA慢病毒表达载体并筛选出干扰率最高的UBE3A shRNA序列(UBE3A基因和蛋白表达抑制率分别为89.5%、45.3%)。与空白对照组细胞比较,下调UBE3A的MDAMB-231细胞的增殖、侵袭能力均明显降低,且细胞周期出现明显的S期阻滞(均P0.05);阴性对照组细胞各项观察指标无统计学差异(均P0.05)。结论:下调UBE3A表达能诱导三阴性乳腺癌细胞的细胞周期阻滞,从而抑制其增殖与侵袭能力,提示UBE3A在三阴性乳腺癌细胞的恶性生物学行为中发挥了重要作用。     

DNMT1和DNMT3b基因干扰对胰腺癌BxPC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察DNA甲基转移酶1(DNMT1)和DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)基因干扰对胰腺癌BxPC-3细胞增殖和凋亡的影响.方法 利用LipofectamineTM 2000转染DNMT1和DNMT3b小分子干扰RNA (siRNA)至胰腺癌BxPC-3细胞.实验共分5组:DNMT1干扰组(转染DNMT1-siRNA)、DNMT3b干扰组(转染DNMT3b-siRNA)、双重干扰组(转染DNMT1+ DNMT3b-siRNA)、阴性对照组(转染negative-siRNA)和空白对照组(转染脂质体).转染48 h后,应用荧光定量聚合酶链反应(PCR)法和Western blot法分别检测细胞中DNMT1、DNMT3b mRNA和蛋白的表达水平;噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞体外增殖活力;流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 与空白对照组和阴性对照组比较,各干扰组的DNMT1和(或)DNMT3b mRNA及蛋白表达量均显著降低(P＜0.01).DNMTI干扰组和双重干扰组的细胞生长抑制率分别为30.9％和28.3％,均显著高于DNMT3b干扰组的14.5％ (P＜0.01),而DNMT1干扰组和双重干扰组之间差异无统计学意义(P＞0.05).空白对照组、阴性对照组、DNMT1干扰组、DNMT3b干扰组和双重干扰组的细胞凋亡率分别为3.74％、5.07％、44.46％、24.20％和39.24％,各干扰组的细胞凋亡率均比对照组显著增加(P＜0.01),DNMT1干扰组与双重干扰组的细胞凋亡率均显著高于DNMT3b干扰组(P＜0.01),而DNMT1干扰组与双重干扰组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 DNMT1和(或)DNMT3b基因表达下调后,能抑制胰腺癌BxPC-3细胞生长,并能诱导细胞凋亡.DNMT1单干扰的抑癌作用优于DNMT3b单干扰,DNMT1和DNMT3b双重干扰无明显的协同效应.     

KAP-1对胰腺癌细胞Capan-2上皮细胞间质转化的促进作用

目的 研究KAP-1对胰腺癌细胞Capan-2上皮细胞间质转化(EMT)的调节作用.方法 构建LV-plenti-GFP-KAP-1慢病毒载体.将Capan-2细胞分为实验组(转染LV-plenti-GFP-KAP-1慢病毒载体)、阴性对照组(转染空载体)以及空白对照组1(含10％小牛血清的1640培养基);而后再将实验组Capan-2细胞分为抑制剂组(转染化学合成的miR-100-5p抑制剂)、空载体对照组(转染无关序列micro-RNAs抑制剂)、空白对照组2(含10％小牛血清的1640培养基).用双酶切及测序鉴定慢病毒并计算病毒滴度.LV-plenti-GFP-KAP-1慢病毒载体稳定转染至Capan-2细胞后,观察细胞的形态学改变.应用实时定量PCR检测各组细胞中KAP-1、EMT标志蛋白以及miR-100-5pmRNA的表达情况.应用Western blot法检测各组细胞中KAP-1、EMT标志蛋白表达水平.计量资料采用(x)±s表示,组间比较均采用方差分析.结果 成功构建LV-plenti-GFP-KAP-1慢病毒载体,病毒滴度为2×108 TU/ml.慢病毒载体转染Capan-2细胞48 h后,实验组细胞与对照组比较其形态有明显间质样改变.实验组、阴性对照组、空白对照组1细胞中各目标蛋白mRNA的相对表达量:KAP-1分别为1.77±0.83、5.03 ±0.29、5.13±1.14,N-钙黏蛋白分别为2.62 ±0.71、5.07 ±1.53、5.81 ±1.49,波形蛋白分别为2.50 ±0.21、3.83±0.57、4.92±0.90,E-钙黏蛋白分别为7.20±1.17、7.83 ±0.78、3.07±0.36,miR-100-5p分别为1.81 ±0.40、7.01 ±0.96、6.87±0.35,3组比较,差异有统计学意义(F=5.99,7.62,7.88,6.62,4.64,P＜0.05).抑制剂组、空载体对照组、空白对照组2细胞中KAP-1 mRNA的相对表达量分别为1.56 ±0.42、4.89 ±0.61、5.20 ±0.38,3组比较,差异有统计学意义(F=5.14,P＜0.05);波形蛋白mRNA的相对表达量分别为3.10±1.37、3.44 ±0.94、3.08±1.16,3组比较,差异无统计学意义(F=0.49,P＞0.05).Western blot检测结果表明:实验组、阴性对照组、空白对照组1细胞中各目标蛋白的相对表达量:KAP-1蛋白分别为2.77 ±1.99、0.83 ±0.46、0.71 ±0.26,N-钙黏蛋白分别为1.31 ±0.38、0.41 ±0.37、0.08 ±0.04,波形蛋白分别为4.25±0.63、1.03 ±0.33、1.37±0.92,E-钙黏蛋白分别为0.62 ±0.06、1.17 ±0.45、3.04±0.65,3组比较,差异有统计学意义(F=5.54,4.68,3.19,8.18,P＜0.05).抑制剂组、空载体对照组、空白对照组2细胞中KAP-1蛋白的相对表达量分别为2.27 ±0.71、0.56 ±0.43、0.61 ±0.39,3组比较,差异有统计学意义(F=4.81,P＜0.05);波形蛋白分别为3.19±0.55、3.93±0.06、3.61 ±0.73,3组比较,差异无统计学意义(F =0.04,P＞0.05).结论 KAP-1转录因子通过特异性调控其下游miR-100-5p表达,从而促进人类胰腺癌细胞Capan-2 EMT.     

微小RNA-29b-1*和微小RNA-29c对膀胱癌T24细胞增殖的影响

目的 观察微小RNA(miR)-29b-1*和miR-29c对膀胱癌T24细胞的活性和增殖的影响.方法 构建携带目标miRNAs干扰基因的慢病毒(pGCsil-H1-CMV-GFP)载体、阳性克隆的聚合酶链反应(PCR)鉴定.用293T细胞包装慢病毒形成慢病毒重组体,并用孔稀释法测定滴度.T24细胞中转染慢病毒重组体及转染效率测定.用噻唑蓝(MTT)比色法对4组处于对数生长期的实验组[空细胞对照组、转染阴性对照慢病毒细胞组、转染miR-29b-1*基因RNA干扰(RNAi)慢病毒细胞组、转染miR-29c基因RNAi慢病毒细胞组]进行连续5d的细胞增殖分析.结果 实时定量PCR(Real-time PCR)验证结果显示:T24细胞中miR-29b-1 *和miR-29c表达水平比较于空细胞组分别为3.47和4.40;MTT比色法显示,转染阴性对照慢病毒细胞组与空细胞对照组细胞比较,增殖受到轻度抑制;而转染miR-29b-1*、miR-29c基因RNAi慢病毒细胞组与染阴性对照慢病毒细胞组和空细胞对照组细胞比较,增殖均受到明显抑制,前者抑制效果更明显.结论 细胞增殖MTT法分析显示通过RNAi降低miR-29b-1*、miR-29c的表达均能引起T24细胞的增殖抑制.     

shRNA慢病毒表达载体对人结肠癌细胞CXCR7表达的影响

目的 探讨CXCR7的shRNA慢病毒表达载体对人结肠癌细胞HT-29 CXCR7表达的影响.方法 设计CXCR7的3条siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,分别与双酶切后的plVTHM载体连接,构建3种重组穿梭质粒plVTHM shRNA1,plVTHM shRNA2和plVTHM shR-NA3,并转化于DH5α感受态细胞,Amp筛选阳性克隆,抽取质粒行酶切鉴定并测序.分别将3种重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,生产慢病毒颗粒,并检测病毒滴度.将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别感染人结肠癌细胞HT-29,实时定量PCR和Western blot分别检测CXCR7 mRNA和蛋白的沉默效果.结果 酶切鉴定及测序结果 证实3种慢病毒载体均包装成功,滴度分别为6×107 TU/mL,4×107 TU/mL和5×107 TU/mL.感染HT-29后,CXCR7 mRNA及蛋白的表达量均较阴性对照组和未感染组明显降低(P＜0.05);其中以LV-CXCR7 shRNA-2和LV-CXCR7 shRNA-3作用显著,mRNA表达分别下调72%和67%,蛋白表达下调68%和55%(P＜0.05);而阴性感染对照组和未感染组相比差异无统计学意义(P＞0.05)结论 成功构建了3种CXCR7 shRNA慢病毒表达,可有效下调HT-29细胞CXCR7mRNA和蛋白的表达,其为进一步研究以CXCR7为靶点的结肠癌基因治疗提供稳定转染细胞的载体奠定基础.     

c-Met基因慢病毒载体的构建及其配体肝细胞生长因子对SW480细胞侵袭能力的影响

目的观察慢病毒介导的RNA干扰c-Met基因后肝细胞生长因子(HGF)对结肠癌细胞株SW480侵袭能力的影响。方法实验分为3组,正常对照组(NC组):正常目的细胞加sh RNA阴性对照病毒感染细胞(NC组又分为NC-20和NC-40 2个亚组,分别代表正常目的细胞感染sh RNA阴性对照病毒后在Transwell外室中分别加入浓度为20和40 ng/m L的HGF);c-Met基因敲除组(KD组):正常目的细胞加RNA干扰靶点病毒感染细胞(KD组又分为KD-20和KD-40 2个亚组,分别代表正常目的细胞感染目的基因sh RNA-c-Met病毒后在Transwell外室中分别加入浓度为20和40 ng/m L的HGF;KD1、KD2、KD3和KD4组分别表示针对目的基因不同的RNA干扰靶点,以挑选其中最有效的干扰靶点);空白对照组(CON组):正常目的细胞加未感染任何病毒的细胞。构建sh RNA-c-Met慢病毒表达载体,实时定量PCR(RT-PCR)筛选阳性克隆并测序鉴定;经慢病毒质粒包装后转染SW480细胞,转染48 h后,RT-PCR法检测SW480细胞中c-Met m RNA表达,Western blot法检测SW480细胞中c-Met蛋白表达水平;转染72 h后,采用流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力。结果 sh RNA-c-Met慢病毒表达载体构建成功;sh RNA-c-Met显著下调了SW480细胞中c-Met m RNA的表达,并且RNA干扰靶点病毒感染细胞第4靶点时的基因敲减效率最高(81.4%),为最有效靶点。Western blot检测结果显示,KD组SW480细胞中c-Met蛋白表达明显低于NC组(P=0.015)和CON组(P=0.010),KD组SW480细胞凋亡率明显高于NC组(P0.001)和CON组(P0.001)。细胞转移率在KD组、KD-20组和KD-40组均分别明显低于NC组(P0.001)、NC-20组(P=0.015)及NC-40组(P=0.017);与NC组比较,NC-20组和NC-40组的细胞转移率明显升高(P0.001、P0.001),且NC-40组的细胞转移率明显高于NC-20组(P=0.005);同样,与KD组比较,KD-20组和KD-40组的细胞转移率均明显升高(P0.001、P0.001),KD-40组的细胞转移率明显高于KD-20组(P=0.014)。结论以c-Met为靶点的RNA干扰能明显下调结肠癌细胞株SW480中c-Met的表达,c-Met的表达下调能明显增加细胞凋亡且能降低HGF对SW480细胞侵袭能力的影响。     

人分化抑制蛋白1慢病毒干扰载体的构建、筛选及其沉默效应的鉴定

目的探索以小干扰RNA（si RNA）慢病毒干扰载体组建的慢病毒对人Hep G2细胞分化抑制蛋白1（Id1）基因的沉默效应。方法构建4种针对Id1基因不同干扰靶点的Id1-siRNA慢病毒干扰载体（pCGSIL-GFPId1-1、pCGSIL-GFP-Id1-2、pCGSIL-GFP-Id1-3及pCGSIL-GFP-Id1-4）,将其转染至293T细胞,以筛选出针对Id1基因的最有效的RNA干扰（RNAi）靶序列。再以沉默效果最优的干扰载体进一步构建慢病毒（Id1-RNAi-LV）,感染人HepG2细胞后,采用实时定量PCR法和Western blot法分别检测其Id1 mRNA及其蛋白的表达水平。结果与pCGSIL-GFP-Id1-1组、pCGSIL-GFP-Id1-2组及p CGSIL-GFP-Id1-3组比较,pCGSIL-GFP-Id1-4组的Id1蛋白表达水平最低（P〈0.05）,沉默效果最优。以pCGSIL-GFP-Id1-4干扰载体组建慢病毒后,测得慢病毒的病毒滴度为2.0×10^9 TU/mL。与空白对照组和阴性对照组比较,以组建的慢病毒感染人HepG2细胞后,人HepG2细胞中Id1m RNA及其蛋白的表达水平均降低（P〈0.05）。结论本实验构建的特异性慢病毒可稳定地介导Id1基因的沉默。