弓形虫ROP16Ⅱ效应分子对宿主A549细胞基因表达谱的影响

目的 ROPl6在弓形虫入侵宿主细胞的过程中发挥着关键作用。为了提高ROP16对宿主细胞的分子功能的认识,本研究分析了ROP16_Ⅱ基因转染的A549细胞株的表达谱,筛选了新的候选基因,为揭示Ⅱ型弓形虫病的发病机制提供了依据。方法 通过表达谱芯片技术对过表达ROP16_Ⅱ的A549细胞株的表达谱进行研究,并从中筛选差异表达基因。利用ToppGene从差异表达基因中筛选候选基因,并通过RT-qPCR对获得的基因进行验证。结果 共获得了9 994个差异表达基因,其中上调的基因有4 293个,下调的基因有5 701个。将这些差异表达基因进行 GO 功能富集分类,主要涉及多种生物学过程,包括发育过程、生物调控、免疫应答和信号传导等过程。采用ToppGene筛选得到4个疾病候选基因,其中上调表达的有IL4R和STAT1;下调表达的有IL12RB1和IL2RG。RT-qPCR结果与表达谱芯片数据一致。结论 ROP16_Ⅱ入侵宿主细胞后影响宿主细胞基因表达谱,了解ROP16_Ⅱ的作用机制,对于更加全面地揭示Ⅱ型弓形虫病的发病机制具有重要意义。     

基于生物信息学探讨弓形虫ROP16Ⅰ对A549细胞表达谱的影响

目的 采用生物信息学对ROP16_Ⅰ基因转染的A549细胞株的表达谱芯片结果进行数据挖掘,寻找影响Ι型弓形虫疾病的差异表达基因,为揭示Ι型弓形虫疾病的发病机制提供依据。方法 通过生物信息学方法对过表达ROP16_Ⅰ的A549细胞株的表达谱进行研究,从中筛选差异表达基因。将得到的数据导入在线分析工具ToppGene和STRING中对差异表达基因进行筛选,同时进行GO 分析及KEGG分析。结果 本研究共获得了483个差异表达基因,其中上调的基因共有252个,下调的基因共有231个。ToppGene最终筛选得到CCL8、CXCL11、PIAS1及EIF2AK2等14个Ι型弓形虫相关的基因。GO分析和KEGG分析发现,这些候选基因与白介素IL-10、IL-4、IL-13信号通路,细胞因子-细胞因子受体相互作用通路及Toll样受体信号通路等相关。在蛋白-蛋白互作网络中,这14个候选基因恰好处于网络的最核心位置。结论 Ι型弓形虫疾病的发生可能与CCL8、CXCL11、PIAS1及EIF2AK2等基因密切相关。     

弓形虫ROP16_Ⅱ效应分子对宿主A549细胞基因表达谱的影响

目的 ROPl6在弓形虫入侵宿主细胞的过程中发挥着关键作用。为了提高ROP16对宿主细胞的分子功能的认识,本研究分析了ROP16_Ⅱ基因转染的A549细胞株的表达谱,筛选了新的候选基因,为揭示Ⅱ型弓形虫病的发病机制提供了依据。方法通过表达谱芯片技术对过表达ROP16_Ⅱ的A549细胞株的表达谱进行研究,并从中筛选差异表达基因。利用ToppGene从差异表达基因中筛选候选基因,并通过RT-qPCR对获得的基因进行验证。结果共获得了9 994个差异表达基因,其中上调的基因有4 293个,下调的基因有5 701个。将这些差异表达基因进行GO功能富集分类,主要涉及多种生物学过程,包括发育过程、生物调控、免疫应答和信号传导等过程。采用ToppGene筛选得到4个疾病候选基因,其中上调表达的有IL4R和STAT1;下调表达的有IL12RB1和IL2RG。RT-qPCR结果与表达谱芯片数据一致。结论 ROP16_Ⅱ入侵宿主细胞后影响宿主细胞基因表达谱,了解ROP16_Ⅱ的作用机制,对于更加全面地揭示Ⅱ型弓形虫病的发病机制具有重要意义。     

弓形虫RH株ROP16I/III基因缺陷虫株感染BALB/c鼠的致病性研究

目的 旨在深入研究弓形虫棒状体效应分子ROP16与虫株毒力及致病性的关系。方法 采用弓形虫ROP16_I/III基因敲除RH株(RH_ΔROP16)攻击感染BALB/c小鼠,在感染后不同时间点与野生株感染鼠比较,动态观察感染动物发病症状、存活时间; HE染色观察脑组织、肺组织病理学差异,qRT-PCR检测脾细胞炎性及抑炎细胞因子表达水平。结果 两组小鼠的发病症状无明显差异;经HE染色显微镜下观察小鼠肺部及脑部病理学改变亦未见无明显差异;qRT-PCR检测并用Graph pad分析两组虫株感染小鼠的脾细胞Arg-1、IL-10、IL-12、TNF -α及IFN-γ等细胞因子表达水平。数据表明在感染相同时间ROP16缺陷株感染小鼠Arg-1的表达量明显低于野生型虫株(P< 0.05);而IL-10、IL-12、TNF-α和IFN -γ的表达水平无统计学差异(P> 0.05)。结论 I型弓形虫RH株的ROP16_I/III并非是决定急性感染期弓形虫毒力的唯一效应分子;ROP16_I/III可诱导宿主Arg-1高表达,提示与巨噬细胞内虫体的增殖有关。     

基于GEO数据分析参与MERS-CoV感染致病的信号传导通路和关键分子

目的 基于基因表达谱芯片数据,筛选和分析中东呼吸综合症病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)感染人类呼吸道上皮细胞后的差异基因,确定参与致病的信号传导通路和关键分子。方法 在美国国立生物技术信息中心的Gene Expression Omnibus(GEO)数据库搜选MERS-CoV病毒感染支气管上皮细胞表达谱数据,使用在线分析工具GEOR分析MERS-CoV感染支气管上皮细胞正常组和感染组各种基因的表达情况,以具有统计学意义的在表达量上升或下降2倍以上的差异基因为研究对象,使用基因功能分析注释工具DAVID对差异基因进行基因本体分析和信号传导通路分析,使用STRING构建基因间相互作用网络,利用cytoscape筛选相互作用网络的关键基因。结果 对比感染与未感染组的基因表达,筛选到了差异基因1 553个,其中上调基因850个,下调基因703个。基因功能富集分析结果提示这些差异基因涉及免疫反应,炎症反应,凋亡过程,支气管纤毛形成和运动等多条信号传导通路。结论 研究MERS-CoV感染肺部支气管细胞基因表达谱,发现在细胞中起重要作用的多条信号通路的异常,筛选到多个关键基因,这些信号通路可能在病毒致病过程中起到重要作用。本研究将为揭示MERS-CoV 致病的分子机制提供帮助,为确定新的治疗靶标和策略提供数据。     

基于RNA-seq分析戊型肝炎病毒感染HepG2细胞后的差异表达基因

目的 研究戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)感染人肝癌细胞HepG₂前后,HepG₂细胞的相关基因表达变化,为初步探索HEV在宿主细胞内感染机制及致病机理奠定基础。方法 对HEV感染组HepG₂细胞和对照组HepG₂细胞的RNA进行高通量测序(RNA-seq技术),利用生物信息学方法对测序数据进行分析,对感染组和对照组的差异表达基因进行筛选、功能注释和通路富集分析。结果 以基因表达差异倍数在2倍及以上为标准,从感染组与对照组共筛选出差异表达基因132个,其中,感染组相比于对照组,上调表达基因127个,下调表达基因5个。Gene Ontology(GO)功能富集分析注释结果显示,差异表达基因主要富集在病毒防御反应、固有免疫应答、病毒基因组复制的负调控及干扰素应答等过程;主要行使RNA结合、蛋白结合、调节解旋酶活性、NAD+ ADP-核糖基转移酶的活性等分子功能。利用KEGG数据库作为参考,这些基因主要参与甲型流感、单纯疱疹感染、麻疹、C型肝炎、RIG-I样受体信号通路、病毒致癌、乙型肝炎、Toll样受体信号通路、胞质DNA传感通路、趋化因子信号转导通路和细胞凋亡等通路。结论 通过功能及通路筛选,发现DDX58、STAT1、CXCL8、STAT2、TLR3、CXCL10、EIF2AK2、IRF9和IFIH1等基因可能在HEV感染抗病毒免疫过程中发挥重要作用。     

CT检查在原发性肝癌患者经肝动脉化疗栓塞术后疗效评估中的应用价值分析

目的 探讨电子计算机断层扫描（CT）在原发性癌（PLC）患者经肝动脉化疗栓塞术（TACE）治疗后疗效评估中的应用价值。 方法 2015年10月~2016年12月行TACE治疗的92例PLC患者,在TACE术前后进行CT平扫及增强扫描,比较肝内病灶密度、强化方式、边界及大小变化,探讨CT检查对术后疗效评估的价值。 结果 在73例肿块型PLC患者,Ⅰ型碘油沉积22例（30.1%）,Ⅱ型40例（54.7%）,Ⅲ型8例（10.9%）,Ⅳ型3例（4.1%）,在19例结节型PLC患者,Ⅰ型碘油沉积14例（73.6%）,Ⅱ型4例（21.0%）,Ⅲ型1例（5.2%）;肿块型PLC患者TACE治疗后总有效率为95.5%（69/73）,结节型为94.7%（18/19）,两组差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 CT检查能有效评估PLC患者TACE治疗后的临床疗效,为临床制定进一步的治疗方案提供确切的影像学资料支持。     

BCG感染树突状细胞的转录组测序和分析

目的 通过转录组学筛选DC2.4细胞内BCG感染相关的差异表达基因和信号通路,为探索DC细胞抗分枝杆菌的胞内免疫机制提供科学依据。方法 以小鼠DC2.4细胞作为细胞模型,设置感染组和未感染组,感染组经BCG(MOI=2)感染,培养24 h后收集细胞,采用转录组测序技术(RNA-Seq)检测感染组和未感染组mRNA表达谱并结合生物信息学分析方法,筛选树突状细胞内与BCG感染相关的差异表达基因并进行qRT-PCR验证。结果 与未感染组相比,感染组差异表达基因共有27个(P<0.05),其中26个上调基因,1个下调基因。通过GO和KEGG富集分析发现差异基因参与炎症反应、免疫系统过程等;TNF信号通路、IL-17信号通路以及细胞因子与细胞因子受体信号通路等参与BCG胞内感染过程。qRT-PCR验证与BCG感染相关的差异表达基因与转录组数据趋势一致。结论 BCG感染树突状细胞后,能够激发宿主细胞炎症反应和免疫应答,TNF、IL-17等信号通路参与BCG胞内感染过程。     

鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡转录组学分析

目的 为了分析鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡后宿主基因表达水平的变化。方法 以鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡,收集肺脏进行高通量测序。结果 与对照组相比,感染组得到差异表达基因740个,其中上调基因有602个,下调基因有138个。GO条目分析发现,差异基因主要涉及免疫应答反应和炎症反应等。经KEGG 数据库比对注释及富集分析显示有7个通路富集显著,其中Toll-like信号通路有11个基因表达上调,分别为IL-6、TLR4、PIK3、IRF7、MD-2、IRF5、MYD88、CD86、STAT1、TLR2和CCL4,NOD-like受体信号通路有7个基因表达上调,分别为IRF7、CTSB、P2RX7、CYBB、PSTPIP1、HSP90AA1和NAMPT。结论 鸭源H7N9亚型病毒感染SPF鸡后,免疫相关基因表达明显增强。在Toll-like信号通路中, TLR4在MD-2的协助下被激活,随后依赖MYD88途径激活下游的IRF5,继而引起CCL4、IL-6显著表达。同时NLRP3炎症体在H7N9亚型病毒感染过程中也发挥着重要作用。     

弓形虫Ⅰ、Ⅱ型虫株ROP16基因重组表达载体的构建及其对A549细胞STAT3/6磷酸化水平的影响

目的探索弓形虫Ⅰ、Ⅱ型虫株ROP16在A549细胞中的功能。方法提取弓形虫Ⅰ(RH)、Ⅱ(ME49)型虫株总RNA,PCR扩增ROP16基因全长序列后克隆至真核表达载体pEGFP-N1,转染A549细胞,采用Western blot方法检测细胞中STAT3/6磷酸水平,采用实时荧光定量PCR检测IL-12、iNOS、ARG1mRNA表达水平。结果 PCR扩增Ⅰ、Ⅱ型虫株ROP16基因全长为2148bp。双酶切和测序验证重组载体构建正确,pEGFP-N1-RH ROP16和pEGFP-N1-ME49ROP16过表达载体转染A549细胞后ROP16mRNA表达水平较未转染组上调(P0.05,F=824.184,270.904),pEGFP-N1-ME49ROP16转染A549细胞p-STAT3/6表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P0.05,F=1.051,1.203),IL-12、iNOS mRNA与对照组表比呈高表达(P0.01,F=157.705,173.623)。pEGFP-N1-RH ROP16转染组相比A549细胞对照组p-STAT3/6表达水平上调(P0.05,F=121.227,68.324),IL-12mRNA表达下调(P0.01,F=186.397),ARG1mRNA表达上调(P0.01,F=126.236)。结论弓形虫Ⅰ型RH株ROP16蛋白具有激活p-STAT3/6作用,且能使ARG1 mRNA的表达上调,IL-12 mRNA的表达下调,而弓形虫Ⅱ型ME49虫株ROP16蛋白则无激活p-STAT3/6作用,但能使IL-12mRNA和iNOS mRNA的表达上调。     

弓形虫ROP16I/IIIDNA疫苗不能诱导小鼠有效的保护性免疫

目的利用ROP16_I/III基因真核表达重组质粒免疫BALB/c雌性小鼠,检测小鼠体液免疫和细胞免疫,评估ROP16_I/III作为潜在的分子疫苗的价值。方法克隆Chinese 1型弓形虫ROP16_I/III, 将其插入真核表达载体pEGFP-C2中构建重组质粒pEGFP-ROP16_I/III,脂质体法转染T293细胞并观察体外表达。Western blotting分析鉴定。将36只SPF级小鼠随机均分为:①PBS组;②空质粒组;③pEGFP-ROP16 _I/III组。每2周肌注免疫1次(100 μg/只),共3次;于免疫前及每次肌注前1 d和末次免疫后2周收集小鼠血清,间接ELISA法检测血清抗弓形虫IgG。于末次免疫2周后取小鼠脾脏,分离淋巴细胞培养测细胞因子。剩余小鼠腹腔注射Chinese 1型弓形虫 Wh3株速殖子1 000个/只,观察小鼠攻击感染后的存活时间和存活率。结果真核表达载体构建成功,体外见到重组质粒pEGFP-ROP16_I/III在T293细胞的表达;pEGFP-ROP16_I/III末次免疫后血清中IgG水平及脾淋巴细胞细胞因子均无明显升高(P>0.05);攻击感染后,免疫组小鼠比对照组的存活时间无延长(P>0.05);生物信息学分析发现ROP16_I/III缺乏线性B细胞表位。结论Chinese1 型弓形虫的ROP16_I/III由于其分泌的定位和结构特点,不能诱导小鼠产生有效的抗Wh3株攻击感染的免疫保护。     

Virulence differences in Toxoplasma mediated by amplification of a family of polymorphic pseudokinases

The population structure of Toxoplasma gondii includes three highly prevalent clonal lineages referred to as types I, II, and III, which differ greatly in virulence in the mouse model. Previous studies have implicated a family of serine/threonine protein kinases found in rhoptries (ROPs) as important in mediating virulence differences between strain types. Here, we explored the genetic basis of differences in virulence between the highly virulent type I lineage and moderately virulent type II based on successful genetic cross between these lineages. Genome-wide association revealed that a single quantitative trait locus controls the dramatic difference in lethality between these strain types. Neither ROP16 nor ROP18, previously implicated in virulence of T. gondii, was found to contribute to differences between types I and II. Instead, the major virulence locus contained a tandem cluster of polymorphic alleles of ROP5, which showed similar protein expression between strains. ROP5 contains a conserved serine/threonine protein kinase domain that includes only part of the catalytic triad, and hence, all members are considered to be pseudokinases. Genetic disruption of the entire ROP5 locus in the type I lineage led to complete attenuation of acute virulence, and complementation with ROP5 restored lethality to WT levels. These findings reveal that a locus of polymorphic pseudokinases plays an important role in pathogenesis of toxoplasmosis in the mouse model.     

Prevalent genotypes of Toxoplasma gondii in pregnant women and patients from Crete and Cyprus

Molecular genotyping has been used to characterize Toxoplasma gondii strains into the three clonal lineages known as types I, II, and III. To characterize T. gondii strains from Greece and Cyprus, polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis on the GRA6 gene was performed directly on 20 clinical samples from 18 humans (11 pregnant women, six patients with lymphadenopathy, and one patient positive for human immunodeficiency virus) and two rats. Characterization of T. gondii types was performed after digestion of amplified products with Mse I. The 20 strains were characterized as type II (20%) and type III (80%). Of these strains, 19 originated from the island of Crete (4 strains type II and 15 strains type III), and 1 from the island of Cyprus (type III). Although both type II and type III strains were found, type III was the most prevalent in Crete.     

弓形虫ROP2基因的克隆与鉴定

目的 体外扩增弓形虫棒状体分泌抗原2（ROP2）靶基因，构建真核表达载体pc-DNA3-ROP2。 方法 收集、纯化RH株弓形虫速殖子，提取基因组DNA；根据基因库ROP2基因序列设计合成1对引物，应用PCR扩增ROP2基因片段，回收纯化后克隆入TA载体质粒pUCm-T；用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切该重组子，将切下的ROP2基因在T4DNA连接酶作用下插入真核细胞表达载体质粒pc-DNA3，并进一步作双酶切、PCR及测序鉴定。 结果 以弓形虫基因组DNA为模板，PCR扩增出1.7 kb ROP2基因片段，克隆于pUCm-T载体中，再将ROP2基因亚克隆于真核表达载体质粒pc-DNA3，经筛选鉴定，构建pc-DNA3-ROP2重组质粒；测序结果显示，重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列，能完整表达ROP2的抗原蛋白。 结论 弓形虫ROP2基因片段，经TA克隆及亚克隆，构建弓形虫pc-DNA3-ROP2重组质粒。     

刚地弓形虫ROP2-P30复合重组蛋白疫苗对BALB／c小鼠免疫保护性的研究

目的用刚地弓形虫ROP2-P30复合重组蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠观察对机体的影响,为研制安全有效的弓形虫疫苗奠定基础。方法PCR方法从刚地弓形虫基因组中扩增出ROP2和P30片段,将这两个片段分别亚克隆至pET-30a原核表达载体中,表达出ROP2-P30复合重组蛋白。用蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠,ELISA检测免疫小鼠后体液中抗体和细胞因子的变化,观察攻击试验小鼠的的死亡率。结果ROP2-P30复合重组蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠诱导机体产生大量的IgM、IgG抗体和IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子。攻击试验表明,复合重组蛋白免疫组和对照组相比,小鼠的存活时间明显延长。结论ROP2-P30复合重组蛋白免疫BALB/c小鼠诱导其产生高水平的体液和细胞免疫应答,该复合重组蛋白是抗刚地弓形虫感染的候选疫苗之一。     

Identification of quantitative trait loci controlling acute virulence in Toxoplasma gondii

Strains of Toxoplasma gondii can be grouped into three predominant clonal lineages with members of the type I group being uniformly lethal in mice. To elucidate the basis of this extreme virulence, a genetic cross was performed between a highly virulent type I strain (GT-1) and a less-virulent type III strain (CTG), and the phenotypes of resulting progeny were analyzed by genetic linkage mapping. Analysis of independent recombinant progeny identified several quantitative trait loci that contributed to acute virulence. A major quantitative trait locus located on chromosome VII accounted for approximately 50% of the virulence phenotype, whereas a minor locus on chromosome IV, linked to the ROP1 gene, accounted for approximately 10%. These loci are conserved in other type I strains, indicating that acute virulence is controlled by discrete genes common to the type I lineage.     

弓形虫棒状体蛋白ROP16的研究进展

棒状体蛋白16（ROP16）是弓形虫棒状体蛋白家族成员, 其蛋白结构存在丝氨酸、 苏氨酸激酶区, 是弓形虫入侵 过程中的重要毒力因子。ROP16可分泌到宿主细胞核, 能磷酸化宿主细胞的转录活化因子STAT3/6, 干扰宿主细胞信号 通路传导, 在弓形虫入侵宿主细胞过程中发挥着重要作用。本文对弓形虫ROP16的发现、 功能、 免疫保护性等方面进行 综述。