荔枝核总黄酮对结肠癌细胞株HT29的抑制作用及相关机制

目的:探讨不同浓度的荔枝核总黄酮(total flavone of Litchi Semen,TFLS)对人的结直肠癌细胞株HT29的体外抑制作用及对该细胞系中核转录因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB);Toll样受体4(Toll-like receptors,TLR4);白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL~(-1)β)mRNA和蛋白表达的影响。方法:体外培养HT29细胞株,给予TFL(0,0.16,0.32,0.64,1.28,2.56 g·L~(-1))干预,给药后24,48,72 h,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分别检测TFLS对HT29增殖的影响,采用逆转录PCR检测各组NF-κB,TLR4,IL~(-1)βmRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测NF-κB,TLR4,IL~(-1)β蛋白表达情况。结果:MTT检测结果显示TFL对HT29增殖呈良好的时间依赖性和剂量依赖性,以作用72 h,质量浓度为2.56 g·L~(-1)抑制率最高。与空白组比较,TFL组作用72 h后,HT29细胞系中NF-κB,IL~(-1)β基因和蛋白表达水平均降低,尤以TFL 0.64,2.56 g·L~(-1)组较明显(P0.05)。TFL组TLR4基因表达较空白组差异明显(P0.05),蛋白表达差异不明显。结论:TFL在体外对HT29细胞系的增殖具有抑制作用,NF-κB可能为TFL抑制HT29细胞系增殖的关键因子。     

黄连解毒汤对Aβ25-35诱导的HT22细胞NF-κB活化及炎症因子水平的影响

目的:探讨黄连解毒汤对β-淀粉样蛋白25-35(β-amyloid protein 25-35,Aβ_(25-35))诱导的HT22细胞核转录因子-κB(NF-κB)活化及炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β),IL-6,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响。方法:培养HT22细胞,HT22细胞分为空白组、模型组、多奈哌齐组(0.000 9 g·kg-1)和黄连解毒汤低、高剂量组(2.7,8.1 g·kg-1),空白组、模型组加入空白血清,各药物组分别加入含药血清1 h后,模型组和各药物组细胞分别加入Aβ_(25-35)(40μmol·L-1),24 h后运用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测p-NF-κB p65表达水平;免疫荧光法检测分析各组NF-κB p65核移位情况;用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测IL-1β,IL-6,TNF-α蛋白含量及实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测IL-1β,IL-6,TNF-αmRNA的表达情况。结果:与空白组比较,模型组的IL-1β,IL-6,TNF-α蛋白分泌及其mRNA表达增多,NF-κB活化水平增高(P0.05);与模型组比较,黄连解毒汤低、高剂量组及多奈哌齐组的炎性因子及mRNA表达量均减低(P0.05),并且能抑制NF-κB活化。结论:黄连解毒汤可降低Aβ_(25-35)诱导HT22细胞炎症反应,从而减轻Aβ_(25-35)神经毒性作用,作用机制可能与抑制NF-κB活化有关。     

萆薢总皂苷对尿酸钠诱导THP-1细胞Toll样受体/核转录因子-κB(TLR/NF-κB)信号通路的影响

目的:研究萆薢总皂苷(TSD)对尿酸钠(MSU)诱导THP-1细胞Toll样受体/核转录因子-κB(TLR/NF-κB)信号通路的影响,探讨其抗痛风性关节炎的可能作用机制。方法:佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞,分为正常组,模型组,TSD低、中、高质量浓度组(1,3,10 mg·L~(-1))和秋水仙碱组(0.2 mg·L~(-1)),除正常组外,其余各组均用400 mg·L~(-1)MSU刺激6 h,诱导体外炎症反应。噻唑蓝(MTT)比色法检测TSD对细胞活力影响;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞上清液炎性因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的分泌水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测TLR4,髓样分化因子88(MyD88)及NF-κB蛋白表达;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测TLR4,NF-κB及IL-1β前体(Pro-IL-1β)mRNA表达水平;免疫荧光法检测NF-κB p65的核位移情况。结果:0～32 mg·L~(-1)TSD对细胞活力基本无影响;与正常组比较,模型组炎性因子TNF-α及IL-1β的分泌水平显著升高(P0.01),通路关键蛋白(TLR4,MyD88及NF-κB)和基因(TLR4,NF-κB及Pro-IL-1β)的表达显著升高(P0.01);与模型组比较,1～30 mg·L~(-1)TSD可显著下调炎性因子TNF-α及IL-1β的分泌(P0.01),通路关键蛋白(TLR4,MyD88及NF-κB)和基因(TLR4,NF-κB及Pro-IL-1β)的表达明显降低(P0.05,P0.01),细胞核内NF-κB p65叠加减少,部分转位至胞浆,抑制NF-κB p65核转位。结论:TSD可能通过下调TLR4,NF-κB及Pro-IL-1βmRNA的表达,减少炎性因子TNF-α及IL-1β分泌而发挥抗炎作用。     

黄芩苷对HT-29细胞炎症模型PI3K/NF-κB信号通路的影响及机制探讨

目的:观察黄芩苷对人结肠癌上皮细胞株HT~(-2)9的炎症模型中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的影响,并探讨其机制。方法:以肿瘤坏死因子(TNF)-α及脂多糖(LPS)共同诱导HT~(-2)9细胞,建立细胞炎症模型。实验分为6组,空白组加入完全培养基孵育,实验过程中不予任何药物干预,模型组给予h TNF(20μg·L~(~(-1)))黄芩苷孵育12 h后,再给LPS(1 mg·L~(~(-1)))孵育15 h;柳氮磺胺吡啶组在模型组的基础上,加入柳氮磺胺吡啶(SASP,500μmol·L~(~(-1)));黄芩苷组在模型组基础上给予不同剂量(1,10,100μg·L~(~(-1)))黄芩苷孵育24 h。噻唑蓝(MTT)法检测黄芩苷(1,10,100μg·L~(~(-1)))对细胞生长的影响;免疫印迹(Western blot)法检测黄芩苷(1,10,100μg·L~(~(-1)))对PI3K,Akt,NF-κB等蛋白表达,酶联免疫吸附(ELISA)法检测黄芩苷(1,10,100μg·L~(~(-1)))对细胞上清中TNF-α,白细胞介素(IL)-6等含量的影响。结果:与模型组比较,黄芩苷组、柳氮磺胺吡啶组的细胞上清液中TNF-α,IL-6,IL-8,IL~(~(-1))分泌量明显减少(P0.05),且两药联合应用对TNF-α,IL-6,IL-8,IL~(~(-1))分泌量的减弱效应更强(P0.01)。与模型组比较,黄芩苷组(1,10,100μg·L~(~(-1))),柳氮磺胺吡啶组(500μmol·L~(~(-1)))中的PI3K蛋白磷酸化水平,Akt磷酸化水平,NF-κB活化入核水平,环氧化酶~(-2)(Cox~(-2))蛋白,β-连环蛋白(β-catenin)蛋白,天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)蛋白,人凋亡相关因子配体(Fas L)蛋白表达均明显减少(P0.05)。结论:黄芩苷能减轻HT~(-2)9细胞炎症反应,抑制PI3K磷酸化,下调Akt的活化,抑制NF-κB的活化入核,从而抑制TNF-α,IL-6等炎症因子的分泌,发挥其抗炎效应,提示黄芩苷可能通过以抑制Akt的活化,抑制NF-κB的核转位,发挥其抗炎作用。     

黄芩苷通过IκBα/NF-κB通路调节Aβ_(25-35)诱导的HT22细胞凋亡

目的探讨黄芩苷通过IκBα/NF-κB通路调节Aβ25-35诱导的HT22细胞凋亡。方法将HT22细胞分为空白组、模型组(40μmol/L Aβ_(25-35))、黄芩苷组(50μmol/L),多奈哌齐组(20μmol/L),给药组预处理1 h后加入Aβ_(25-35)。24 h后,MTT检测细胞存活率并观察细胞形态,Annexin V-FITF/PI检测细胞凋亡,Western blot法检测p-IκBα、p-NF-κB、TNF-α, IL-1β蛋白表达。结果与模型组比较,黄芩苷组与多奈哌齐组的细胞形态较完整、细胞密度较高、细胞间隙较小,细胞存活率升高(P0.01),细胞凋亡率降低(P0.01);p-IκBα,p-NF-κB, TNF-α, IL-1β蛋白表达较低(P0.05,P0.01)。结论黄芩苷可能通过抑制由Aβ_(25-35)激活的IκBα/NF-κB通路,减少TNF-α, IL-1β分泌,从而以减少神经元的凋亡,提高细胞的存活率。     

柚皮素对Aβ25-35损伤PC12细胞氧化应激及Tau蛋白磷酸化的影响

目的:探讨柚皮素对β淀粉样蛋白(Aβ)_(25-35)损伤大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞氧化应激及Tau蛋白磷酸化的影响及其与雌激素受体(ER)及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的关系。方法:采用Aβ_(25-35)干预PC12细胞制备损伤模型。实验分为空白组、模型组、柚皮素(400,40,4,0.4,0.04,4×10~(-3),4×10~(-4),4×10~(-5)μmol·L~(-1))组、阳性药雌二醇(E2)(1 nmol·L~(-1))+Aβ_(25-35)组、柚皮素(0.4,0.04,4×10~(-3),4×10~(-4),4×10~(-5)μmol·L~(-1))+Aβ_(25-35)组,E2+Aβ_(25-35)+ER拮抗剂(ICI182780)(1μmol·L~(-1))组,柚皮素+Aβ_(25-35)+ICI182780组,E2+Aβ_(25-35)+PI3K阻断剂(LY294002)(50μmol·L~(-1))组、柚皮素+Aβ_(25-35)+LY294002组。噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖率,2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)作为荧光探针检测细胞中总活性氧(ROS)含量,硫代巴比妥酸(TBA)法和氧化酶法分别检测细胞中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组细胞中磷酸化Tau蛋白/总Tau蛋白(p-Tau/t-Tau)的表达。结果:根据MTT实验结果,筛选0.4μmol·L~(-1)为柚皮素最佳有效浓度;与空白组比较,模型组细胞增殖率显著降低(P0.01),与模型组比较,柚皮素+Aβ_(25-35)组细胞增殖率显著升高(P0.01)。此外,与空白组比较,模型组细胞中ROS,MDA的含量及p-Tau/t-Tau表达显著升高(P0.01),SOD活性显著降低(P0.01),与模型组比较,柚皮素+Aβ_(25-35)组细胞中ROS,MDA的含量及p-Tau/t-Tau表达显著降低(P0.01),SOD活性显著升高(P0.01),与柚皮素+Aβ_(25-35)组比较,ICI182780,LY294002的加入显著逆转了柚皮素在上述指标中的作用(P0.01)。柚皮素的作用效果与E2相似。结论:柚皮素可提高细胞增殖率,对Aβ_(25-35)损伤PC12细胞有保护作用,其作用可能是通过激活ER及PI3K/Akt信号通路降低Aβ_(25-35)损伤PC12细胞中ROS,MDA含量及p-Tau/t-Tau表达、促进SOD活性来实现的。     

喘可治对小鼠急性肺损伤TLR4/NF-κB/NLRP3通路的影响

目的:研究喘可治注射液对脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤(ALI)的防治效果及作用机制。方法:SPF级雌性C57BL/6J小鼠48只,随机分为正常组、模型组、地塞米松组、喘可治组,每组12只。喘可治组每只小鼠腹腔注射0.2 m L·d-1,1次/d,连续7 d;地塞米松组造模前3 d按1 mg·kg~(-1)腹腔注射,1次/d,连续3 d;模型组注射等剂量的生理盐水,正常组不作处理。除正常组外,第8天腹腔注射LPS 0.1 m L(0.5 g·L~(-1)),乙醚吸入麻醉后,各小鼠滴鼻LPS 25μL(0.5 g·L~(-1)),制作ALI模型。24 h后取材检测。酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-1β(IL~(-1)β),IL~(-1)8的含量;免疫组织化学染色检测核转录因子-κB(NF-κB)p65的蛋白表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肺组织p65,Toll样受体4(TLR4),Nod样受体蛋白3(NLRP3),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase)-1蛋白表达;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测肺组织p65和TLR4的mRNA表达。结果:与正常组比较,模型组小鼠血清TNF-α,IL~(-1)β,IL~(-1)8含量升高(P0.01),肺组织p65,TLR4,NLRP3,Caspase-1蛋白表达升高,p65和TLR4 mRNA的表达升高(P0.05);与模型组比较,喘可治组小鼠血清TNF-α,IL~(-1)β,IL~(-1)8含量降低(P0.01),肺组织p65,TLR4,NLRP3,Caspase-1蛋白表达降低,p65和TLR4 mRNA的表达降低(P0.05)。结论:喘可治注射液能有效改善LPS诱导的急性肺损伤小鼠肺组织的损伤程度,其机制可能通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路进而对肺组织起到保护作用。     

丹参有效成分对TGF-β1诱导的肺上皮细胞间质转化的影响

目的:通过建立肺上皮间质转化的体外模型,筛选出对肺纤维化有抑制作用的丹参活性成分。方法:设立丹酚酸A(10,20,40,80,160μmol·L~(-1))组,丹酚酸B(10,20,40,80,160μmol·L~(-1))组,丹参素(10,20,40,80,160μmol·L~(-1))组,丹参酮Ⅱ_A(10,20,40,80,160μmol·L~(-1))组及空白组作用于A549细胞,用细胞增殖与毒性检测法(MTS)检测这些有效成分对A549细胞的毒性作用,以筛选出丹参有效成分的安全浓度。在安全浓度范围下,再将细胞分为空白组,模型组,丹酚酸A组,丹酚酸B组,丹参素组及丹参酮Ⅱ_A组,用MTS法检测丹参有效成分对转化生长因子-β_1(TGF-β_1)诱导的A549细胞的增殖抑制作用;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测丹参有效成分对纤连蛋白(FN),I型胶原(COL-Ⅰ)表达的影响。综合以上结果,筛选出抑制作用较好的丹参有效成分,用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测对细胞E-钙粘(E-Cad)蛋白表达的影响。结果:与空白组比较,丹酚酸A 40μmol·L~(-1),丹酚酸B 160μmol·L~(-1),丹参素160μmol·L~(-1)对A549细胞具有毒性作用(P0.05)。在无毒浓度范围下,与模型组比较,丹酚酸A 10,20μmol·L~(-1),丹酚酸B 80μmol·L~(-1)在培养24 h后对TGF-β_1诱导的肺上皮细胞增殖有抑制作用(P0.05);培养72 h后,丹酚酸A 5,10,20μmol·L~(-1),丹酚酸B 40,80μmol·L~(-1)的抑制作用非常显著(P0.01)。ELISA结果显示,与空白组比较,模型组细胞FN,COL-Ⅰ的表达显著增加(P0.01);与模型组比较,丹酚酸A20μmol·L~(-1),丹酚酸B 40,80μmol·L~(-1)对FN,COL-Ⅰ的表达有明显抑制作用(P0.05);Western blot结果显示,与空白组比较,模型组细胞E-Cad的表达显著降低(P0.01);与模型组比较,丹酚酸A 20μmol·L~(-1),丹酚酸B 80μmol·L~(-1)时,细胞E-Cad的表达显著增加(P0.01)。结论:丹酚酸A,丹酚酸B对TGF-β_1诱导的上皮间质转化具有抑制作用,可能是治疗肺纤维化的有效成分。     

当归芍药散对AD细胞模型铜离子介导的Aβ聚集的影响

目的:以β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)和铜离子(Cu~(2+))络合物作用的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞为阿尔茨海默病(AD)模型,探讨Cu~(2+)对Aβ聚集方式和神经毒性的影响及当归芍药散对Cu~(2+)介导的Aβ毒性的AD细胞模型的影响。方法:将Aβ1-42(20μmol·L~(-1))与不同浓度硫酸铜(Cu SO4,20,40μmol·L~(-1))反应后用硫黄素T(Th T)染色法检测Aβ聚集状态,再进行Aβ1-42-Cu~(2+)组(20+20μmol·L~(-1)),当归芍药散组(1. 6,3. 2,6. 4 mg·L~(-1)) Th T染色检测Aβ聚集状态。培养SH-SY5Y细胞,分别孵育不同浓度的Aβ1-42(1. 25,2. 5,5,10,20,40μmol·L~(-1))及当归芍药散(1. 6,3. 2,6. 4,12. 8 mg·L~(-1)),24 h后行噻唑蓝(MTT)比色法确定Aβ1-42损伤浓度和当归芍药散保护浓度。随后将SH-SY5Y细胞分为空白组,Aβ1-42-Cu~(2+)组(20+20μmol·L~(-1)),当归芍药散组(20μmol·L~(-1)+20μmol·L~(-1)+1. 6 mg·L~(-1)),空白组加入培养基,共作用24 h后行MTT比色法检测细胞生存率,显微镜拍摄细胞形态,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测胞内胞外Aβ1-42聚集状况。结果:与Aβ1-42组比较,Cu~(2+)和Aβ1-42结合成更多更大的Aβ聚集物。与正常组比较,模型组细胞活力明显降低(P 0. 05,P 0. 01),增加细胞内外Aβ1-42聚集(P 0. 05,P 0. 01);与模型组比较,当归芍药散能提高Aβ1-42-Cu~(2+)损伤的SH-SY5Y的细胞生存率(P 0. 05,P 0. 01),减少胞外Aβ1-42蛋白(P 0. 05,P 0. 01)。结论:Cu~(2+)能够增加Aβ的聚集及毒性;当归芍药散能明显减轻Cu~(2+)介导的Aβ聚集导致的SH-SY5Y细胞损伤,使Aβ内吞,减少胞外Aβ聚集,提高细胞生存率。     

艳山姜挥发油对TGF-β1诱导人脐静脉内皮细胞间质转分化的保护作用

目的:研究艳山姜挥发油(EOFAZ)对转化生长因子-β_1(TGF-β_1)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)间质转分化的干预保护作用。方法:采用TGF-β_1(10μg·L~(-1),孵育48 h)诱导建立内皮-间质转化(End MT)细胞模型。实验分组为正常组,模型组(10μg·L~(-1)TGF-β_1),EOFAZ高剂量组(10μg·L~(-1)TGF-β_1+4μg·L~(-1)EOFAZ)及EOFAZ低剂量组(10μg·L~(-1)TGF-β_1+2μg·L~(-1)EOFAZ)。EOFAZ于造模前干预给药2 h,加入TGF-β_1共孵育复制End MT细胞模型。倒置显微镜下观察细胞形态,划痕实验分析细胞迁移能力,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测EOFAZ对内皮细胞特异性标志物血管内皮细胞钙粘素(VE-cadherin),间充质细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),锌指转录因子(Snail)及核转录因子-κB(NF-κB)p-p65蛋白表达的影响。结果:TGF-β_1诱导孵育后,细胞形态多呈长梭形,并可见明显的细胞丝状伪足,细胞间的紧密连接减少;划痕实验结果表明模型组细胞迁移能力增强(P0.01);VE-cadherin蛋白表达显著减少(P0.01),α-SMA,Snail,NF-κB p-p65蛋白表达量明显增多(P0.01)。EOFAZ高、低剂量组干预给药后,能够明显抑制TGF-β_1诱导的细胞迁移能力(P0.01),同时能增加VE-cadherin的表达,降低α-SMA,Snail及NF-κB p-p65蛋白的表达。结论:艳山姜挥发油对TGF-β_1诱导的HUVECs间质转分化具有干预保护作用,其机制与抑制NF-κB p65的磷酸化激活有关。     

木犀草素对Aβ25-35诱导神经元损伤的保护作用

目的:研究木犀草素对β淀粉样肽(Aβ25-35)损伤神经元的保护作用及其机制。方法:从BALB/c乳鼠大脑皮层培养原代神经元,实验设计为对照组,模型组(7μmol·L-1Aβ25-35),不同木犀草素给药治疗组(10~90μmol·L-1),孵育12 h,水溶性四氢唑盐(WST-1)法检测细胞存活率,Hoechst 33258/碘化丙啶(PI)双染检测细胞凋亡,Western blot检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白的表达,荧光酶标仪检测细胞内活性氧簇(ROS)水平,ELISA法检测细胞上清中白介素(IL)-10和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。结果:模型组细胞存活率为48.5%,与对照组相比显著降低(P0.05)。10,30,60,90μmol·L-1木犀草素给药组细胞存活率分别为60.8%,62.4%,71.7%,73.6%,选取60μmol·L-1木犀草素为后续实验浓度。60μmol·L-1木犀草素可以明显提高Aβ25-35损伤神经元的细胞活力,由48.5%增至71.7%(P0.01),并且能抑制神经元的凋亡。与模型组相比较,降低凋亡蛋白Caspase-3的过表达(P0.01);降低细胞内ROS,由模型组100.4%降至64.2%(P0.01)。与模型组相比,调节抗炎因子IL-10,给药组IL-10上调至634.8 ng·L-1,下调促炎因子TNF-α至176.7 ng·L-1(P0.01)。结论:木犀草素对Aβ25-35损伤神经元具有保护作用,其机制可能是抑制ROS水平,调节炎症因子从而达到抗凋亡作用。     

白桦脂酸对脂肪变性细胞RAGE/NF-κB/iNOS信号通路表达的影响

目的:探讨白桦脂酸(BA)对脂肪变性的LO2细胞的作用。方法:以梯度浓度(0,10,20,40,80,160,250μmol·L~(-1))的BA干预LO2细胞24 h,应用噻唑蓝(MTT)比色法观察各组细胞的活力,确定BA干预终浓度。设置空白组,模型组,二甲基亚砜组(DMSO组)和BA干预组(BA组);BA组依据干预终浓度又分为低、中、高浓度3个亚组。首先以含10%Lipid Mix 1培养基培养模型组,DMSO组及BA组的LO2细胞24 h建立非酒精性脂肪肝(NAFLD)离体模型,空白组以不含药培养基培养24 h。然后分别以含0.1%DMSO,20,40,80μmol·L~(-1)BA培养基干预DMSO组及BA低、中、高浓度组细胞24 h,正常组和模型组予不含药培养基继续培养24 h。干预结束后以油红O染色及尼罗红染色法观察各组细胞内脂滴沉积变化;免疫荧光法检测细胞内诱导型一氧化氮合酶(i NOS)蛋白表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞氧化应激相关蛋白糖基化终产物受体(RAGE),核转录因子-κB(NF-κB p65)和i NOS的表达。结果:80μmol·L~(-1)浓度以内的BA干预LO2细胞24 h对细胞无明显毒性作用。与空白组比较,模型组细胞内脂滴沉积明显增多,氧化应激相关蛋白RAGE,NF-κB p65和i NOS表达均明显增加(P0.05)。与模型组比较,DMSO组细胞内脂滴沉积与模型组相似,两组间各蛋白表达水平无明显差异;而BA组各组细胞内脂滴沉积则均明显减少,高浓度组细胞内RAGE,NF-κB p65及i NOS蛋白表达均明显减少(P0.05,P0.01)。结论:BA能显著改善LO2细胞内脂滴沉积,其机制可能通过抑制LO2细胞内氧化应激相关蛋白RAGE,NF-κB p65和i NOS的表达有关。     

甘草查尔酮A通过调控MAPK信号通路抑制MH7A细胞增殖并诱导凋亡

目的:探讨甘草查尔酮A(licochalcone A,LCA)对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(MH7A)增殖和凋亡以及相关炎性因子的影响,并揭示丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路与LCA调控MH7A细胞增殖和凋亡的关系。方法:培养MH7A细胞,将细胞分为空白组,LCA各浓度给药组(10,20,40μmol·L~(-1));采用噻唑蓝(MTT)比色法和DAPI染色检测MH7A细胞增殖情况;PI染色和流式细胞仪检测MH7A细胞周期,Annexin V/PI染色后流式细胞仪检测MH7A细胞凋亡情况。实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测LCA对炎症因子白细胞介素-1β(IL~(-1)β)mRNA的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测LCA对MAPK信号通路关键蛋白的影响,同时应用细胞外信号调节激酶(ERK)特异性抑制剂PD98059处理,观察磷酸化(p)-ERK和IL~(-1)β蛋白表达水平。结果:与空白组比较,LCA能剂量依赖性抑制MH7A细胞增殖,活细胞数量显著减少(P0.01),而进入细胞周期早期凋亡的细胞数量显著增多(P0.01)。此外,与肿瘤坏死因子-α(TNF-α,10μg·L~(-1))组比较,LCA能剂量依赖性逆转TNF-α导致的炎症因子IL~(-1)βmRNA表达的升高(P0.01)。与空白组比较,LCA能剂量依赖性的促进MAPK信号通路中关键蛋白ERK,氨基末端激酶(JNK)和p38的磷酸化表达(P0.01)。与PD98059组比较,ERK的剂量依赖性磷酸化作用被抵消,同时LCA 10,20μmol·L~(-1)对IL~(-1)β的抑制作用消失。结论:LCA能抑制MH7A细胞增殖和诱导其凋亡,可能与其促进MAPK通路相关蛋白磷酸化的表达继而抑制炎症因子的表达有关。     

二苯乙烯苷调控CREB/BDNF信号通路对Aβ25-35损伤的小鼠神经元突触的保护作用

目的:研究中药何首乌有效成分二苯乙烯苷(TSG)对β-淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)损伤的小鼠海马神经元的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法:小鼠海马神经元细胞分离自新生48 h内胎鼠大脑海马,培养9 d待神经元成熟后,采用免疫荧光法对其进行鉴定。将培养成熟的神经元细胞分为正常组、模型组(Aβ25-35孵育造模)和TSG组(Aβ25-35孵育造模后,分别加入TSG 6.25,12.5,25,50,100μmol·L~(-1))。细胞增殖毒性检测(CCK-8)试剂盒和乳酸脱氢酶(LDH)法检测各组细胞活性,免疫荧光法检测突触素-1(SYN-1)蛋白的表达,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测突触后膜致密蛋白-95(PSD-95)和突触体素(SYP)的含量,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)和脑源性神经营养因子(BDNF) mRNA的表达,免疫荧光法和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测CREB,磷酸化CREB(p-CREB)和BDNF蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组细胞存活率显著降低,LDH释放量显著增高(P0.01),SYN-1,PSD-95和SYP的含量明显降低(P0.05,P0.01),p-CREB和BDNF mRNA及蛋白的表达明显下调(P0.05,P0.01);与模型组比较,不同浓度TSG均可提高细胞存活率,降低LDH释放量(P0.05,P0.01),TSG对Aβ25-35造模的小鼠海马神经元细胞的最适治疗浓度为25μmol·L~(-1); 25μmol·L~(-1)TSG能够显著增强SYN-1的表达量(P0.01),明显提高PSD-95和SYP的含量(P0.05);上调p-CREB和BDNF mRNA及蛋白的表达(P0.05,P0.01),但对CREB mRNA及蛋白的表达无显著影响。结论:TSG对Aβ25-35损伤的小鼠海马神经元突触具有保护作用,其机制可能与促进CREB的磷酸化使p-CREB表达增多,并促进神经营养因子BDNF的释放有关。     

参苓白术散对脾虚湿困型溃疡性结肠炎大鼠结肠组织NF-κB p65，IκBα，IκKβ蛋白及mRNA表达的影响

目的:观察参苓白术散对脾虚湿困型溃疡性结肠炎(UC)大鼠结肠组织核转录因子-κB(NF-κB)抑制蛋白激酶(IκK)/NF-κB抑制蛋白(IκB)/NF-κB信号通路的影响,探讨参苓白术散改善UC的作用机制。方法:将48只Wistar大鼠按照随机数字表法分为正常组、模型组、参苓白术散(15.6 g·kg-1)组、奥沙拉嗪钠(0.68 g·kg-1)组,每组12只,脾虚湿困型UC大鼠模型采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌肠结合环境与饮食干预法复制,给药组连续灌胃14 d。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-6(IL-6)及白细胞介素-1β(IL-1β)含量,免疫组化和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组大鼠结肠组织中NF-κB p65,IκBα,IκKβ蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组大鼠结肠组织NF-κB p65,IκBα,IκKβmRNA表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠血清TNF-α,IL-6及IL-1β含量均显著升高(P0.01),结肠组织NF-κB p65,IκKβ蛋白和mRNA表达显著升高(P0.01),IκBα蛋白和mRNA表达显著降低(P0.01);与模型组比较,参苓白术散组和奥沙拉嗪钠组大鼠血清TNF-α,IL-6及IL-1β水平均显著下降(P0.01),结肠组织NF-κB p65,IκKβ蛋白和mRNA均显著下降(P0.01),IκBα蛋白和mRNA表达显著升高(P0.01)。结论:参苓白术散能明显下调脾虚湿困型UC大鼠结肠组织NF-κB p65,IκKβ,蛋白和mRNA表达,上调IκBα蛋白和mRNA表达;参苓白术散抑制UC大鼠IκK/IκB/NF-κB信号通路活化是其发挥肠黏膜保护作用的重要机制。     

Aβ损伤人脑微血管内皮细胞培养液对正常神经元凋亡的影响及通心络胶囊的干预作用

目的:通过β淀粉样蛋白(amyloidβ-protien,Aβ)损伤人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells,HBMEC)培养液对正常神经元凋亡的影响及通心络胶囊的干预作用研究,探讨通心络对HBMEC及脑神经元的保护作用及其可能作用机制。方法:实验分为空白组,正常组,模型组,Aβ损伤组,通心络组,石杉碱甲组,空白组为正常神经元组,正常组为正常HBMEC培养液培养神经元组,其余4组采用20μmol·L~(-1)Aβ诱导HBMEC损伤,其中通心络组提前干预(400 mg·L~(-1)通心络预处理6 h),石杉碱甲组提前干预(100 mg·L~(-1)石杉碱甲预处理6 h),取其损伤后的细胞培养液加到正常脑神经元中进行培养,实验结束检测神经元的凋亡情况及凋亡蛋白、基因表达。结果:Aβ损伤HBMEC后的培养液可加速脑神经元的凋亡,且较Aβ直接导致脑神经元凋亡严重,提前通过通心络干预的HBMEC培养液诱导脑神经元凋亡细胞减少,凋亡蛋白、基因表达均有降低(P0.05,P0.01),且优于西药石杉碱甲组(P0.05)。结论:老年性痴呆(AD)中HBMEC损伤可以进一步加速神经元的凋亡,而通心络保护HBMEC同时可起到保护脑神经元的作用,通心络胶囊对AD脑神经元及HBMEC具有双重保护作用。     

酸枣仁汤对慢性睡眠剥夺大鼠学习记忆及TLR4/NF-κB信号通路的影响

目的:基于Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路探讨酸枣仁汤改善睡眠剥夺诱导学习记忆障碍的作用机制。方法:将实验大鼠随机分为正常组、模型组、褪黑素组(2. 5×10~(-4)g·kg~(-1)·d~(-1))和酸枣仁汤组(12. 96 g·kg~(-1)·d~(-1)),除正常组外,其他各组构建慢性睡眠剥夺模型。各组连续给药28 d后,采用Morris水迷宫评价大鼠的学习记忆力,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠血清中白细胞介素-1β(IL-1β),白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达水平,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)法检测大鼠海马中TLR4,NF-κB p65及核转录因子抑制蛋白α(IκBα)的m RNA表达水平,采用免疫组化(IHC)检测大鼠海马中TLR4,IκBα,p-IκBα和NF-κB p65的蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠上平台潜伏期、游泳总路程和第1次抵原平台时间明显增加(P 0. 01),而穿越平台次数和目标象限时间显著减少(P 0. 01);与模型组比较,褪黑素组和酸枣仁汤组大鼠上平台潜伏期、游泳总路程和第1次抵原平台时间减少(P 0. 05,P 0. 01),而穿越平台次数和目标象限时间增加(P 0. 05,P 0. 01)。与正常组比较,模型组大鼠血清中TNF-α,IL-1β,IL-6表达水平显著升高(P 0. 01);与模型组比较,褪黑素组和酸枣仁汤组大鼠血清中TNF-α,IL-1β,IL-6表达水平下降(P 0. 05,P 0. 01)。与正常组比较,模型组大鼠海马中TLR4,NF-κB p65 m RNA及蛋白表达水平升高(P 0. 01),而IκBαm RNA及蛋白表达水平下降(P 0. 01)。与模型组比较,褪黑素组和酸枣仁汤组大鼠海马中TLR4,NF-κB p65 m RNA及蛋白表达水平降低(P 0. 05,P 0. 01),而IκBαm RNA及蛋白表达水平升高(P 0. 05,P 0. 01)。与正常组比较,模型组大鼠海马中p-IκBα的蛋白表达水平显著升高(P 0. 01);与模型组比较,褪黑素组和酸枣仁汤组大鼠海马中IκBα的蛋白表达水平升高(P 0. 05,P 0. 01)。结论:酸枣仁汤具有改善睡眠剥夺大鼠学习记忆的作用,其机制可能与其抑制海马中TLR4/NF-κB信号通路相关。     

复方龙脉宁对急性心肌梗死模型大鼠TLR4/MyD88/NF-κB p65信号通路的影响

目的:探讨复方龙脉宁汤对盐酸异丙肾上腺素诱导的心肌梗死大鼠模型的保护作用及其对Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子(MyD88)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的影响。方法:取雄性SD大鼠48只,随机分成6组:正常组,模型组,复方丹参滴丸组(0.072 9 g·kg~(-1)),复方龙脉宁低、中、高剂量组(0.36,0.71,1.43 g·kg~(-1))。采用背部皮下多点注射盐酸异丙肾上腺素的方法建立急性心肌梗死动物模型。采用苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠心肌组织病理学变化;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测大鼠血清中白细胞介素-1β(IL-1β),白细胞介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子-α(TNF-α),单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1),一氧化氮(NO)的含量;免疫组化法测定大鼠心肌组织中NF-κB激酶β抑制蛋白(IKKβ),NF-κB抑制蛋白α(IκBα)的表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠心肌组织中TLR4,MyD88,NF-κB p65蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠心肌损伤明显,血清中IL-1β,IL-6,TNF-α,MCP-1,NO含量明显升高(P0.05),心肌组织中IκBα蛋白表达水平明显降低(P0.05),心肌组织中IKKβ,TLR4,MyD88,NF-κB p65蛋白表达水平明显升高(P0.05);与模型组比较,复方龙脉宁低、中、高剂量组能明显改善大鼠心肌损伤,明显升高IκBα蛋白的表达(P0.05),明显降低血清中IL-1β,IL-6,TNF-α,MCP-1,NO的活性及心肌组织中IKKβ,TLR4,MyD88,NF-κB p65蛋白的表达(P0.05)。结论:复方龙脉宁对心肌梗死的保护作用,可能与调控TLR4/MyD88/NF-κB p65信号通路相关因子的表达有关。     

黄连-干姜提取物对溃疡性结肠炎小鼠结肠上皮TLR4/NF-κB信号通路的影响

目的:观察中药黄连、干姜的主要成分黄连素和6-姜烯酚对溃疡性结肠炎小鼠结肠上皮细胞炎症信号通路Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)的影响。方法:50只昆明种小鼠随机分为正常组,模型组,黄连素组(100 mg·kg^-1),6-姜烯酚组(100 mg·kg^-1),6-姜烯酚合黄连素组(200 mg·kg^-1),每组10只。采用2%葡聚糖硫酸钠口服2周建立溃疡性结肠炎小鼠模型,各组给予相应剂量的药物灌胃,正常组和模型组给予等量生理盐水,给药20 d后取血清及结肠组织样本,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清白细胞介素-1β(IL-1β),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测结肠上皮组织TLR4,NF-κB p65 mRNA和蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组小鼠结肠上皮组织TLR4,NF-κB p65 mRNA和蛋白表达量显著升高(P<0.01),血清IL-1β,TNF-α含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,6-姜烯酚组,黄连素组,6-姜烯酚合黄连素组小鼠结肠上皮组织TLR4,NF-κB p65 mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.01),血清IL-1β,TNF-α含量显著降低(P<0.01);三组间比较,6-姜烯酚合黄连素组作用力最强(P<0.01)。结论:6-姜烯酚、黄连素均能够抑制结肠组织炎症,减轻炎症损伤,治疗溃疡性结肠炎,黄连素和6-姜烯酚联合应用有显著的协同增效作用,其机制与抑制TLR4/NF-κB通路的过度活化进而调节肠道非可控性炎症有关。     

梓醇对纤维状Aβ1-42诱导的bEnd.3细胞凋亡及过度自噬的影响

目的:观察梓醇对纤维状β-淀粉样蛋白(amyliod-beta protein,Aβ_(1-42))诱导的小鼠脑微血管内皮细胞(b End.3)损伤的保护作用,并探讨其保护作用机制。方法:将b End.3细胞分为溶剂组,模型组(Aβ_(1-42)20μmol·L~(-1)),梓醇低、中、高浓度组(Aβ_(1-42)20μmol·L~(-1)+梓醇50,200,500μmol·L~(-1));噻唑蓝(MTT)比色法检测梓醇及其对Aβ_(1-42)诱导的b End.3细胞活性的影响;Hoechst33258染色法检测梓醇对Aβ_(1-42)诱导的b End.3细胞凋亡情况的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测自噬及凋亡相关蛋白(Beclin~(-1),LC3),B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),细胞色素-C(cytochrome-C),半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)及切割活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)的表达水平。结果:MTT显示,梓醇对b End.3细胞无毒副作用;MTT与Hoechst33258染色结果显示,与模型组比较,梓醇低、中、高剂量组能明显提高b End.3细胞活性,抑制Aβ_(1-42)介导的b End.3细胞凋亡(P0.05);Western blot显示,与模型组比较,梓醇预处理后,可明显降低Bax/Bcl-2,cytochrome-C/β-actin,cleaved Caspase-3/Caspase-3,Beclin~(-1)/β-actin,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(P0.05)。结论:梓醇可能通过抑制Aβ_(1-42)诱导的b End.3细胞凋亡及过度自噬发挥其神经保护作用。