结核分枝杆菌Rv3621c原核表达及免疫功能研究

目的 以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)H37Rv基因组为模板,构建、纯化及鉴定原核表达质粒pPROEX-Rv3621c,通过人群、小鼠试验进行免疫原性评价。方法 构建重组质粒pPROEX-Rv3621c,并以全血干扰素释放分析技术(Whole-blood IFN-γ release assay,WBIA)检测其能否被安徽省淮南市M.tb感染者T细胞特异性识别。rRv3621c混合佐剂MTM[母牛分枝杆菌(M.vaccae),人工合成海藻糖-6'6,二分枝菌酸(TDB),单磷酰脂质A(MPLA)]免疫小鼠后,检测血清中特异性抗体分泌水平、脾细胞中抗原特异性Th1型细胞因子分泌水平及肺脏细胞因子mRNA表达水平。结果 成功构建重组质粒pPROEX-Rv3621c,并使之诱导表达、纯化和鉴定。在rRv3621c蛋白诱导下,活动性结核(Active tuberculosis, ATB)患者外周血淋巴细胞释放的IFN-γ水平明显较高(t=4.813, P<0.01),且ATB患者产生的IFN-γ水平高于潜伏性结核(Latent tuberculosis infection, LTBI)人群(t=4.442, P<0.01)。BCG+Rv3621c/MTM组小鼠产生的特异性抗体滴度水平明显高于Rv3621c/MTM组(P<0.01)和BCG组(P<0.01),Rv3621c/MTM组和BCG+Rv3621c/MTM组小鼠的IgG2a/IgG1比值大于1,明显高于MTM组和BCG组。BCG+Rv3621c/MTM组小鼠均分泌高水平IFN-γ、TNF-α和IL-2。Rv3621c/MTM组小鼠肺脏组织中IFN-γ、TNF-α及iNOS表达水平较高。结论 M.tb感染者外周血T细胞可特异性识别rRv3621c蛋白,rRv3621c混合佐剂MTM可以诱导较强烈的抗原特异性Th1型免疫应答。     

结核分枝杆菌Rv3425-Rv1168c蛋白融合表达与血清学评价

目的 原核表达结核分枝杆菌Rv3425-Rv1168c融合蛋白并进行纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法评价重组蛋白在结核病血清学诊断中的价值。方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,通过重叠PCR扩增得到Rv3425-Rv1168c全核酸序列克隆至表达载体pET-24b中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,通过ELISA检测100份确诊结核病人、20例非结核呼吸疾病患者、100份健康人血清,评价融合蛋白进行临床血清学诊断的可行性。结果 Rv3425-Rv1168c融合蛋白在原核系统内获得高表达,纯化的融合蛋白经ELISA方法测定,在血清学实验中敏感性为54%,特异性为95%。结论 Rv3425-Rv1168c融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫原性,在结核病血清学诊断方面具有很大的应用价值。     

结核病诊断性血清学特异抗原的筛选和鉴定

目的 筛选和鉴定结核病患者血清抗体特异性识别的结核分枝杆菌抗原。方法 于改良罗氏培养基中培养结核分枝杆菌标准株H37Rv 4周,收集菌体,通过冰浴超声法提取结核分枝杆菌菌体抗原。收集2013年2—7月湖南省结核病防治所首次入院的30例初治结核病患者的血清,以及收集2013年7月湖南省人民医院检验科接收的20名健康体检者的血清。通过饱和硫酸铵沉淀法提取纳入的20例结核病患者的血清IgG,从结核分枝杆菌菌体抗原中免疫共沉淀血清学抗原,以纳入的其余10例结核病患者血清免疫印迹(Western blot,WB)验证其免疫反应性;从十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶上切割阳性反应的蛋白质条带,通过串联质谱技术进行鉴定。结果 免疫共沉淀获得1条相对分子质量为16000(16kDa)、能被结核病患者血清抗体特异性识别的蛋白质条带;经串联质谱鉴定,获得结核分枝杆菌热休克蛋白(heat shock protein,Hsp)16.3、糖基转移酶蛋白、铁调控Lsr2蛋白前体等3种蛋白抗原。结论 采用免疫共沉淀偶联质谱技术获得3种结核分枝杆菌血清学抗原,可为结核病血清学诊断性抗原的选择进一步提供依据。     

结素蛋白多肽和微波技术在活动性结核病诊断中的意义

目的　探讨结素蛋白多肽抗原和微波辐射技术在诊断活动性结核的临床意义。方法 从结核菌标准株H37Rv培养物中提取结素蛋白多肽作抗原,进行微波辐射ELISA,检测活动性结核血清中结素蛋白多肽抗体水平。结果 126例活动性结核中114例呈阳性反应,76例健康人血清标本仅10例为阳性。其试验的灵敏性和特异性分别达到90.4%和86.8%。另外,微波ELISA耗时较常规法明显减少,但结果一致。结论 结素蛋白多肽抗原有较好的灵敏性和特异性,是ELISA的可靠抗原。微波ELISA可替代常规ELISA。     

结核分枝杆菌Rv2941蛋白抗原表位集中区免疫原性研究

目的 分析结核分枝杆菌Rv2941抗原的T细胞表位集中区的免疫原性,探究其作为结核病疫苗候选抗原的潜力。方法 通过免疫表位数据库(Immune Epitope Database,IEDB)分析Rv2941抗原的T细胞表位区(命名为Rv2941p)并构建表达载体PET32a-Rv2941p,诱导表达并纯化Rv2941p。将其与免疫佐剂二甲基三十六烷基铵(DDA)和PolyI:C乳化后,皮下免疫BALB/c小鼠3次,每次免疫间隔10 d,末次免疫1周后处死小鼠,进行免疫效果评价。采用ELISA法检测免疫后小鼠血清中IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度以及免疫后小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-4、IL-2、IL-6和IFN-γ的水平。同时,利用流式细胞技术检测淋巴细胞内CD4⁺T、CD8⁺T细胞增殖情况以及胞内细胞因子(IFN-γ、TNF-α和IL-4)表达水平。结果 Rv2941p可溶性表达,并获得高纯度的蛋白。Rv2941p诱导产生了高水平的特异性抗体IgG,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.001)。另外,Rv2941p提高了IgG2a/IgG1的比值。细胞因子检测结果显示,Rv2941p提高了IFN-γ和IL-6的分泌,与Ag85B组比较,差异有统计学意义(P<0.001)。同时,Rv2941p可以促进CD4⁺和CD8⁺T细胞的增殖分化,以及提高胞内IFN-γ和TNF-α的表达。结论 Rv2941p可以刺激小鼠产生较高的体液和细胞免疫,尤其Th-1类细胞免疫,可以作为结核病疫苗候选抗原,为结核病新型疫苗的开发奠定了基础。     

PCR-SSCP技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达。方法采用热启动聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白。结果经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0．6,IPTG终浓度为0．3 mmol／L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22．8％。结论构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础。     

Rv0220蛋白IFN-γ释放试验对结核潜伏感染的诊断价值研究

目的 探讨Rv0220蛋白γ-干扰素(IFN-γ)释放试验(IGRA)在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)潜伏性感染中的诊断价值。方法 使用目前IGRA广泛使用的ESAT-6、CFP-10、TB7.7三种刺激抗原作为参照,用Rv0220蛋白刺激112例新疆喀什结核病防治中心(肺核医院)健康体检外周血样本,分析Rv0220蛋白在IGRA时检测结核潜伏性感染的灵敏性与特异性。结果 Rv0220蛋白在刺激IFN-γ释放水平上与ESAT-6、CFP-10、TB7.7混合抗原刺激无显著性差异,以ESAT-6、CFP-10、TB7.7混合抗原检测结果为参照,Rv0220的蛋白检测临床样本的灵敏性与特异性分别为72.73%、100%,阳性预测值为72.73%,阴性预测值为40%。结论 Rv0220抗原蛋白在人结核病外周血IFN-γ体外释放实验中可作为刺激原,对于结核潜伏性感染具有较高的诊断价值。     

细粒棘球蚴特异性诊断抗原Eg-07279的制备及免疫原性研究

目的 筛选出包虫病特异性诊断抗原分子并验证其免疫原性。方法 对国家人类基因组南方研究中心公布的细粒棘球绦虫测序数据进行分析,利用生物信息学的方法筛选出六钩蚴中不表达且原头蚴中高表达的抗原分子Eg-07279,经重组克隆、表达后用亲和层析法纯化获得重组蛋白rEg-07279;重组蛋白免疫小鼠检测其特异性 IgG 水平并使用Western blot 验证其免疫原性。结果 筛选出的抗原分子Eg-07279经克隆、表达、纯化获得重组蛋白。利用该重组蛋白免疫小鼠,ELISA检测结果显示Eg-07279产生的特异性IgG水平(2.559 ± 0.125)明显高于空白组(0.319 0±0.01),差异有统计学意义(P<0.01);Western blot检测结果显示原头蚴继发感染组和重组蛋白免疫组血清均可识别该重组蛋白而空白对照组鼠血清不能识别。结论 获得细粒棘球蚴差异表达抗原Eg-07279并证实该重组蛋白具有较好的免疫原性,是较好的诊断抗原候选分子。     

结核分枝杆菌Rv0867c基因的克隆表达及其纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv0867c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rv0867c基因的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增目的基因片段;通过克隆载体pUC19构建质粒载体pUC19-Rv0867c,经序列测定证实正确,双酶切后连接于表达载体pPRO-EXHT,转化入大肠杆菌DH5α中,再经IPTG诱导表达带His标签的Rv0867c融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式。结果成功扩增出了结核分枝杆菌Rv0867c基因,构建了具有正确基因序列的表达载体pPRO-EXHT-Rv0867c,转化入大肠杆菌DH5α中,经诱导产生高水平的表达产物。经SDS分析,在80 kD处出现新生蛋白带,凝胶薄层扫描检测表达量约占菌体蛋白的23.7%。该融合蛋白以包涵体的形式存在,用Ni²⁺-NTA纯化柱在变性条件下进行纯化。结论成功克隆了结核分枝杆菌Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究Rv0867c基因蛋白的活性及其功能,以及结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv2660c蛋白原核重组表达及其免疫活性研究

目的利用原核表达系统表达、纯化结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv2660c,评价其在血清学方面用于结核病诊断的价值。方法合成Rv2660c全基因核酸序列,构建pET28a-Rv2660c融合表达载体,在原核系统内进行重组表达,亲和层析纯化重组Rv2660c蛋白,采用Western-Blot、ELISA实验分析重组蛋白的免疫反应。结果pET28a-Rv2660c在大肠杆菌内成功表达重组Rv2660c蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白分子量为10.2 KD,与预期一致,Western-Blot结果表明重组蛋白Rv2660c只能与活动性结核患者血清反应,出现一条杂交条带;ELISA结果发现重组Rv2660c蛋白与结核患者血清能产生较强的反应,结核病菌阳患者组、菌阴患者组、潜伏感染组以及健康对照组A450平均值分别为0.52、0.48、0.28和0.25。结论重组结核分枝杆菌Rv2660c蛋白具有一定的免疫原性,对活动性结核病的诊断具有一定的价值,但对结核分枝杆菌潜伏感染的诊断没有价值。     

结核分枝杆菌NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986的原核表达及检测牛结核病抗体之应用

目的 在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD2区域的NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986蛋白,并评价诊断牛结核病中的应用潜能。方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR 扩增nrdF1,pe_pgrs35,rv1985c 和 rv1986基因,并将其克隆到表达载体中,重组表达质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,镍柱亲和纯化重组蛋白,SDS-PAGE和Western blotting试验鉴定目的蛋白的表达及其反应原性。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法测定牛血清中特异性抗体,以之评价这些蛋白用于牛结核病抗体检测的价值。结果 成功表达了NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986蛋白,相对分子质量为42 ku、63 ku、46 ku和41 ku,对表达产物进行镍柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白。重组蛋白均能与抗HIS单抗发生特异反应,表现出良好的反应原性。通过间接ELISA方法检测牛血清中特异性抗体,阳性检出率分别为7.35%、22.06%、16.18% 和16.18%。结论 结核分枝杆菌原核表达的NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986蛋白具有用作牛结核病血清学诊断试剂的潜能。     

结核分枝杆菌耐异烟肼菌株与敏感菌株的比较蛋白质组学研究

目的研究结核分枝杆菌耐异烟肼菌株与敏感菌株间蛋白质表达的差异。方法应用双向电泳技术比较9株耐异烟肼菌株与7株敏感菌株的全菌蛋白表达图谱，采用基质辅助激光解吸及电离飞行时间质谱仪进行质谱分析，通过蛋白质数据库对耐药菌株和敏感菌株差异表达蛋白质相应的基因进行序列分析。结果耐异烟肼结核分枝杆菌中有20个蛋白质斑点表达量显著增加，质谱分析获得5个明确的肽质量指纹图谱，分别为Rv1446c、Rv3028c、Rv0491、Rv2971和Rv2145。结论差异表达蛋白的发现可能对新型抗结核药物靶点和耐异烟肼结核病诊断的分子标志物研究提供依据。     

Rv2653c在大肠埃希菌中的克隆与表达研究

目的从H37Rv标准株克隆出结核菌Rv2653c基因并进行表达与初步分析。方法根据H37Rv基因组序列合成引物,以PCR方法钓取Rv2653c基因,克隆到pGEM-T上,挑取阳性克隆进行测序,将正确编码基因克隆到pET24b载体上,在BL21大肠埃希菌菌株中以IPTG诱导表达重组蛋白。以金属螯合层析初步分离纯化重组蛋白,采用western blot方法对重组抗原进行抗原性初步分析。结果首先获得了重组的Rv2653c编码的蛋白,表达产率不低于20%,初步纯化纯度约90%,以人血清进行的western blot分析发现,Rv2653c重组蛋白有较好的抗原性。结论获得了Rv2653c重组蛋白为进一步寻探讨其功能及应用价值奠定基础。     

结核分枝杆菌Rv2352c基因的克隆表达及其抗原活性鉴定

目的构建含结核分枝杆菌(M.tb)rv2352c基因原核表达载体,经转化E.coli以表达Rv2352c融合蛋白,并研究其抗原性。方法用PCR扩增M.tb rv2352c基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv2352c重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导Rv2352c蛋白表达。经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE和结核患者血清Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,制备抗Rv2352c抗血清,抗血清的效价测定采用酶联免疫吸附试验法(ELISA),取兔抗血清与纯化蛋白Rv2352c通过Western blot方法,检测抗体特异性。结果经酶切鉴定和测序分析证实rv2352c原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在45 kD处呈现单一蛋白条带。用重组蛋白Rv2352c免疫接种后可诱导出高滴度的特异性抗体。纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv2352c,制备和纯化的Rv2352c融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,为进一步研究结核病的潜在分子标志物奠定基础。     

T cell responses to DosR and Rpf proteins in actively and latently infected individuals from Colombia

Mycobacterium tuberculosis DosR regulon-encoded proteins elicit strong immune T-cell responses in individuals with latent tuberculosis (LTBI). Also, resuscitation (Rpf) proteins can induce such responses. However, variations in the immunogenicity of the DosR and Rpf proteins have been observed in European and African populations, and no data are published from other geographic areas. In Colombian LTBI and patients with recently diagnosed PTB, we therefore studied the immune response to DosR, Rpf, stress, and nominal antigens from Mtb, in 7-day stimulated cultures. Three DosR (Rv1737c, Rv2029c, Rv2628c) and 2 Rpf (Rv0867 and Rv2389c) antigens were recognized most prominently on the basis of the net IFNγ production (DosR) or the percentage of responding individuals (Rpf). Results show that the selected DosR antigens induced a higher proportion of CD4-T cells producing IFNγ from LTBI, compared to pulmonary TB patients (PTB), while there were no differences in the proportion of CD8-T cells. An increased frequency of CD4, but not CD8 T-cells with a CD45RO(+)CD27(+) phenotype was observed in LTBI in response to Rv2029c, Rv0867c, and Rv2389c, compared to PTB. The levels of cytokines and chemokines in the supernatants of stimulated cells, showed that the DosR and Rpf antigens induced higher levels of IFNγ in cultures from LTBI compared to PTB, although the induced pattern of cytokines and chemokines was also antigen dependent. In summary, our results are consistent with the significant immunogenicity of Mtb DosR and Rpf antigens in LTBI individuals, and confirm and extend previously reported data from other TB affected human populations.     

结核分枝杆菌RpfA融合蛋白的免疫学和生物学特性的初步研究

目的在大肠杆菌中表达并纯化结核分枝杆菌RpfA融合蛋白,并初步研究其免疫学和生物学特性。方法Rp-fA融合蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果。分离小鼠的脾淋巴细胞,MTT法检测淋巴细胞增殖指数,ELISA法检测培养液上清IFN-γ,IL-2含量;MTBH37Rv毒株静脉感染免疫小鼠,测定脾脏细菌负荷。将不同浓度的复性RpfA融合蛋白和特异性多抗加入到MTBH37Ra中,测定H37Ra的生长曲线。结果RpfA融合蛋白免疫小鼠的脾淋巴细胞的增殖指数达到3.57,高于生理盐水对照组的1.27(P<0.05);培养上清中IFN-γ含量为362.99±72.75ng/L,IL-2含量为210.10±20.19ng/L,而生理盐水对照组含量均低于50ng/L(P<0.05)。免疫小鼠脾脏细菌负荷计数为5.57±0.37(log10CFU±S),而生理盐水对照组为6.54±0.22(P<0.05)。RpfA融合蛋白对H37Ra的生长有明显促进作用,而加入特异性多抗后可以抑制RpfA融合蛋白的促生长作用。结论RpfA融合蛋白免疫小鼠可引起体液免疫和保护性细胞免疫,可能作为基因疫苗的候选组分。RpfA融合蛋白对H37Ra生长有明显的刺激作用,可能作为快速培养检验结核分枝杆菌的添加组分。