牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿BP亚基单克隆抗体胶体金标记试纸条制备

目的 本研究通过优化牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿BP亚单位单克隆抗体的性能,制备胶体金标记检测牛乳腺炎无乳链球菌的试纸条。方法 利用pET30a(+)-BP重组质粒表达蛋白纯化物免疫小鼠,无菌取脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选杂交瘤细胞,制备单克隆抗体,对单克隆抗体进行胶体金标记后制备检测试剂盒,并确定其灵敏度、特异性等技术指标。结果 经数轮筛选,获得1株阳性杂交瘤细胞株,抗体效价达到1∶256 00。胶体金标记试纸条灵敏度量达到10⁶ CFU/mL。特异性测试结果表明,胶体金标记试纸条与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、副结核杆菌、化脓性链球菌培养物人工污染的牛乳样均无阳性反应,只与无乳链球菌乳样出现阳性结果。结论 该胶体金标记免疫层析试纸条,具有实际应用价值,将为牛乳腺炎的筛查检测提供新型、便捷的技术产品。     

寨卡病毒NS1蛋白的原核表达和单克隆抗体的制备

目的 高效表达和纯化重组的寨卡病毒NS1蛋白,制备抗NS1蛋白的单克隆抗体。方法 构建含有寨卡病毒NS1基因的原核表达质粒,利用大肠杆菌大量表达重组NS1蛋白,纯化蛋白后免疫小鼠并进行细胞融合,筛选制备高纯度的单克隆抗体。结果 在大肠杆菌中高效表达了重组NS1蛋白,重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,筛选出3株分泌针对寨卡病毒NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为6B8、7D11和3E2,纯化的单克隆抗体与重组NS1蛋白有良好的特异性反应。结论 利用重组NS1蛋白免疫制备了抗NS1的单克隆抗体,为后续建立针对NS1蛋白的ELISA检测方法及相关研究提供了基础。     

羊种布鲁菌16M LPS单克隆抗体制备与鉴定

目的 提取并纯化羊种布鲁菌16M的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),制备抗布鲁菌LPS的单克隆抗体。方法 采用酚水法提取羊种布鲁菌16M的LPS,通过冷甲醇二次沉淀纯化法纯化LPS,使用脂多糖定量检测试剂盒检测LPS的含量,通过SDS-PAGE及银染显色检测LPS的纯度。使用一定剂量纯化后的LPS皮下多点注射免疫Balb/c小鼠,通过间接ELISA法检测免疫小鼠血清效价,选取效价最高的小鼠进行腹腔注射免疫。取已免疫好的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在聚乙二醇1500的作用下进行细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株并冻存。选取10周龄雌性Balb/c小鼠腹腔注射阳性杂交瘤细胞株,待小鼠腹部明显胀大后收集腹水。对收集的腹水即获得的单克隆抗体进行效价分析,亚类测定,纯度检测及特异性试验。结果 提取的羊种布鲁菌16M的LPS浓度为1 mg/mL,纯度较高。制备的两株单克隆抗体的亲和常数分别为1.12×10⁹和1.11×10⁹,效价分别为1∶6 400和1∶12 800;亚类分别G3和G1,轻链类型均为κ型;纯度大于90%;均可以识别布鲁菌A、M抗原位点;均可与标准试管凝集抗原形成明显的凝集物;免疫荧光试验结果显示筛选的单抗均具有良好的反应原性,与羊种布鲁菌16M、牛种布鲁菌2308以及猪种布鲁菌S2孵育1 h后可见免疫荧光。结论 成功获得了2株羊种布鲁菌16M LPS单克隆抗体,其效价高、纯度好、敏感性高、反应原性强,为后续研究这2株单克隆抗体的特性,建立布鲁菌快速病原及抗体检测方法及研制布鲁菌快检试剂盒奠定基础。     

抗柯萨奇病毒A16型单克隆抗体的制备和应用

目的 制备抗CA16病毒的特异性单克隆抗体,评价单克隆抗体在ELISA和细胞免疫化学染色中的作用,并利用单抗建立CA16快速检测胶体金免疫层析法并对其进行初步评价方法 CA16病毒接种RD细胞大量培养,氯化铯密度梯度超速离心纯化病毒颗粒,透射电镜鉴定纯化产物。福尔马林灭活病毒颗粒后免疫Balb/c小鼠,利用细胞融合技术制备稳定分泌抗CA16单抗的杂交瘤细胞株。ELISA和免疫荧光试验分别对单抗特性进行分析。根据单抗反应特性,分析单抗在细胞ELISA、细胞免疫组化中的应用,并利用特异性抗CA16单抗建立CA16胶体金免疫层析快速检测法结果 氯化铯密度梯度离心纯化病毒颗粒电镜观察显示,病毒颗粒为二十面体立体对称球形结构,大小均匀。经免疫小鼠,获得1株稳定分泌抗CA16单克隆抗体的杂交瘤细胞株(mAb CA16-19),该单抗为IgG2a亚型,细胞免疫荧光表明,单抗与RD宿主细胞内的CA16病毒颗粒结合。细胞ELISA显示,随着病毒滴度增加吸光度也增加。细胞免疫化学染色分析表明,单抗可与CA16病毒感染的RD结合,而不与EV71感染RD细胞和正常RD细胞反应。因此,该单抗可用于细胞ELISA和细胞免疫化学染色。同时,依据前期制备的抗CA16单抗(mAb CA16-10),并结合此次制备的mAb CA16-19共同建立胶体金免疫层析试纸条,该试纸条不与EV71和柯萨奇病毒B型交叉反应,最低检测限为6.25×10^6.25TCID₅₀/0.1 mL结论 利用氯化铯密度梯度离心纯化出CA16病毒颗粒,筛选出1株特异性抗CA16单抗,此株单抗可用于细胞免疫荧光试验、细胞ELISA和细胞免疫化学染色试验。并以单抗为原材料建立了CA16快速检测胶体金免疫层析法,为CA16病毒感染的快速诊断提供帮助。     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64单克隆抗体的制备及其特异性

目的 制备结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白MPT64的单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并分析mAb的特异性。方法 PCR扩增mpt64基因并克隆入pET28a(+)构建原核表达载体;将获得的重组菌株在IPTG作用下诱导表达MPT64蛋白,Western blot验证蛋白表达;亲和层析法纯化目的蛋白。重组MPT64蛋白免疫小鼠,取脾细胞与杂交瘤细胞SP2/0融合,筛选得到阳性杂交瘤细胞系。以该杂交瘤细胞制备小鼠腹水,中压液相色谱仪纯化腹水获得mAb。ELISA法检测获得的mAb的相对亲和力和亚类,Western blot检测mAb的特异性。结果 本研究成功构建原核表达载体pET28a(+)-mpt64并诱导表达了MPT64蛋白。亲和层析法获得纯化的重组MPT64蛋白。该重组蛋白免疫小鼠的脾细胞和SP2/0细胞融合后,经筛选获得能够稳定分泌抗MPT64 mAb的杂交瘤细胞系MPT64-A5B2。中压液相色谱仪纯化小鼠腹水中的MPT64-A5B2 mAb。该mAb的亲和力为2.813×10^-7 g/mL,属于IgG 1亚类。MPT64-A5B2 mAb能特异性识别Mtb中的MPT64蛋白。结论 本研究制备了MPT64重组蛋白,并获得了抗MPT64 mAb,为MPT64用于结核病诊断和治疗制剂的研制奠定了基础。     

华支睾吸虫排泄分泌抗原McAb的制备及双抗夹心ELISA的初步建立

目的 以华支睾吸虫排泄分泌抗原(ESA)免疫小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体,并建立一种可检测ESA的双抗体夹心酶联免疫吸附试验的方法。方法 用ESA免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选杂交瘤细胞株,制备高效价单克隆抗体并鉴定;单抗经HRP标记和配对筛选,建立双抗夹心ELISA并分析其特异性及灵敏度。结果 成功制备出抗华支睾吸虫ESA McAb:B7、F1;抗体类型均为IgG₁,抗体滴度高,特异性好,以筛选到的两株单抗建立双抗夹心ELISA法,最佳线性范围为0.014~0.248 μg/mL(R²=0.996 9),最低检出限为0.014 μg/mL。结论 初步建立了检测华支睾吸虫ESA的免疫诊断方法。     

动物源性粪肠球菌Ebp菌毛亚单位蛋白多抗的制备及其对生物被膜形成的影响

目的 研究制备动物源粪肠球菌Ebp菌毛亚单位蛋白多克隆抗体及其可能的免疫学作用。方法 运用生物信息学软件对粪肠球菌菌毛EbpA、EbpB和EbpC蛋白的抗原表位进行预测,发现6个抗原表位,将其构建重组质粒,表达、纯化,免疫新西兰大白兔后获得了6个菌毛亚单位多克隆抗体,再进行抗体特异性和生物膜阻断分析。结果 6个菌毛亚单位重组蛋白与预测的分子量相符,均对新西兰大白兔具有免疫原性,EbpA1、EbpA2、EbpA3、EbpB1、EbpC1和EbpC2亚单位蛋白多克隆抗体效价经双向免疫琼脂扩散实验检测分别达到1∶16、1∶8、1∶32、1∶32、1∶64和1∶64。经WB检测和生物膜阻断试验,6个多克隆抗体均具有抗原特异性和野生菌株生物膜阻断作用,而且以EbpA1、EbpC1和EbpA3的生物膜阻断作用最强。结论 粪肠球菌EbpA1、EbpC1和 EbpA3亚单位蛋白可能为粪肠球菌免疫预防和治疗奠定基础。     

蓝氏贾第鞭毛虫α-19贾第素的单克隆抗体制备与亚细胞定位研究

目的 制备蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,简称贾第虫)α-19贾第素的特异性抗体,并通过免疫荧光对该贾第素的亚细胞定位进行鉴定。方法 经PCR获得α-19贾第素编码区片段,双酶切将目的 片段连入原核表达载体pET-28a(+)-α-19,重组载体转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE及 Western blot验证表达情况;采用设计的合成抗原肽免疫小鼠经细胞融合和筛选制备特异性单克隆抗体,分别用贾第虫滋养体裂解物和α-19贾第素重组蛋白Western blot验证抗体特异性和结合力,选择特异性最好的单克隆抗体通过免疫荧光技术对α-19贾第素的亚细胞定位进行观察。结果 成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-α-19,经SDS-PAGE及 Westernblot分析显示重组载体在大肠杆菌中表达出相对分子量约49 kD的重组蛋白,与理论值相符;Western blot显示单克隆杂交瘤细胞株α-19-3-7-3-5分泌的抗体结合力和特异性俱佳,可用于定位研究;免疫荧光定位结果表明α-19贾第素主要位于贾第虫滋养体的腹鞭毛。结论 制备了α-19贾第素的特异性单克隆抗体,免疫荧光显示α-19贾第素定位于贾第虫滋养体的腹鞭毛。     

寨卡病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备及性能评价

目的制备抗寨卡病毒衣壳(Capsid,C)蛋白的单克隆抗体,并对该抗体的性质进行初步分析。方法设计并合成寨卡病毒C蛋白多肽,将多肽与BSA偶联后免疫小鼠,采用细胞融合技术融合、筛选杂交瘤细胞株,制备抗寨卡病毒C蛋白的单克隆抗体,并应用ELISA、Western blot及免疫荧光等方法对抗体的反应效价、亚型和特异性进行分析。结果筛选获得1株与C蛋白具有良好结合活性的小鼠单克隆抗体9C1,属于IgM亚型,其重链约为50ku,轻链约为25ku,该抗体能够与寨卡病毒感染细胞后表达的C蛋白反应。结论筛选获得了抗寨卡病毒C蛋白的单克隆抗体,该抗体具有良好反应性和特异性,为开展C蛋白的功能和寨卡病毒病的相关防治方法奠定了实验基础。     

针对SARS-CoV-2核衣壳蛋白的单克隆抗体的制备和鉴定

目的 研制SARS-CoV-2的N蛋白单克隆抗体,并对其特异性识别真核表达N蛋白等特性进行鉴定,为下一步应用奠定材料基础。方法 利用大肠杆菌表达并纯化SARS-CoV-2重组N蛋白,制备并筛选分泌N蛋白特异性单克隆抗体的阳性B细胞杂交瘤,制备腹水后利用间接ELISA法测定单抗的效价、亚型和亲和力;通过Western blot、间接免疫荧光试验分析其与原核、真核表达SARS-CoV-2重组N蛋白的特异性结合能力;通过间接ELISA法评价其在不同冠状病毒N蛋白检测中的应用潜力。结果 成功地表达和纯化SARS-CoV-2重组N蛋白,筛选获得1株特异性识别重组N蛋白的单克隆抗体并命名为11F4,其亚型为IgG1,腹水效价为2.0×10⁷以上,亲和力为4.44×10⁸ M^-1;Western Blot分析表明其能与SARS-CoV-2重组N蛋白特异性反应,间接免疫荧光试验显示其能特异性识别HEK-293T细胞表达的SARS-CoV-2 N蛋白,表明该蛋白免疫反应性良好;间接ELISA法结果表明其可特异性识别真核细胞表达的SARS-...     

创伤弧菌溶细胞毒素单克隆抗体制备及其鉴定

目的制备创伤弧菌(Vibrio vulnificus)溶细胞素vvhA基因产物鼠源性单克隆抗体并鉴定其特异性和免疫性,为进一步研制创伤弧菌检测试剂盒奠定基础。方法采用IPTG诱导目的重组蛋白rvvhA表达,Ni-NTA亲和层析法提纯rvvhA,SDS-PAGE检测表达和提纯效果。采用杂交瘤技术和rvvhA-ELISA制备并筛选分泌rvvhA单克隆抗体的细胞株,有限稀释法进行细胞克隆。采用免疫双扩散法鉴定单克隆抗体类型。采用ELISA、免疫双扩散法和Western Blot鉴定单克隆抗体的效价和特异性。结果在0.5mmol/L IPTG诱导下,rvvhA产量可占细菌总蛋白的18%。提纯的rvvhA经SDS-PAGE后仅显示单一的蛋白条带。共获得9株rvvhA抗体阳性的杂交瘤细胞株,其中A5E8和C3B6株可持续分泌高效价特异性单克隆抗体,其抗体类型分别为IgG1和IgG2a。A5E8和C3B6单克隆抗体有较高特异性,与多种其它细菌蛋白不发生免疫反应,对rvvhA及创伤弧菌GTC333株和WZ01株蛋白的ELISA检测阳性的效价可达1∶4000~1∶8000、免疫双扩散效价为1∶4~1∶8,Western Blot结果显示此等单克隆抗体均能有效识别rvvhA。结论本研究成功地获得了2株稳定分泌rvvhA特异性单克隆抗体的鼠源性杂交瘤细胞株,rvvhA单克隆抗体可用于检测自然表达的创伤弧菌溶细胞素。     

抗粉尘螨主要变应原Der fⅡ单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备并鉴定鼠源抗粉尘螨主要变应原Der fⅡ单克隆抗体（Monoclonal Antibody,McAb）。方法重组Der fⅡ蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取小鼠免疫脾细胞与NS-1细胞融合。间接ELISA法筛选特异性分泌的杂交瘤细胞。用筛选获得的单克隆细胞株诱生小鼠腹水,蛋白G亲和层析法纯化腹水抗体。利用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型;通过间接ELISA、Western Blotting方法鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。结果获得5株IgG2a型鼠抗粉尘螨主要变应原Der fⅡ的单克隆抗体,效价良好。ELISA和Western Blotting分析表明该5株单抗均可识别重组Der fⅡ蛋白和天然粉尘螨提取物。结论成功制备了5株鼠抗粉尘螨主要变应原Der fⅡ的单克隆抗体,为建立粉尘螨主要变应原Der fⅡ的检测及纯化方法奠定了基础。     

Development of an immunofiltration-based antigen-detection assay for rapid diagnosis of Ebola virus infection

Ebola virus (EBOV) has caused outbreaks of severe viral hemorrhagic fever in regions of Central Africa where medical facilities are ill equipped and diagnostic capabilities are limited. To obtain a reliable test that can be implemented easily under these conditions, monoclonal antibodies to the EBOV matrix protein (VP40), which previously had been found to work in a conventional enzyme-linked immunosorbent assay, were used to develop an immunofiltration assay for the detection of EBOV antigen in chemically inactivated clinical specimens. The assay was evaluated by use of defined virus stocks and specimens from experimentally infected animals. Its field application was tested during an outbreak of Ebola hemorrhagic fever in 2003. Although the original goal was to develop an assay that would detect all EBOV species, only the Zaire and Sudan species were detected in practice. The assay represents a first-generation rapid field test for the detection of EBOV antigen that can be performed in 30 min without electrical power or expensive or sensitive equipment.     

空肠弯曲菌PEB1重组蛋白的表达及单克隆抗体的制备

目的表达CJPEB1重组蛋白,制备并鉴定CJ PEB1蛋白的单克隆抗体。方法诱导培养工程菌E．co-liBL21（DE3）表达CJPEB1重组蛋白,以PEB1蛋白溶液与等体积的佐剂完全乳化作为免疫原常规免疫BALB／C小鼠,制备单克隆抗体。无菌取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0进行融合,建立杂交瘤细胞株。将建株的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔诱生腹水制备抗体,应用间接ELISA法和双向琼脂扩散试验检测腹水中抗体的效价,应用Western-blot和玻片凝集试验检测抗体的特异性。结果得到高纯度的CJPEB1重组蛋白,蛋白质分子量大小与预计的理论值相符。获得两株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。两株杂交瘤细胞诱生的腹水,经间接ELISA法检测,腹水中的抗体效价分别为8×10^4和5×10^4,经双向琼脂扩散试验检测效价均为1：16。通过Westem-blot鉴定,两株杂交瘤细胞分泌的抗体均与PEB1蛋白特异性地结合;其诱生的腹水与CJ菌液混合出现凝集现象,而与大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌等菌液混合均未出现凝集现象。结论成功建立了两株稳定分泌抗CJPEB1重组蛋白抗体的杂交瘤细胞株并制备了抗CJPEB1蛋白的单克隆抗体,为今后研究多种检测CJ的方法创造了条件。     

Vesicular stomatitis virus-based Ebola vaccines with improved cross-protective efficacy

For Ebola virus (EBOV), 4 different species are known: Zaire, Sudan, C?te d'Ivoire, and Reston ebolavirus. The newly discovered Bundibugyo ebolavirus has been proposed as a 5th species. So far, no cross-neutralization among EBOV species has been described, aggravating progress toward cross-species protective vaccines. With the use of recombinant vesicular stomatitis virus (rVSV)-based vaccines, guinea pigs could be protected against Zaire ebolavirus (ZEBOV) infection only when immunized with a vector expressing the homologous, but not a heterologous, EBOV glycoprotein (GP). However, infection of guinea pigs with nonadapted wild-type strains of the different species resulted in full protection of all animals against subsequent challenge with guinea pig-adapted ZEBOV, showing that cross-species protection is possible. New vectors were generated that contain EBOV viral protein 40 (VP40) or EBOV nucleoprotein (NP) as a second antigen expressed by the same rVSV vector that encodes the heterologous GP. After applying a 2-dose immunization approach, we observed an improved cross-protection rate, with 5 of 6 guinea pigs surviving the lethal ZEBOV challenge if vaccinated with rVSV-expressing SEBOV-GP and -VP40. Our data demonstrate that cross-protection between the EBOV species can be achieved, although EBOV-GP alone cannot induce the required immune response.     

T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus

The glycoproteins (GP) of enveloped viruses facilitate entry into the host cell by interacting with specific cellular receptors. Despite extensive study, a cellular receptor for the deadly filoviruses Ebolavirus and Marburgvirus has yet to be identified and characterized. Here, we show that T-cell Ig and mucin domain 1 (TIM-1) binds to the receptor binding domain of the Zaire Ebola virus (EBOV) glycoprotein, and ectopic TIM-1 expression in poorly permissive cells enhances EBOV infection by 10- to 30-fold. Conversely, reduction of cell-surface expression of TIM-1 by RNAi decreased infection of highly permissive Vero cells. TIM-1 expression within the human body is broader than previously appreciated, with expression on mucosal epithelia from the trachea, cornea, and conjunctiva--tissues believed to be important during in vivo transmission of filoviruses. Recognition that TIM-1 serves as a receptor for filoviruses on these mucosal epithelial surfaces provides a mechanistic understanding of routes of entry into the human body via inhalation of aerosol particles or hand-to-eye contact. ARD5, a monoclonal antibody against the IgV domain of TIM-1, blocked EBOV binding and infection, suggesting that antibodies or small molecules directed against this cellular receptor may provide effective filovirus antivirals.     

Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1血清型特异性单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备并鉴定Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1(DV2-NS1)的血清型特异性单克隆抗体。方法以具有良好抗原性的重组DV2-NS1蛋白与灭活的Ⅱ型登革病毒(DV2)混合免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞经间接ELISA法、IFA法筛选,ELISA、IFA及WesternBlot对mAbs的类型及亚类、交叉实验及特异性等进行鉴定。结果免疫的Balb/c小鼠经多次融合筛选,共获得14株血清型特异性抗DV2-NS1蛋白的mAbs,其亚类测定两株为IgG2b,余均为IgG1。ELISA和免疫印迹显示这些mAbs与重组DV2-NS1蛋白和DV2抗原均特异性结合,IFA结果显示这14株单抗特异结合Ⅱ型登革病毒,与其它3型登革病毒无交叉。结论成功获得了特异性针对DV2-NS1蛋白的mAb,为进一步研究NS1蛋白的结构和功能以及研制早期诊断试剂奠定基础。     

抗狂犬病病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗狂犬病病毒N蛋白单克隆抗体,为建立快速准确的狂犬病病毒抗原检测方法奠定基础。方法将狂犬病病毒Flury LEP株N基因克隆至pGEX-6P-1表达载体中,将纯化后的pGEX-6P-1-RV-N蛋白免疫BALB/c小鼠3次。取小鼠脾脏细胞和SP2/0细胞融合后,用pET-32a-RV-N重组蛋白作为筛选抗原,经3次亚克隆筛选后得到1D9、2B6、3C5、6B5及5F2 5株单克隆抗体细胞株。亚类鉴定结果表明,其中1D9、2B6、6B5 3株亚类为IgG1,3C5、5F2的亚类为IgM。间接ELISA方法检测2B6单抗细胞腹水效价可达1∶106。经Protein G亲和层析柱纯化和脱盐后可得到浓度为2.5mg/mL的高纯度的单克隆抗体。其免疫荧光试验结果表明5株单克隆抗体均能特异地与狂犬病病毒结合。结论制备的单抗具有良好的特异性和敏感性,为后期诊断方法的建立奠定了基础。     

拮抗型抗hTNF-α单克隆抗体的筛选和活性鉴定

目的 制备和筛选拮抗型人肿瘤坏死因子-α（hTNF-α）单克隆抗体（McAb）并检测其活性,为临床靶向治疗提供理论依据.方法 用经典免疫方法获得抗hTNF-α McAb,经接种于小鼠腹腔后获得腹水,采用硫酸铵沉淀和蛋白G亲和层析法纯化得到纯度〉95%的抗hTNF-α McAb,采用ELISA方法测定效价、抗体亚型和亲和力,MTT法测定抗体阻断hTNF-α对L929细胞的细胞毒作用和筛选拮抗型抗hTNF-α McAb,流式细胞仪法测定抗体阻断hTNF-α诱导L929细胞凋亡的作用.结果 获得1株能稳定分泌抗hTNF-α McAb的杂交瘤细胞株XB10,分泌的抗体亚型为IgG2b;该抗体能高亲和性与hTNF-α结合,特异性阻断hTNF-α对L929细胞的细胞毒作用和抑制细胞凋亡,并呈一定剂量依赖性.结论 成功制备能稳定分泌拮抗型抗hTNF-α的McAb的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体对hTNF-α有特异性拮抗作用,为今后研制临床治疗型抗hTNF-α的基因工程抗体奠定了实验基础.